JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

للتحليل الميكانيكي المتعمق للفيروس التزامني التنفسي (RSV) تخليق الحمض النووي الريبي ، نبلغ عن بروتوكول لاستخدام فوسفوبروتين الفوسفورتين المرافق (P) للكوادر الخالية من الحمض النووي الريبي (N0)للتجميع المختبري اللاحق للنيوكليوكابسيدات الخاصة بالفيروس (NCs).

Abstract

استخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة أمر بالغ الأهمية لتعزيز المعرفة الأساسية لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية التي يمكن أن توجه كل من اكتشاف ميكانيكي وتطوير المقايسة في علم الفيروسات. إن نموذج الحمض النووي الريبي لفيروسات الحمض النووي الريبي غير المخلوقة (NNS) من فيروسات الحمض النووي الريبي (NNS)، مثل فيروس التزامن التنفسي (RSV)، ليس جزيء الحمض النووي الريبي وحده، بل هو مركب الريبونوكليوبروتين (N) المنقوع. على الرغم من أهمية قالب الحمض النووي الريبي الأصيل ، فإن توليد وتجميع مثل هذا المجمع ريبونوكليوبوبروتين لا تزال متطورة وتتطلب توضيحا متعمقا. التحدي الرئيسي هو أن RSV N مفرط التعبير يربط بشكل غير محدد بالرنانات الخلوية لتشكيل جزيئات عشوائية تشبه النيوكليوكابسيد (NCLPs). هنا، أنشأنا بروتوكولا للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي (N0)أولا من خلال المشاركة في التعبير N مع فوسفوبروتين مرافق (P)، ثم تجميع N0 مع أوليغوس الحمض النووي الريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي RSV محددة للحصول على نواة خاصة بالفيروسات (NCs). يوضح هذا البروتوكول كيفية التغلب على صعوبة في إعداد هذا المعقد ribonucleoprotein الفيروسية الصعبة تقليديا.

Introduction

غير الفئات السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تشمل العديد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، مثل داء الكلب، والإيبولا، وفيروس التزامن التنفسي (RSV)1،2. RSV هو السبب الرئيسي لأمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب القصيبات والالتهاب الرئوي في الأطفال الصغار وكبار السن في جميع أنحاء العالم3. حاليا، لا توجد لقاحات فعالة أو علاجات مضادة للفيروسات المتاحة لمنع أو علاج RSV4. كجزء من دورة الحياة، يعمل جينوم RSV كنموذج للنسخ المتماثل من قبل بوليمرات الحمض النووي الريبي التابع ل RSV لإنتاج مستضد، والذي بدوره يعمل كنموذج لتوليد جينوم ذري. يتم كذلك تحلل كل من الجينوم والرنانات المضادة للجينوم بالكامل بواسطة النوى (N) لتشكيل النيوكليوكابسيدات (NCs)3. لأن NCs بمثابة قوالب لكل من النسخ المتماثل والنسخ من قبل بوليمراز RSV، التجمع NC السليم أمر بالغ الأهمية للبوليميراز للوصول إلى قوالب لتخليق الحمض النووي الريبي5. ومن المثير للاهتمام، استنادا إلى التحليلات الهيكلية للبوليميرا الفيروسية NNS، فمن المفترض أن العديد من البروتينات N ينفصم عابرا من NCs للسماح بالوصول إلى البوليميراز وإعادة ربط إلى الجيش الملكي النيبالي بعد تخليق الحمض النووي الريبي6،7،8،9،10،12.

