Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

Resumen

Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N⁰⁾para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).

Resumen

El uso de una plantilla de ARN auténtica es fundamental para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN viral que puede guiar tanto el descubrimiento mecanicista como el desarrollo de ensayos en virología. La plantilla del ARN de los virus nonsegmented del ARN del negativo-sentido (NNS), tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), no es una molécula del ARN solamente sino algo un complejo encapsidated de la ribonucleoprotein de la nucleoproteína (N). A pesar de la importancia de la plantilla auténtica del ARN, la generación y el montaje de tal complejo del ribonucleoprotein siguen siendo sofisticados y requieren la aclaración profundizada. El principal desafío es que el RSV N sobreexpresado se une no específicamente a los ARN celulares para formar partículas aleatorias similares a nucleocáps (NCLPs). Aquí, establecimos un protocolo para obtener N libre de ARN (N⁰⁾primero co-expresando N con una fosfoproteína chaperona (P), luego ensamblando N⁰ con oligos de ARN con la secuencia de ARN específica del RSV para obtener nucleocápsides específicas del virus (NCs). Este protocolo muestra cómo superar la dificultad en la preparación de este complejo viral tradicionalmente desafiando del ribonucleoprotein.

Introducción

Los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) incluyen muchos patógenos humanos significativos, como la rabia, el ébola y el virus sincitial respiratorio (RSV)^1,2. El RSV es la principal causa de enfermedades respiratorias como la bronquiolitis y la neumonía en niños pequeños y adultos mayores en todo el mundo³. Actualmente, no hay vacunas efectivas o terapias antivirales disponibles para prevenir o tratar el RSV^4. Como parte del ciclo de vida, el genoma del RSV sirve como la plantilla para la replicación por la ARN polimerasa dependiente del ARN del RSV para producir un antigenoma, que a su vez actúa como la plantilla para generar un genoma de progenie. Tanto el genoma como el antigenoma RNAs son totalmente encapsidados por la nucleoproteína (N) para formar las nucleocápsides (NCs)³. Debido a que los CN sirven como plantillas tanto para la replicación como para la transcripción por la ARSV polimerasa, el ensamblaje adecuado de NC es crucial para que la polimerasa obtenga acceso a las plantillas para la síntesis de ARN^5. Curiosamente, basándose en los análisis estructurales de las polimerasas virales NNS, se presume que varias proteínas N se disocian transitoriamente de las NCs para permitir el acceso de la polimerasa y reenlazarse al ARN después de la síntesis de ARN^{6,7,8,9,10,11,12.}

Actualmente, el ensayo de polimerización de ARN del RSV se ha establecido utilizando la polimerasa purificada del RSV en plantillas cortas de ARN desnudo^13,14. Sin embargo, las actividades de la RSV polimerasa no alcanzan el óptimo, como se observa en los productos no procesivos y abortivos generados por la RSV polimerasa cuando se utilizan plantillas de ARN desnudo. La carencia del NC con el ARN virus-específico es una barrera primaria para la comprensión mecanicista adicional de la síntesis del ARN de RSV. Por lo tanto, el uso de una plantilla de ARN auténtica se convierte en una necesidad crítica para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN del RSV. Las estructuras conocidas de las partículas similares a nucleocáps (NCLPs) del RSV y otros virus de ARN del NNS revelan que los ARN en los NCLPs son ARN celulares aleatorios o ARN genómicos virales promedio^{15,16,17,18,19.} Juntos, el principal obstáculo es que N se une no específicamente a los RNAs celulares para formar NCLPs cuando N se sobreexpresa en las células huésped.

Para superar este obstáculo, establecimos un protocolo para obtener primero RNA-libre (N⁰⁾y ensamblar N⁰ con ARN genómico viral auténtico en NCLPs^20. El principio de este protocolo es obtener una gran cantidad de N libre de ARN recombinante (N⁰⁾coexpresando N con una chaperona, el dominio N-terminal de la fosfoproteína del VSR (P_NTD). El N⁰P purificado podría ser estimulado y ensamblado en NCLPs mediante la adición de oligos de ARN específicos del RSV, y durante el proceso de ensamblaje, la chaperona P_NTD se desplaza tras la adición de oligos de ARN.

