Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial

Résumé

Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N⁰⁾pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).

Résumé

L’utilisation d’un modèle d’ARN authentique est essentielle pour faire progresser les connaissances fondamentales sur la synthèse de l’ARN viral qui peuvent guider à la fois la découverte mécaniste et le développement d’essais en virologie. Le modèle d’ARN des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS), tels que le virus respiratoire syncytial (RSV), n’est pas une molécule d’ARN seule, mais plutôt un complexe de ribonucléoprotéines encapsulées de nucléoprotéines (N). Malgré l’importance du modèle d’ARN authentique, la génération et l’assemblage d’un tel complexe ribonucléoprotéique restent sophistiqués et nécessitent une élucidation en profondeur. Le principal défi est que le RSV N surexprimé se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des particules aléatoires de type nucléocoside (NCLPs). Ici, nous avons établi un protocole pour obtenir N sans ARN^(N0)d’abord en co-exprimant N avec une phosphoprotéine chaperon (P), puis en assemblant^N0 avec des oligos d’ARN avec la séquence d’ARN spécifique au RSV pour obtenir des nucléopsides spécifiques au virus (NCs). Ce protocole montre comment surmonter la difficulté dans la préparation de ce complexe viral traditionnellement provocant de ribonucleoprotein.

Introduction

Les virus à ARN à sens négatif (NNS) non segmentés comprennent de nombreux agents pathogènes humains importants, tels que la rage, Ebola et le virus respiratoire syncytial (RSV)^1,2. Le RSV est la principale cause de maladies respiratoires telles que la bronchiolite et la pneumonie chez les jeunes enfants et les adultes plus âgés dans le monde³. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral efficace pour prévenir ou traiter le RSV^4. Dans le cadre du cycle de vie, le génome du RSV sert de modèle pour la réplication par l’ARN polymérase dépendante de l’ARN du RSV pour produire un antigénique, qui à son tour agit comme modèle pour générer un génome de progéniture. Les ARN du génome et de l’antigène sont entièrement encapsulés par la nucléoprotéine (N) pour former les nucléocapsides (NCs)^3. Étant donné que les NCs servent de modèles pour la réplication et la transcription par la polymérase RSV, un assemblage NC approprié est crucial pour que la polymérase accède aux modèles pour la synthèse de l’ARN^5. Fait intéressant, sur la base des analyses structurelles des polymérases virales NNS, on émet l’hypothèse que plusieurs protéines N se dissocient transitoirement des NCs pour permettre l’accès de la polymérase et se rebinent à l’ARN après la synthèse de l’ARN^{6,7,8,9,10,11,12.}

Actuellement, le test de polymérisation de l’ARN RSV a été établi en utilisant de la polymérase RSV purifiée sur de courts modèles d’ARN nu^13,14. Cependant, les activités de la polymérase RSV n’atteignent pas optimales, comme observé dans les produits non processifs et abortifs générés par la polymérase RSV lors de l’utilisation de modèles d’ARN nu. L’absence de NC avec l’ARN spécifique au virus est un obstacle principal à la compréhension mécaniste de la synthèse de l’ARN du RSV. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle d’ARN authentique devient un besoin critique pour faire progresser les connaissances fondamentales de la synthèse de l’ARN du RSV. Les structures connues des particules de type nucléoscopique (NCLPs) provenant du RSV et d’autres virus à ARN NNS révèlent que les ARN dans les NCLPs sont soit des ARN cellulaires aléatoires, soit des ARN génomiques viraux moyens^{15,16,17,18,19.} Ensemble, le principal obstacle est que N se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des NCLPs lorsque N est surexprimé dans les cellules hôtes.

Pour surmonter cet obstacle, nous avons établi un protocole pour obtenir d’abord sans ARN^(N0)et assembler^N0 avec de l’ARN génomique viral authentique en NCLPs^20. Le principe de ce protocole est d’obtenir une grande quantité de N^(N0)sans ARN recombinant en co-exprimant N avec un chaperon, le domaine N-terminal de la phosphoprotéine RSV (P_NTD). Le N⁰P purifié pourrait être stimulé et assemblé en NCLPs en ajoutant des oligos d’ARN spécifiques au RSV, et pendant le processus d’assemblage, le chaperon P_NTD est déplacé lors de l’ajout d’oligos d’ARN.