حاليا، وقد أنشئت RSV الحمض النووي الريبي البلمرة المقايسة باستخدام البوليمرات RSV تنقية على قوالب الجيش الملكي النيبالي عارية قصيرة13،14. ومع ذلك، فإن أنشطة البوليميراز RSV لا تصل إلى المستوى الأمثل، كما لوحظ في المنتجات غير المعالجة والإجهاضية التي تولدها بوليمرات RSV عند استخدام قوالب الحمض النووي الريبي العارية. عدم وجود NC مع الحمض النووي الريبي فيروس محددة هو الحاجز الرئيسي لمزيد من الفهم الآلي لتوليف الحمض النووي الريبي RSV. ولذلك، باستخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة يصبح حاجة ماسة لتعزيز المعرفة الأساسية من تخليق الحمض النووي الريبي RSV. الهياكل المعروفة للجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLPs) من RSV وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي NNS تكشف عن أن الحمض النووي الريبي في NCLPs هي إما الحمض النووي الريبي الخلوي العشوائي أو متوسط الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي15،16،17،18،19. معا، العقبة الرئيسية هي أن N يربط بشكل غير محدد إلى RNAs الخلوية لتشكيل NCLPs عندما يتم التعبير عن N في الخلايا المضيفة.

للتغلب على هذه العقبة، أنشأنا بروتوكولا للحصول على RNA خالية (N0)أولا وتجميع N0 مع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسية الأصيلة في NCLPs20. مبدأ هذا البروتوكول هو الحصول على كمية كبيرة من N RNA خالية من المؤتلف (N0)من خلال التعبير المشترك N مع مرافق, المجال N-محطة من فوسفوبروتين RSV (PNTD). يمكن تحفيز N0P المنقى وتجميعه في NCLPs عن طريق إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي الخاص ب RSV ، وخلال عملية التجميع ، يتم إزاحة المرافق PNTD عند إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي.

هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لتوليد وتجميع NCs RSV RNA محددة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الاستنساخ الجزيئي، وإعداد البروتين، والتجميع في المختبر، والتحقق من صحة التجميع المعقد. ونسلط الضوء على استراتيجية الاستنساخ لتوليد بنى ثنائية السيسترونيك للكراز المشترك للبروتين للاستنساخ الجزيئي. لإعداد البروتين، ونحن نصف إجراءات زراعة الخلايا، واستخراج البروتين، وتنقية مجمع البروتين. ثم نناقش طريقة التجميع في المختبر من NCs RSV RNA محددة. وأخيرا، نستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والمجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) لتوصيف وتصور NCLPs المجمعة.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي

ملاحظة: تم استخدام ليجاس الاستنساخ المستقل (LIC) لجعل RSV ثنائي cistronic coexpression بناء البلازميد. LIC هو أسلوب وضعت في أوائل 1990s، والذي يستخدم النشاط إكسو 3'-5 'من بوليمرات الحمض النووي T4 لخلق يتدلى مع التكامل بين ناقلات وإدراج الحمض النووي21،22. تم إجراء البنى باستخدام الحمض النووي الناقل 2BT-10 ، والذي يتكون من علامة 10x في N-terminal من إطار القراءة المفتوحة (ORF) (الشكل 1).