Aquí, detallamos un protocolo para la generación y el montaje de RSV ARN-específico NCs. En este protocolo, se describe la clonación molecular, la preparación de proteínas, el ensamblaje in vitro y la validación del ensamblaje complejo. Destacamos la estrategia de clonación para generar construcciones bi-cistrónicas para la coexpresión de proteínas para la clonación molecular. Para la preparación de proteínas, se describen los procedimientos de cultivo celular, extracción de proteínas, y la purificación del complejo proteico. A continuación, discutimos el método para el montaje in vitro de los NCs específicos de ARN del RSV. Finalmente, utilizamos la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la microscopía electrónica de manchas negativas (EM) para caracterizar y visualizar los NCLPs ensamblados.

Protocolo

1. Clonación molecular

NOTA: La clonación independiente de ligasa (LIC) se utilizó para hacer un plásmido de construcción de coexpresión bi-cistrónica del VSR. LIC es un método desarrollado a principios de la década de 1990, que utiliza la actividad 3'-5' Exo de la ADN polimerasa T4 para crear voladizos con complementariedad entre el vector y el inserto de ADN^21,22. Las construcciones se realizaron utilizando el VECTOR 2BT-10 de ADN, que consiste en una etiqueta 10x His en el N-terminal del Open Reading Frame (ORF)(Figura 1).