Ici, nous détaillons un protocole pour la génération et l’assemblage de CN spécifiques à l’ARN RSV. Dans ce protocole, nous décrivons le clonage moléculaire, la préparation de protéine, l’assemblage in vitro, et la validation de l’assemblage complexe. Nous mettons en évidence la stratégie de clonage pour générer des constructions bi-cistroniques pour la coexpression de protéines pour le clonage moléculaire. Pour la préparation des protéines, nous décrivons les procédures de culture cellulaire, d’extraction des protéines et de purification du complexe protéique. Ensuite, nous discutons de la méthode d’assemblage in vitro des CN spécifiques à l’ARN RSV. Enfin, nous utilisons la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et la microscopie électronique à taches négatives (EM) pour caractériser et visualiser les NCLPs assemblés.

Protocole

1. Clonage moléculaire

REMARQUE: Le clonage indépendant de ligase (LIC) a été utilisé pour fabriquer un plasmide de construction de coexpression bi-cistronique RSV. LIC est une méthode développée au début des années 1990, qui utilise l’activité Exo 3'-5' de l’ADN polymérase T4 pour créer des surplombs avec complémentarité entre le vecteur et l’insert d’ADN^21,22. Les constructions ont été réalisées à l’aide de l’ADN vectoriel 2BT-10, qui consiste en une balise His 10x au N-terminal du cadre de lecture ouvert (ORF)(Figure 1).