  1. تنفيذ linearization من ناقلات LIC باستخدام الهضم SSPI.
    1. الجمع بين 10 ميكرولتر من العازلة SSPI 10X، 4 ميكرولتر من إنزيم SSPI بتركيز 5 U/μL، وحجم يعادل 5 ميكروغرام من الحمض النووي مينيبريب ناقلات، وddHعقيمة 2O إلى 100 ميكرولتر.
    2. احتضان هضم لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية.
    3. تشغيل هضم على هلام agarose 1.0٪ لاستخراج الحمض النووي ناقلات.
    4. استخدام مجموعة استخراج هلام لأداء استخراج وتنقية. تعليق الحجم النهائي للحمض النووي المتجه في 30 ميكرولتر من ddH2O وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  2. إعداد إدراج الحمض النووي لN1-391 وP1-126 باستخدام التمهيدي N1-391 إلى الأمام، N1-391 التمهيدي العكسي، P1-126 التمهيدي إلى الأمام، وP1-126 التمهيدي العكسي(الجدول 1).
    ملاحظة: هناك تداخل كاف مع المتجه الخطي لضمان درجة حرارة ذوبان تتراوح بين 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية. بالنسبة لللتمهيد العكسي، هناك تداخل كاف مع الخيط التكميلي العكسي للمتجه الخطي لنفس السبب.
    1. إجراء تضخيم PCR لإدراج الحمض النووي باستخدام الشروط في الجدول 2 والجدول 3.
    2. استخراج إدراج الحمض النووي تضخيمها. تشغيل منتجات PCR من الخطوة السابقة على هلام agarose 1.0٪، ثم استخراج وتنقية العصابات عن طريق استخراج هلام. تعليق الحجم النهائي للحمض النووي المستخرج في 15 ميكرولتر من ddH2O.
  3. T4 معالجة بوليمرات الحمض النووي من ناقلات وإدراج الحمض النووي (الجدول 4).
    ملاحظة: يجب إجراء العلاج بشكل منفصل للحمض النووي الناقل وإدراج الحمض النووي.
    1. احتضان الخليط لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، الحرارة تعطيل البوليميراز في 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تخزين خليط التفاعل في -20 درجة مئوية.
  4. أنال متجه LIC و متجه الإدراج.
    1. إعداد التحكم السلبي مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي ناقلات LIC و 2 ميكرولتر من ddH2O العقيمة.
    2. الجمع بين 2 ميكرولتر من إدراج الحمض النووي و 2 ميكرولتر من الحمض النووي ناقلات LIC من تفاعلات بوليمرات الحمض النووي T4 السابقة في أنبوب 0.2 مل.
    3. قم بإجراء رد فعل التلهين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    4. إخماد رد الفعل مع 1.3 ميكرولتر من EDTA بتركيز 25 mM.
    5. تحويل رد الفعل إلى 100 ميكرولتر من E. coli Top10 الخلايا المختصة ولوح لهم على لوحة اختيار أمبيسلين23،24.
  5. تحديد البنى الإيجابية.
    1. إعداد محلول البلازميد miniprep. ويمكن القيام بذلك من خلال التقاط مستعمرة والتلقيح في وسائل الإعلام LB. عادة، 3 مستعمرات كافية.
    2. احتضان الخليط بين عشية وضحاها في 37 °C.
    3. طارد مركزي الخليط في 4560 × ز لمدة 10 دقائق والتخلص من supernatant.
    4. Resuspend الكريات في 250 ميكرولتر من العازلة P1 وإعداد الهياكل المصغرة البلازميد باستخدام مجموعة miniprep تدور.
    5. إجراء تحليل الهضم للمنتج miniprep باستخدام AseI أو غيرها من الإنزيمات تقييد.
    6. تحميل العينات على هلام agarose 0.8٪ وتشغيل البلازميد المهضوم. تحليل هلام تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
    7. استخدم خدمة تسلسل للتحقق من تسلسل المنتج الموجب.
  6. الحصول على إدراج الحمض النووي coexpression.
    1. تنفيذ PCR للحصول على N1-391 وP1-126 باستخدام 2BT-10 N1-391 و 2BT-10 P1-126 قوالب.
    2. تنفيذ 1ST PCR للحصول على N1-391 من بناء 2BT-10 N1-391 باستخدام شروط PCR في الجدول 2 والجدول 3 مع التمهيدي N1-391 إلى الأمام وعكس التمهيدي 5 '-GTGAAGACTCTCTGGCAATGCGGCG
      CGGCGGATCGCGGATCC-3
    3. تنفيذ 2ND PCR للحصول على P1-126 من بناء 2BT-10 P1-126 باستخدام التمهيدي الأمامي: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGGGGATCTCTACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 وP1-126 التمهيدي العكسي (استخدام شروط PCR في الجدول 2 والجدول 3).
    4. وأخيرا، أداء تداخل PCR على المنتجات المختلطة من ردود الفعل PCR 2 السابقة لدمج N1-391 وP1-126. استخدام التمهيدي N1-391 إلى الأمام وP1-126 التمهيدي العكسي. استخدم شروط PCR في الجدول 5 والجدول 6.
  7. انضم إلى المتجه وإدراج الحمض النووي.
    1. علاج تداخل PCR المنتج مع T4 الحمض النووي بوليمرات بعد البروتوكول في الخطوة 1.3.
    2. آنال متجه LIC ومنتج PCR باتباع البروتوكول في الخطوة 1.4.
    3. تحديد بنيات موجبة التالية البروتوكول في الخطوة 1.5.