1. Realizar la linealización de vectores LIC utilizando la digestión SSPI.
   1. Combine 10 μL de tampón SSPI 10X, 4 μL de enzima SSPI a una concentración de 5 U/μL, el volumen equivalente de 5 μg de ADN de minipreparación vectorial y ddH estéril_{de 2}O a 100 μL.
   2. Incubar el digesto durante 3 horas a 37 °C.
   3. Ejecute el resumen en un gel de agarosa al 1.0% para la extracción de ADN vectorial.
   4. Utilice un kit de extracción de gel para realizar la extracción y purificación. Suspenda el volumen final de ADN vectorial en 30 μL de ddH₂O y guárdelo a -20 °C.
2. Prepare los insertos de ADN para N_1-391 y P_1-126 utilizando el cebador delantero N_1-391, el cebador inverso N_1-391, el cebador inverso P_1-126 y el cebador inverso P_1-126 (Tabla 1).
   NOTA: Hay suficiente superposición con el vector linealizado para asegurar una temperatura de fusión de entre 55 °C y 60 °C. Para el cebador inverso, hay suficiente superposición con la hebra complementaria inversa del vector linealizado por la misma razón.
   1. Realizar la amplificación por PCR del inserto de ADN utilizando las condiciones de la Tabla 2 y la Tabla 3.
   2. Extraiga el inserto de ADN amplificado. Ejecute los productos de PCR del paso anterior en un gel de agarosa al 1.0%, luego extraiga y purifique las bandas mediante extracción de gel. Suspender el volumen final de ADN extraído en 15 μL de ddH₂O.
3. T4 ADN polimerasa tratamiento del vector y el inserto de ADN (Tabla 4).
   NOTA: El tratamiento debe realizarse por separado para el ADN vectorial y el ADN inserto.
   1. Incubar la mezcla durante 40 minutos a temperatura ambiente. Luego, inactivar térmicamente la polimerasa a 75 °C durante 20 minutos. Guarde la mezcla de reacción a -20 °C.
4. Recocido el vector LIC y el vector de inserción.
   1. Establecer un control negativo con 2 μL de ADN vectorial LIC y 2 μL de ddH_{estéril 2}O.
   2. Combine 2 μL de ADN de inserción y 2 μL de ADN vectorial LIC de las reacciones anteriores de la ADN polimerasa T4 en un tubo de 0,2 mL.
   3. Realice la reacción de recocido a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   4. Apaje la reacción con 1,3 μL de EDTA a una concentración de 25 mM.
   5. Transformar la reacción en 100 μL de células competentes de E. coli Top10 y platearlas en una placa de selección de ampicilina^23,24.
5. Identificar las construcciones positivas.
   1. Prepare la solución de miniprep del plásmido. Esto se puede hacer a través de la recolección de colonias y la inoculación en medios LB. Por lo general, 3 colonias son suficientes.
   2. Incubar la mezcla durante la noche a 37 °C.
   3. Centrifugar la mezcla a 4.560 x g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante.
   4. Resuspend los pellets en 250 μL de tampón P1 y prepare minipreps de plásmido usando un kit de miniprep de espín.
   5. Realice un análisis de digestión del producto miniprep usando AseI u otras enzimas de restricción.
   6. Cargue las muestras en gel de agarosa al 0,8% y ejecute el plásmido digerido. Analice el gel bajo una lámpara UV.
   7. Utilice un servicio de secuenciación para validar la secuencia del producto positivo.
6. Obtenga el inserto de ADN de coexpresión.
   1. Realizar PCR para obtener N_1-391 y P_1-126 utilizando como plantillas los 2BT-10 N_1-391 y 2BT-10 P_1-126 previamente construidos.
   2. Realizar la^1ª PCR para obtener N_1-391 a partir de la construcción 2BT-10 N_1-391 utilizando las condiciones de PCR de la Tabla 2 y tabla 3 con la N_1-391 Imprimación directa y la Imprimación inversa 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGCAATGCGGCGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. Realizar la^2ª PCR para obtener P_1-126 de la construcción 2BT-10 P_1-126 utilizando el cebador Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́y el cebador inverso P_1-126 (utilice las condiciones de PCR de la Tabla 2 y la Tabla 3).
   4. Finalmente, realizar pcr superposición en los productos mixtos de las 2 reacciones de PCR anteriores para fusionar_N1-391 y P_1-126. Utilice el cebador delantero N_1-391 y el cebador inverso P_1-126. Utilice las condiciones de PCR de la Tabla 5 y la Tabla 6.
7. Unir el vector y el inserto de ADN.
   1. Trate el producto de PCR superposición con ADN polimerasa T4 siguiendo el protocolo del paso 1.3.
   2. Recocido del vector LIC y producto de PCR siguiendo el protocolo del paso 1.4.
   3. Identifique las construcciones positivas que siguen el protocolo en el paso 1.5.

2. Expresión y purificación de proteínas

NOTA: Utilice E. coli para la construcción bi-cistrónica de la coexpresión de N y P. Cultivo de las células a 37 °C, pero llevar a cabo la expresión a una temperatura reducida (16 °C) durante la noche. Purificar los complejos proteicos a través de una combinación de columna de cobalto, intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2).