1. Effectuer la linéarisation des vecteurs LIC à l’aide de la digestion SSPI.
   1. Combiner 10 μL de tampon SSPI 10X, 4 μL d’enzyme SSPI à une concentration de 5 U/μL, le volume équivalent de 5 μg d’ADN de miniprémption vectorielle et ddH_{stérile de 2}O à 100 μL.
   2. Incuber le digeste pendant 3 heures à 37 °C.
   3. Exécutez le digest sur un gel d’agarose à 1,0% pour l’extraction de l’ADN vecteur.
   4. Utilisez un kit d’extraction de gel pour effectuer l’extraction et la purification. Suspendre le volume final d’ADN vectoriel dans30 μL de ddH2 O et le stocker à -20 °C.
2. Préparer les inserts d’ADN pour N_1-391 et P_1-126 à l’aide de l’amorce avant N_1-391, de l’amorce inverse N_1-391, de l’amorce avant P_1-126 et de l’amorce inverse P_1-126 (tableau 1).
   NOTA: Il y a suffisamment de chevauchement avec le vecteur linéarisé pour assurer une température de fusion comprise entre 55 °C et 60 °C. Pour l’amorce inverse, il y a un chevauchement suffisant avec le brin complémentaire inverse du vecteur linéarisé pour la même raison.
   1. Effectuer une amplification PCR de l’insert d’ADN en utilisant les conditions des tableaux 2 et 3.
   2. Extraire l’insert d’ADN amplifié. Exécutez les produits PCR de l’étape précédente sur un gel d’agarose à 1,0%, puis extrayez et purifiez les bandes par extraction de gel. Suspendre le volume final d’ADN extrait dans 15 μL de_ddH2O.
3. Traitement de l’ADN polymérase T4 de l’ADN vecteur et de l’ADN insert (Tableau 4).
   REMARQUE: Le traitement doit être effectué séparément pour l’ADN vecteur et l’ADN insert.
   1. Incuber le mélange pendant 40 minutes à température ambiante. Ensuite, inactivez la polymérase à la chaleur à 75 °C pendant 20 minutes. Conserver le mélange réactionnel à -20 °C.
4. Recuit le vecteur LIC et le vecteur d’insertion.
   1. Mettre en place un témoin négatif avec 2 μL d’ADN vectoriel LIC et 2 μL de ddH₂O stérile.
   2. Combiner 2 μL d’ADN d’insertion et 2 μL d’ADN vectoriel LIC des réactions précédentes de l’ADN polymérase T4 dans un tube de 0,2 mL.
   3. Effectuer la réaction de recuit à température ambiante pendant 10 minutes.
   4. Éteindre la réaction avec 1,3 μL d’EDTA à une concentration de 25 mM.
   5. Transformer la réaction en 100 μL de cellules compétentes E. coli Top10 et les plaquer sur une plaque de sélection d’ampicilline^23,24.
5. Identifiez les constructions positives.
   1. Préparez la solution de minipréparation du plasmide. Cela peut être fait par la cueillette et l’inoculation des colonies dans les milieux LB. Habituellement, 3 colonies suffisent.
   2. Incuber le mélange pendant une nuit à 37 °C.
   3. Centrifuger le mélange à 4 560 x g pendant 10 minutes et jeter le surnageant.
   4. Ressusciter les pastilles dans 250 μL de tampon P1 et préparer des minipréses plasmidiques à l’aide d’une trousse de minipréparation de spin.
   5. Effectuer une analyse de digestion du produit miniprep en utilisant AseI ou d’autres enzymes de restriction.
   6. Chargez les échantillons sur du gel d’agarose à 0,8% et faites fonctionner le plasmide digéré. Analyser le gel sous une lampe UV.
   7. Utilisez un service de séquençage pour valider la séquence du produit positif.
6. Obtenir l’insert d’ADN de coexpression.
   1. Exécutez la PCR pour obtenir N_1-391 et P_1-126 en utilisant les modèles 2BT-10 N_1-391 et 2BT-10 P_1-126 précédemment construits.
   2. Effectuez la^1ère PCR pour obtenir N_1-391 à partir de la construction 2BT-10 N_1-391 en utilisant les conditions PCR du tableau 2 et du tableau 3 avec l’amorce N_1-391 avant et l’amorce inverse 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. Effectuez la 2^e PCR pour obtenir P_1-126 à partir de la construction 2BT-10 P_1-126 à l’aide de l’amorce avant: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 et l’amorce inverse P_1-126 (utilisez les conditions PCR des tableaux 2 et 3).
   4. Enfin, effectuer une PCR de chevauchement sur les produits mélangés des 2 réactions PCR précédentes pour fusionner_N1-391 et_P1-126. Utilisez l’amorce N_1-391 Forward et l’amorce inverse P_1-126. Utilisez les conditions PCR du tableau 5 et du tableau 6.
7. Joignez le vecteur et l’insert d’ADN.
   1. Traiter le produit PCR de chevauchement avec de l’ADN polymérase T4 en suivant le protocole de l’étape 1.3.
   2. Recuit le vecteur LIC et le produit PCR suivant le protocole de l’étape 1.4.
   3. Identifiez les constructions positives suivant le protocole à l’étape 1.5.

2. Expression et purification des protéines

REMARQUE: Utilisez E. coli pour la construction bi-cistronique de la coexpression de N et de P. Faites la culture des cellules à 37 °C, mais effectuez l’expression à une température réduite (16 °C) pendant la nuit. Purifier les complexes protéiques grâce à une combinaison de colonne de cobalt, d’échange d’ions et de chromatographie d’exclusion de taille (Figure 2).