2. التعبير عن البروتين وتنقية

ملاحظة: استخدام الإشريكية القولونية لبناء ثنائي cistronic من coexpression من كل من N و P. الثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، ولكن تنفيذ التعبير في درجة حرارة منخفضة (16 درجة مئوية) بين عشية وضحاها. تنقية مجمعات البروتين من خلال مزيج من عمود الكوبالت، وتبادل الأيونات، وحجم اللونية استبعاد (الشكل 2).

  1. استخدم سلالة E. coli BL21 (DE3) لإنتاج البروتين. تنمو 4 لتر ثقافات الخلية في 37 درجة مئوية في LB (لوريا مرق) المتوسطة حتى OD600 تصل إلى 0.6.
  2. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية. بعد ساعة، حث التعبير مع 0.5 mM ايزوبروبيل 1-ثيو - D-galactopyranoside (IPTG) بين عشية وضحاها.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 4104 × ز لمدة 25 دقيقة ومن ثم التخلص من supernatant.
  4. Resuspend الكريات الخلية في 200 مل من تحلل العازلة A (50 م فوسفات الصوديوم, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 10٪ الجلسرين, و 0.2٪ NP40). استخدام 50 مل من العازلة تحلل لإعادة إنفاق الكريات الخلية من 1 لتر من ثقافة الخلية.
  5. Lyse الخلايا عن طريق سونيكيشن لمدة 15 دقيقة، 3 ثوان على، و 3 ثوان قبالة. ثم خلايا الطرد المركزي في 37,888 x g لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تجميد الخلايا قبل صوتنة في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  6. تحميل supernatant في عمود الجاذبية الكوبالت (قطر × طول: 2.5 سم × 10 سم) مع ~ 10mL من الخرز قبل equilibrated مع 5-10 أحجام العمود (CV) من العازلة تحلل.
  7. غسل العمود مع 5 السيرة الذاتية من العازلة B (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10٪ الجلسرين, و 5 mM imidazole) و 5 السيرة الذاتية من العازلة C (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10٪ الجلسرين, و 5 mm imidazole).
  8. Elute البروتين من الخرز باستخدام 2 السيرة الذاتية من D العازلة (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, و 250 mM imidazole).
  9. تمييع البروتين الملتح 5x مع العازلة QA (50 mM تريس-HCl pH 8.0, 5٪ الجلسرين) لعمود Q.
  10. اغسل عمود Q الذي تبلغ مساحته 5 مل باستخدام المخزن المؤقت QA لموازنة العمود، ثم قم بتحميل العينة المخففة في عمود Q باستخدام المضخة العسيرة (مثل الأرنب).
  11. تحميل العمود Q في الجهاز HPLC جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت QA و QB المخزن المؤقت (50 mM تريس-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5٪ glycerol). إعداد معدل التدفق على أنه 1 مل/دقيقة.
  12. تشغيل برنامج "غسل مضخة" لغسل الجهاز مع المخزن المؤقت QB متبوعا المخزن المؤقت QA (1-2 السير الذاتية / كل). تعيين تدفق النظام إلى 3 مل/دقيقة.
  13. تعيين UV1 إلى 280 نانومتر وUV2 إلى 260 نانومتر. استخدام لوحة 96 بئر عميق لجمع الكسور.
  14. البروتينات Elute باستخدام تدرج تدريجي من عامل elution (QB العازلة) تطبيق السيرة الذاتية 3-4 من كل تركيز، وزيادة النسبة المئوية بنسبة 5٪ في كل مرة تبدأ من 0٪ QB. N0P بروتين مجمع سوف يخرج في 15٪ QB العازلة.
  15. مرة واحدة يتم يسل كل من البروتين، وغسل العمود مع 100٪ QB العازلة (2 CV).
  16. عزل البروتين بواسطة هلام الترشيح Superdex 200 زيادة 10/300 GL العمود (قطر × طول: 1.0 سم × 30 سم) والاعتدال مع العازلة E (20 mM HEPES pH 7.4 و 200 mM NaCl).
  17. تحليل الكسور المحتوية على البروتين بواسطة SDS-PAGE.