1. Utilice la cepa E. coli BL21(DE3) para la producción de proteínas. Cultivar cultivos celulares de 4 L a 37 °C en medio LB (Caldo de Luria) hasta que OD₆₀₀ alcance 0.6.
2. Baje la temperatura a 16 °C. Una hora más adelante, induzca la expresión con 0.5 milímetros de isopropilo 1 thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante la noche.
3. Centrifugar las células a 4.104 x g durante 25 min y luego desechar el sobrenadante.
4. Resuspend los pellets celulares en 200 mL de tampón de lisis A (50 mM de fosfato sódico, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, 10% de glicerol y 0,2% de NP40). Utilice 50 mL de tampón de lisis para resuspend los pellets celulares de 1 L de cultivo celular.
5. Lyse las células por sonicación durante 15 min, 3 segundos en, y 3 segundos de descuento. Luego centrífuga las células a 37.888 x g durante 40 min.
   NOTA: El protocolo se puede pausar congelando las células antes de la sonicación en un congelador de -80 °C.
6. Cargue el sobrenadante en una columna de gravedad de cobalto (diámetro x longitud: 2,5 cm x 10 cm) con ~ 10 mL de perlas preequilibradas con volúmenes de 5-10 columnas (CV) de tampón de lisis.
7. Lave la columna con 5 CV de tampón B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% de glicerol y 5 mM de imidazol) y 5 CV de tampón C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM de NaCl, glicerol al 10% y 5 mM de imidazol).
8. Elute la proteína de las cuentas usando 2 CV del almacenador intermediario D (50 milímetros Tris-HCl pH 7.4, NaCl de 500 milímetros, y imidazole de 250 milímetros).
9. Diluir la proteína elutida 5x con tampón QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glicerol) para la columna Q.
10. Lave los 5 mL de la columna Q con tampón de control de calidad para equilibrar la columna, luego cargue la muestra diluida en la columna Q usando la bomba peristáltica (por ejemplo, Rabbit).
11. Cargue la columna Q en la máquina de HPLC junto con el búfer de control de calidad y el búfer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glicerol). Configure el caudal como 1 mL/min.
12. Ejecute el programa de "lavado de la bomba" para lavar la máquina con búfer QB seguido de búfer de control de calidad (1-2 CV / cada uno). Establezca el flujo del sistema en 3 mL/min.
13. Establezca el UV1 en 280 nm y el UV2 en 260 nm. Utilice una placa de 96 pozos profundos para recoger las fracciones.
14. Proteínas elute utilizando un gradiente escalonado de agente de elución (QB Buffer) aplicando 3-4 CV de cada concentración, aumentando el porcentaje en un 5% cada vez a partir de 0% QB. El complejo de proteína N⁰P saldrá al 15% de QB Buffer.
15. Una vez que toda la proteína esté eluted, lave la columna con 100% QB Buffer (2 CV).
16. Aislar la proteína por filtración en gel Superdex 200 Aumentar 10/300 GL columna (diámetro x longitud: 1,0 cm x 30 cm) y equilibrar con tampón E (20 mM HEPES pH 7,4 y 200 mM NaCl).
17. Analice las fracciones que contienen proteínas mediante SDS-PAGE.

3. Ensamblaje in vitro del NC específico del virus

NOTA: El ensamblaje in vitro del NC específico del RSV (N: ARN) se realizó mediante la incubación del complejo N⁰P preparado con oligos de ARN. A continuación, se utilizó la cromatografía SEC para separar el complejo de ensamblaje del N⁰P y el exceso de ARN(Figura 2).

1. Mezclar e incubar el complejo purificado N⁰P con RNA oligo con la relación molecular de 1:1,5 a temperatura ambiente durante 1 hora, generalmente 1 mL de la proteína N⁰P con una concentración de 1 mg/mL es suficiente para el siguiente paso. Configure la muestra de control, que solo contiene la misma cantidad de proteína N⁰P.
2. Pre-equilibrar la filtración de gel Superdex 200 Aumentar 10/300 GL columna con el tampón E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
3. Centrifugue la muestra con 21.130 x g durante 15 min, elimine cualquier precipitación y cargue el sobrenadante en la columna SEC.
4. Compare las imágenes de cromatografía SEC de la muestra de ensamblaje de N: ARN y la muestra de control de N⁰P, combine la relación A₂₆₀/ A₂₈₀ para identificar qué picos son el N-ARN ensamblado, N⁰P y ARN libre.
5. Recoja las fracciones máximas, ejecute el gel SDS-PAGE o haga cuadrículas.
6. Para el complejo de N-ARN de ensamblaje, recoja todas las fracciones del pico de N-ARN, realice la extracción de ARN y ejecute el gel Urea-PAGE para verificar la longitud de ARN específico, que es la misma que se mezcla e incuba en el primer paso.