1. Utilisez la souche E. coli BL21(DE3) pour la production de protéines. Cultiver des cultures cellulaires de 4 L à 37 °C dans un milieu LB (Luria Broth) jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,6.
2. Abaisser la température à 16 °C. Une heure plus tard, induisez l’expression avec 0.5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) pendant la nuit.
3. Centrifuger les cellules à 4 104 x g pendant 25 min, puis jeter le surnageant.
4. Ressusciter les pastilles cellulaires dans 200 mL de tampon de lyse A (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, glycérol à 10 % et NP40 à 0,2 %). Utilisez 50 mL de tampon de lyse pour ressusciter les pastilles cellulaires de 1 L de culture cellulaire.
5. Lyser les cellules par sonication pendant 15 min, 3 secondes et 3 secondes éteintes. Puis centrifuger les cellules à 37 888 x g pendant 40 min.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause en congelant les cellules avant la sonication dans un congélateur à -80 ° C.
6. Chargez le surnageant dans une colonne de gravité de cobalt (diamètre x longueur: 2,5 cm x 10 cm) avec ~ 10 ml de perles pré-équilibrées avec 5-10 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse.
7. Laver la colonne avec 5 CV de tampon B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glycérol et 5 mM imidazole) et 5 CV de tampon C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glycérol et 5 mM imidazole).
8. Éluer la protéine des billes à l’aide de 2 CV de tampon D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl et 250 mM imidazole).
9. Diluer la protéine éluée 5x avec un tampon QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycérol) pour la colonne Q.
10. Laver la colonne Q de 5 mL avec un tampon QA pour équilibrer la colonne, puis charger l’échantillon dilué dans la colonne Q à l’aide de la pompe péristaltique (p. ex. Rabbit).
11. Chargez la colonne Q dans la machine HPLC avec le tampon QA et le tampon QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glycérol). Définissez le débit sur 1 mL/min.
12. Exécutez le programme de « lavage de la pompe » pour laver la machine avec un tampon QB suivi d’un tampon QA (1-2 CV / chacun). Réglez le débit du système sur 3 mL/min.
13. Réglez l’UV1 à 280 nm et l’UV2 à 260 nm. Utilisez une plaque de 96 puits profonds pour recueillir les fractions.
14. Protéines élués à l’aide d’un gradient par étapes de l’agent d’élution (QB Buffer) en appliquant 3-4 CV de chaque concentration, augmentant le pourcentage de 5% à chaque fois à partir de 0% QB. Le complexe^protéiqueN 0 P sortira à 15% QB Buffer.
15. Une fois que toute la protéine est éluée, lavez la colonne avec 100% QB Buffer (2 CV).
16. Isolez la protéine par filtration sur gel Superdex 200 Augmenter la colonne 10/300 GL (diamètre x longueur : 1,0 cm x 30 cm) et équilibrer avec le tampon E (20 mM HEPES pH 7,4 et 200 mM NaCl).
17. Analyser les fractions contenant des protéines par SDS-PAGE.

3. Assemblage in vitro du NC spécifique au virus

REMARQUE: L’assemblage in vitro du NC spécifique au RSV (N: ARN) a été réalisé en incubant le complexe N⁰P préparé avec des oligos d’ARN. Ensuite, la chromatographie SEC a été utilisée pour séparer le complexe d’assemblage du^N0P et de l’excès d’ARN(figure 2).

1. Mélanger et incuber le complexe^N0P purifié avec de l’ARN oligo avec le rapport moléculaire de 1:1,5 à température ambiante pendant 1 heure, généralement 1 mL de la protéine^N0P avec une concentration de 1 mg/mL suffit pour l’étape suivante. Configurez l’échantillon témoin, qui ne contient que la même quantité de protéine^N0P.
2. Pré-équilibrer la colonne filtration sur gel Superdex 200 Increase 10/300 GL avec le tampon E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
3. Centrifuger l’échantillon avec 21 130 x g pendant 15 min, éliminer toute précipitation et charger le surnageant dans la colonne SEC.
4. Comparez les images de chromatographie SEC de l’échantillon d’assemblage N:ARN et de l’échantillon témoin N⁰P, combinez le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ pour identifier quels pics sont l’ARN N assemblé, le N⁰P et l’ARN libre.
5. Collectez les fractions de crête, exécutez le gel SDS-PAGE ou faites des grilles.
6. Pour l’assemblage du complexe N-ARN, recueillir toutes les fractions de pic de N-ARN, faire l’extraction de l’ARN et exécuter le gel Urée-PAGE pour revérifier la longueur de l’ARN spécifique, qui est la même que mélangé et incube à la première étape.

4. Faire des grilles de coloration négatives

REMARQUE: La microscopie électronique à coloration négative (EM) est une méthode dans laquelle les molécules sont adsorbées sur un film de carbone, puis incorporées dans une couche d’atomes de métaux lourds. La tache négative EM produit un contraste d’image élevé, ce qui facilite la vue et l’alignement informatique des particules. Un autre avantage est que l’adsorption des particules sur un film de carbone induit généralement les molécules à adhérer à la grille avec peu d’orientations préférées. Lorsque les molécules sont dans une orientation similaire, il est facile de les séparer en classes structurellement distinctes. La coloration négative EM est donc la technique appropriée pour guider la préparation des échantillons^25,26 (figure 3).

1. Micro-ondes ou chauffer 5 mL de ddH₂O dans un petit bécher en verre à l’aide d’un appareil de chauffage au tungstène jusqu’à ébullition.
2. Peser 37,5 mg d’uranyl formate et ajouter à 5 mL de ddH₂O chauffé pour faire une solution de coloration à 0,75% uranyl formate. Remuer sous un bécher recouvert de papier d’aluminium pour vous protéger de la lumière.
3. Ajouter 4 μL de NaOH 10 M à la solution de coloration et continuer à agiter pendant 15 min, à l’abri de la lumière.
4. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 mm dans un tube à essai.
5. Utilisez la décharge luminescente pour rendre les grilles EM continues revêtues de carbone^{hydrophiles 27.}
   REMARQUE: Les grilles sont placées à l’intérieur d’une chambre connectée à une alimentation électrique. Lorsque la haute tension est appliquée, le gaz à l’intérieur de la chambre s’ionise et les ions chargés négativement se déposent sur les grilles de carbone pour les rendre hydrophiles.
6. Couper et plier une bande de parafilm. Pipet 2 gouttes de 40 μL du tampon d’un côté du parafilm, et pipetez 2 autres gouttes de 40 μL de solution de coloration de l’autre côté.
7. Pour faire les grilles de carbone EM, appliquez 3 μL d’échantillon de protéines pendant 1 minute.
8. Épongez les grilles contre un papier buvard.
   REMARQUE: Les grilles sont lavées 2x avec tampon, et 1x avec la solution de coloration uranyl formate 0.75% blotted après chaque étape.
9. Maintenez la surface de la grille dans la deuxième goutte de solution de coloration au formate d’uranyle à 0,75% pendant 30 secondes.
10. Épongez la grille contre un papier buvard pour éliminer l’excès de solution de coloration et permettre à la grille de sécher à l’air.
11. Stockez les grilles dans la zone de grille avant l’imagerie.

Résultats

Purification de la protéine N⁰P sans ARN
Avec ce protocole, un complexe hétérodimérique soluble RSV^N0P à grande échelle peut être obtenu. Toute la longueur de la partie terminale N et N des protéines P a été co-exprimée avec 10X His-Tag sur la protéine N dans E. coli. ^N0P a été purifié utilisant une colonne de cobalt, un échange d’ions, et une chromatographie d’exclusion de taille. ^N0P contient à la fois le terminal N et N termi...

Discussion

Les structures connues de particules de type nucléocopside (NCLP) des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS) montrent que les NCLPs assemblés sont le complexe N avec des ARN cellulaires hôtes lorsqu’ils sont surexprimés dans les systèmes d’expression bactérienne ou eucaryote^{15,16,17,18,19.} Des études antérieures ont tenté d’obtenir l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	SIgma	A9539-500G	making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC901024	concentrate the protein sample
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiotic for cell culture
AseI	NEB	R0526S	making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Heate the sample
dCTP	Invitrogen	10217016	making construct using LIC method
dGTP	Invitrogen	10218014	making construct using LIC method
Glycerol	Sigma	G5516-4L	making solution
HEPES	Sigma	H3375-100G	making solution
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Protein purification
Imidazole	Sigma	I5513-100G	making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator for lysing cell
Negative stain grids	Electron Microscopy Sciences	CF400-Cu-TH	For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	making solution
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purify DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Protein purification
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	making solution
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451	making negative stain solution