3. في التجمع المختبري من NC الفيروسات محددة

ملاحظة: تم تنفيذ التجميع في المختبر من NC RSV محددة (N:RNA) من خلال احتضان مجمع N0P المعدة مع أوليغوس الجيش الملكي النيبالي. ثم، تم استخدام الكروماتوغرافيا SEC لفصل مجمع التجميع من N0P والحمض النووي الريبي الزائد(الشكل 2).

  1. مزيج واحتضان منقى N0P مجمع مع RNA oligo مع النسبة الجزيئية من 1:1.5 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة, عادة 1 مل من البروتين N0P مع تركيز 1 ملغم / مل يكفي للخطوة التالية. إعداد عينة التحكم، والتي تحتوي فقط على نفس الكمية من البروتين N0P.
  2. قبل equilibrate جل الترشيح Superdex 200 زيادة 10/300 GL العمود مع E العازلة (20 م م HEPES، pH 7.4، 200 M M NaCl).
  3. طرد مركزي العينة مع 21,130 x g لمدة 15 دقيقة, إزالة أي هطول الأمطار وتحميل supernatant إلى العمود لجنة الأوراق المالية والبورصة.
  4. قارن الصور الكروماتوغرافية SEC من عينة تجميع N:RNA وعينة التحكم N0P ، والجمع بين نسبة A260/ A280 لتحديد القمم التي هي N-RNA المجمعة ، N0P ، والجيش الملكي النيبالي المجاني.
  5. جمع الكسور الذروة، تشغيل هلام SDS-PAGE، أو جعل الشبكات.
  6. للجمعية N-RNA المعقدة، وجمع جميع الكسور من ذروة ن-الجيش الملكي النيبالي، لا استخراج الجيش الملكي النيبالي وتشغيل هلام Urea-PAGE للتحقق مرتين من طول الحمض النووي الريبي محددة، وهو نفس مختلطة واحتضانها في الخطوة الأولى.

4. جعل شبكات بقع سلبية

ملاحظة: المجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) هو طريقة يتم فيها امتزاز الجزيئات إلى فيلم كربوني ثم تضمينها في طبقة من ذرات المعادن الثقيلة. السلبي وصمة عار EM تنتج تباين صورة عالية، مما يجعل من السهل أن نرى ومحاذاة حسابيا الجسيمات. ميزة أخرى هي أن الامتزاز للجسيمات إلى فيلم الكربون عادة ما يحفز الجزيئات على الالتزام بالشبكة مع عدد قليل من التوجهات المفضلة. عندما تكون الجزيئات في اتجاه مماثل ، فمن السهل فصلها إلى فئات متميزة هيكليا. وصمة عار سلبية EM وبالتالي الأسلوب المناسب لتوجيه إعداد عينة25،26 ( الشكل3).