4. Hacer rejillas de manchas negativas

NOTA: La microscopía electrónica de mancha negativa (EM) es un método en el que las moléculas se adsorben a una película de carbono y luego se incrustan en una capa de átomos de metales pesados. La mancha negativa EM produce un alto contraste de imagen, lo que facilita la vista y la alineación computacional de las partículas. Otra ventaja es que la adsorción de las partículas a una película de carbono suele inducir a las moléculas a adherirse a la rejilla con pocas orientaciones preferidas. Cuando las moléculas están en una orientación similar, es fácil separarlas en clases estructuralmente distintas. La tinción negativa EM es, por lo tanto, la técnica adecuada para guiar la preparación de^lamuestra^25,26 (Figura 3).

1. Microondas o calentar 5 mL de ddH₂O en un vaso de precipitados de vidrio pequeño utilizando un calentador de tungsteno hasta que esté hirviendo.
2. Pesar 37.5 mg de formiato de uranilo y añadir a 5 mL de ddH calentado₂O para hacer una solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75%. Revuelva debajo de un casto cubierto de papel de aluminio para protegerlo de la luz.
3. Añadir 4 μL de NaOH de 10 M a la solución de tinción y continuar agitando durante 15 min, protegido de la luz.
4. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 mm en un tubo de ensayo.
5. Utilice la descarga de resplandor para hacer que las rejillas EM continuas recubiertas de carbono sean hidrofílicas²⁷.
   NOTA: Las rejillas se colocan dentro de una cámara conectada a una fuente de alimentación. Cuando se aplica alto voltaje, el gas dentro de la cámara ioniza, y los iones cargados negativamente se depositan en las rejillas de carbono para hacerlos hidrófilos.
6. Cortar y doblar una tira de parafilm. Pipetear 2 gotas de 40 μL del tampón en un lado de la parapelícula, y pipetear otras 2 gotas de 40 μL de solución de tinción al otro lado.
7. Para hacer las rejillas de carbono EM, aplique 3 μL de muestra de proteína durante 1 minuto.
8. Borrar las rejillas contra un papel secante.
   NOTA: Las rejillas se lavan 2 veces con tampón, y 1x con la solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75% borrada después de cada paso.
9. Mantenga la superficie de la rejilla en la segunda gota de 0.75% solución de tinción de formiato de uranilo durante 30 segundos.
10. Limpie la rejilla contra un papel secante para eliminar el exceso de solución de manchas y permitir que la rejilla se seque al aire.
11. Almacene las cuadrículas en el cuadro de cuadrícula antes de la creación de imágenes.

Resultados

Purificación de la proteína N⁰P libre de ARN
Con este protocolo, se puede obtener un complejo heterodmérico soluble A gran escala RSV N⁰P. La longitud completa de la parte terminal N y N de las proteínas P se co-expresó con 10X His-Tag en la proteína N en E. coli. N⁰P fue purificado usando una columna del cobalto, un intercambio iónico, y una cromatografía de la exclusión del tamaño. N⁰P contiene tanto el terminal N de longitud completa co...

Discusión

Las estructuras conocidas de partículas similares a nucleópsides (NCLP) de los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) muestran que los NCLPs ensamblados son el complejo N con ARN celulares del huésped cuando se sobreexpresan en sistemas de expresión bacterianos o eucariotas^{15,16,17,18,19.} Estudios anteriores han intentado obtener el ARN libre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	SIgma	A9539-500G	making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC901024	concentrate the protein sample
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiotic for cell culture
AseI	NEB	R0526S	making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Heate the sample
dCTP	Invitrogen	10217016	making construct using LIC method
dGTP	Invitrogen	10218014	making construct using LIC method
Glycerol	Sigma	G5516-4L	making solution
HEPES	Sigma	H3375-100G	making solution
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Protein purification
Imidazole	Sigma	I5513-100G	making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator for lysing cell
Negative stain grids	Electron Microscopy Sciences	CF400-Cu-TH	For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	making solution
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purify DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Protein purification
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	making solution
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451	making negative stain solution