  1. الميكروويف أو الحرارة 5 مل من ddH2O في كوب زجاجي صغير باستخدام سخان التنغستن حتى يغلي.
  2. وزن 37.5 ملغ من أورانيل formate وإضافة إلى 5 مل من DDHساخنة 2O لجعل محلول تلطيخ أورانيل 0.75٪. اثارة تحت رقائق الألومنيوم غطت الكأس للحماية من الضوء.
  3. أضف 4 ميكرولتر من 10 M NaOH إلى محلول التلطيخ و استمر في التقليب لمدة 15 دقيقة ، محمية من الضوء.
  4. قم بتصفية الحل من خلال فلتر 0.22 مم في أنبوب اختبار.
  5. استخدام توهج التفريغ لجعل شبكات EM المغلفة بالكربون المستمر hydrophilic27.
    ملاحظة: يتم وضع الشبكات داخل غرفة متصلة بإمدادات الطاقة. عندما يتم تطبيق الجهد العالي، والغاز داخل الغرفة يأين، وترسب الأيونات المشحونة سلبا على شبكات الكربون لجعلها هيدروفيلي.
  6. قطع وأضعاف شريط بارا فيلم. Pipet 2 قطرات من 40 ميكرولتر من العازلة على جانب واحد من البارافيلم، وماصة أخرى 2 قطرات من 40 ميكرولتر من محلول تلطيخ إلى الجانب الآخر.
  7. لجعل شبكات الكربون EM، وتطبيق 3 ميكرولتر من عينة البروتين لمدة 1 دقيقة.
  8. لطخ الشبكات مقابل ورقة النشاف.
    ملاحظة: يتم غسل الشبكات 2x مع المخزن المؤقت، و 1x مع محلول تلطيخ أورانيل 0.75٪ تلطيخ بعد كل خطوة.
  9. عقد سطح الشبكة في الانخفاض الثاني من 0.75٪ محلول تلطيخ أورانيل formate لمدة 30 ثانية.
  10. لطخ الشبكة ضد ورقة النشاف لإزالة محلول البقع الزائدة والسماح للشبكة بتجفيف الهواء.
  11. تخزين الشبكات في مربع الشبكة قبل التصوير.

النتائج

تنقية بروتين N0P الخالي من الحمض النووي الريبي
مع هذا البروتوكول، يمكن الحصول على مركب RSV N0P القابل للذوبان على نطاق واسع. تم التعبير عن الطول الكامل للجزء N و N النهائي من بروتينات P مع 10X His-Tag على بروتين N في الإشريكية القولونية. تم تنقية N0P باستخدام عمود الكوب?...

Discussion

الجسيمات المعروفة الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLP) هياكل غير المقوسة السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تبين أن NCLPs تجميعها هي N معقدة مع الحمض النووي الريبي الخلوي المضيف عندما مفرط في التعبير في أنظمة التعبير البكتيرية أو eukaryotic15,16,

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

ويدعم البرامج البحثية في مختبر ليانغ في إيموري المعهد الوطني الأمريكي للعلوم الطبية العامة (NIGMS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM130950، وصندوق بدء البحث في كلية الطب بجامعة إيموري. ويعترف صاحب البلاغ بأعضاء مختبر ليانغ للدعم المفيد والمناقشة النقدية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSIgmaA9539-500Gmaking construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitMilliporeUFC901024concentrate the protein sample
Ampicillin sodiumGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317Aantibiotic for cell culture
AseINEBR0526Smaking construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose BeadsGold BioH-310-500For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBHeate the sample
dCTPInvitrogen10217016making construct using LIC method
dGTPInvitrogen10218014making construct using LIC method
GlycerolSigmaG5516-4Lmaking solution
HEPESSigmaH3375-100Gmaking solution
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Protein purification
ImidazoleSigmaI5513-100Gmaking solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Ainduce the expression of protein
Microcentrifuge TubesVWR47730-598for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid ProcessorSpectraLabMSX-XL-2020sonicator for lysing cell
Negative stain gridsElectron Microscopy SciencesCF400-Cu-THFor making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 SubstituteSigma74385-1Lmaking solution
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706Purify DNA
SSPI-HFNEBR3132Smaking construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Protein purification
T4 DNA polymeraseSigma70099-3making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus CentrifugeFisher Scientific36-101-0816Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochlorideSigmaT3253-250Gmaking solution
Uranyl FormateElectron Microscopy Sciences22451making negative stain solution

References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 RSV NC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved