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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).

Abstract

L'uso di un autentico modello di RNA è fondamentale per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA virale che può guidare sia la scoperta meccanicistica che lo sviluppo di saggi in virologia. Il modello di RNA dei virus dell'RNA a senso negativo non commentati (NNS), come il virus respiratorio sincrezionale (RSV), non è una molecola di RNA da sola ma piuttosto un complesso di ribonucleoproteina encapsidata di nucleoproteina (N). Nonostante l'importanza dell'autentico modello di RNA, la generazione e l'assemblaggio di un tale complesso di ribonucleoproteina rimangono sofisticati e richiedono una spiegazione approfondita. La sfida principale è che l'RSV N sovraespresso si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare particelle casuali simili a nucleocapside (NCLP). Qui, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere N (N0)privo di RNA prima co-esprimendo N con una fosfoproteina chaperone (P), quindi assemblando N0 con oligo di RNA con la sequenza di RNA specifica della RSV per ottenere nucleocapsidi specifici del virus (NC). Questo protocollo mostra come superare la difficoltà nella preparazione di questo complesso di ribonucleoproteina virale tradizionalmente impegnativo.

Introduzione

I virus dell'RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto ilmondo 3. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV4. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell'RNA polimerasi dipendente dall'RNA RSV per produrre un antigenoma, che a sua volta funge da modello per generare un genoma di progenie. Sia il genoma che l'antigenoma RNA sono interamente racchiusi dalla nucleoproteina (N) per formare i nucleocapsidi (NC)3. Poiché gli NC fungono da modelli sia per la replicazione che per la trascrizione da parte della RSV polimerasi, un adeguato assemblaggio NC è fondamentale affinché la polimerasi ottenga l'accesso ai modelli per la sintesi dell'RNA5. È interessante notare che, sulla base delle analisi strutturali delle polimerasi virali NNS, si ipotizza che diverse N proteine si dissociano transitoriamente dagli NC per consentire l'accesso della polimerasi e ricombinate all'RNA dopo la sintesi dell'RNA6,7,8,9,10,11,12.

Attualmente, il test di polimerizzazione dell'RNA RSV è stato stabilito utilizzando polimerasi RSV purificata su brevi modelli di RNAnudo 13,14. Tuttavia, le attività della RSV polimerasi non raggiungono ottimale, come osservato nei prodotti non processivi e abortivi generati dalla RSV polimerasi quando si utilizzano modelli di RNA nudi. La mancanza di NC con RNA specifico del virus è una barriera primaria per l'ulteriore comprensione meccanicistica della sintesi dell'RNA RSV. Pertanto, l'utilizzo di un autentico modello di RNA diventa un'esigenza critica per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA RSV. Le strutture note delle particelle nucleocapside-simili (NCLP) da RSV e altri virus NNS RNA rivelano che gli RNA negli NCLP sono RNA cellulari casuali o RNA genomiche virali medie15,16,17,18,19. Insieme, l'ostacolo principale è che N si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare NCLP quando N è sovraespresso nelle celle ospiti.

Per superare questo ostacolo, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere prima RNA-free (N0) e assemblare N0 con autentico RNA genomico virale in NCLP20. Il principio di questo protocollo è quello di ottenere una grande quantità di N (N 0) ricombinare n (N0)co-esprimere N con un chaperone, il dominio N-terminale della fosfoproteina RSV (PNTD). L'N0P purificato potrebbe essere stimolato e assemblato in NCLP aggiungendo oligo di RNA specifici per RSV, e durante il processo di assemblaggio, il chaperone PNTD viene spostato dopo l'aggiunta di oligo di RNA.

Qui, dettagliamo un protocollo per la generazione e l'assemblaggio di NC specifici dell'RNA RSV. In questo protocollo, descriviamo la clonazione molecolare, la preparazione proteica, l'assemblaggio in vitro e la convalida dell'assemblaggio complesso. Evidenziamo la strategia di clonazione per generare costrutti bi-cistronici per la coespressione proteica per la clonazione molecolare. Per la preparazione delle proteine, descriviamo le procedure di coltura cellulare, estrazione proteica e purificazione del complesso proteico. Quindi discutiamo il metodo per l'assemblaggio in vitro degli NC specifici dell'RNA RSV. Infine, utilizziamo la cromatografia ad esclusione di dimensione (SEC) e la microscopia elettronica a macchia negativa (EM) per caratterizzare e visualizzare gli NCLP assemblati.

Protocollo

1. Clonazione molecolare

NOTA: La clonazione indipendente ligasi (LIC) è stata utilizzata per creare un costrutto di coespressione bi-cistronica RSV plasmide. Il LIC è un metodo sviluppato nei primi anni '90, che utilizza l'attività 3'-5' Exo della DNA polimerasi T4 per creare sporgenze con complementarietà tra il vettore e l'inserto del DNA21,22. I costrutti sono stati realizzati utilizzando il DNA vettoriale 2BT-10, che consiste in un tag 10x His all'N-terminale dell'Open Reading Frame (ORF) (Figura 1).

  1. Eseguire la linearizzazione dei vettori LIC utilizzando la digestione SSPI.
    1. Unire 10 μL di tampone SSPI 10X, 4 μL di enzima SSPI ad una concentrazione di 5 U/μL, il volume equivalente di 5 μg di DNA miniprep vettoriale e ddH sterileda 2O a 100 μL.
    2. Incubare il digest per 3 ore a 37 °C.
    3. Eseguire il digest su un gel di agarosio all'1,0% per l'estrazione del DNA vettoriale.
    4. Utilizzare un kit di estrazione del gel per eseguire l'estrazione e la purificazione. Sospendere il volume finale del DNA vettoriale in 30 μL di ddH2O e conservarlo a -20 °C.
  2. Preparare gli inserti del DNA per N1-391 e P1-126 utilizzando il primer avanti N1-391, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer e P1-126 Reverse Primer(Tabella 1).
    NOTA: C'è una sovrapposizione sufficiente con il vettore linearizzato per garantire una temperatura di fusione compresa tra 55 °C e 60 °C. Per il primer inverso, c'è sufficiente sovrapposizione con il filamento complementare inverso del vettore linearizzato per lo stesso motivo.
    1. Eseguire l'amplificazione PCR dell'inserto del DNA utilizzando le condizioni della tabella 2 e della tabella 3.
    2. Estrarre l'inserto del DNA amplificato. Eseguire i prodotti PCR del passaggio precedente su un gel di agarosio all'1,0%, quindi estrarre e purificare le bande mediante estrazione del gel. Sospendere il volume finale del DNA estratto in 15 μL di ddH2O.
  3. T4 DNA polimerasi trattamento del vettore e inserire DNA(tabella 4).
    NOTA: Il trattamento deve essere eseguito separatamente per il DNA vettoriale e il DNA inserito.
    1. Incubare la miscela per 40 minuti a temperatura ambiente. Quindi, inattivare termicamente la polimerasi a 75 °C per 20 minuti. Conservare la miscela di reazione a -20 °C.
  4. Ricottura del vettore LIC e del vettore di inserimento.
    1. Impostare un controllo negativo con 2 μL di DNA vettoriale LIC e 2 μL di ddHsterile 2O.
    2. Combinare 2 μL di DNA inserto e 2 μL di DNA vettoriale LIC dalle precedenti reazioni di DNA polimerasi T4 in un tubo da 0,2 ml.
    3. Eseguire la reazione di ricottura a temperatura ambiente per 10 minuti.
    4. Temprare la reazione con 1,3 μL di EDTA ad una concentrazione di 25 mM.
    5. Trasformare la reazione in 100 μL di cellule competenti E. coli Top10 e placcarle su una piastra di selezione di ampicillina23,24.
  5. Identificare i costrutti positivi.
    1. Preparare la soluzione di miniprep plasmide. Questo può essere fatto attraverso la raccolta della colonia e l'inoculazione nei media LB. Di solito, 3 colonie sono sufficienti.
    2. Incubare la miscela durante la notte a 37 °C.
    3. Centrifugare la miscela a 4.560 x g per 10 minuti e scartare il supernatante.
    4. Rimescolare i pellet in 250 μL di tampone P1 e preparare miniprep plasmidi utilizzando un kit di miniprep di spin.
    5. Condurre un'analisi di digestione del prodotto miniprep utilizzando AseI o altri enzimi di restrizione.
    6. Caricare campioni su gel di agarosio allo 0,8% ed eseguire il plasmide digerito. Analizzare il gel sotto una lampada UV.
    7. Utilizzare un servizio di sequenziamento per convalidare la sequenza del prodotto positivo.
  6. Ottenere l'inserto del DNA di coespressione.
    1. Eseguire PCR per ottenere N1-391 e P1-126 utilizzando i modelli 2BT-10 N1-391 e 2BT-10 P1-126 costruiti in precedenza.
    2. Eseguire il PCR 1st per ottenere N1-391 dal costrutto 2BT-10 N1-391 utilizzando le condizioni PCR nelle tabelle 2 e Table 3 con il primer N1-391 Forward e il Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
    3. Eseguire il 2° PCR per ottenere P1-126 dal costrutto 2BT-10 P1-126 utilizzando il primer Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ e il primer inverso P1-126 (utilizzare le condizioni PCR nelle tabelle 2 e 3).
    4. Infine, eseguire sovrapposizioni PCR sui prodotti misti delle precedenti 2 reazioni PCR per fondere N1-391 e P1-126. Utilizzare il primerN 1-391 Forward e il primer P1-126 Reverse. Utilizzare le condizioni PCR nelle tabelle 5 e 6.
  7. Unire il vettore e l'inserto del DNA.
    1. Trattare il prodotto PCR sovrapposto con T4 DNA polimerasi seguendo il protocollo nella fase 1.3.
    2. Ricottura del vettore LIC e del prodotto PCR seguendo il protocollo nel passaggio 1.4.
    3. Identificare i costrutti positivi seguendo il protocollo nel passaggio 1.5.

2. Espressione e purificazione proteica

NOTA: Utilizzare E. coli per il costrutto bi-cistronico della coespressione di N e P. Coltura le cellule a 37 °C, ma eseguire l'espressione a temperatura ridotta (16 °C) durante la notte. Purificare i complessi proteici attraverso una combinazione di colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni (Figura 2).

  1. Utilizzare il ceppo E. coli BL21(DE3) per la produzione di proteine. Coltivare 4 colture cellulari L a 37 °C in mezzo LB (Luria Broth) fino a quando OD600 raggiunge 0,6.
  2. Abbassare la temperatura a 16 °C. Un'ora dopo, indurre l'espressione con 0,5 mM isopropil 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante la notte.
  3. Centrifugare le cellule a 4.104 x g per 25 minuti e quindi scartare il supernatante.
  4. Rimescolare il pellet cellulare in 200 mL di tampone di lisi A (fosfato di sodio 50 mM, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolo, 10% glicerolo e 0,2% NP40). Utilizzare 50 mL di tampone di lisi per rimescolare il pellet cellulare da 1 L di coltura cellulare.
  5. Lyse le cellule per sonicazione per 15 minuti, 3 secondi e 3 secondi di riposo. Quindi centrifugare le cellule a 37.888 x g per 40 min.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa congelando le cellule prima della sonicazione in un congelatore a -80 °C.
  6. Caricare il supernatante in una colonna di gravità cobalto (diametro x lunghezza: 2,5 cm x 10 cm) con ~10mL di perline pre-equilibrate con 5-10 volumi di colonna (CV) di tampone di lysis.
  7. Lavare la colonna con 5 CV di tampone B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glicerolo e 5 mM imidazolo) e 5 CV di tampone C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glicerolo e 5 mM imidazolo).
  8. Elute la proteina dalle perline usando 2 CV di tampone D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl e 250 mM imidazole).
  9. Diluire la proteina eluita 5x con tampone QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glicerolo) per la colonna Q.
  10. Lavare i 5 mL della colonna Q con tampone QA per equilibrare la colonna, quindi caricare il campione diluito nella colonna Q utilizzando la pompa peristaltica (ad esempio Rabbit).
  11. Caricare la colonna Q nella macchina HPLC insieme al buffer QA e al buffer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glicerolo). Impostare la portata come 1 mL/min.
  12. Eseguire il programma di "lavaggio della pompa" per lavare la macchina con tampone QB seguito da buffer QA (1-2 CV/ciascuno). Impostare il flusso di sistema su 3 mL/min.
  13. Impostare UV1 su 280 nm e UV2 su 260 nm. Utilizzare una piastra a pozzo profondo 96 per raccogliere le frazioni.
  14. Elute proteine utilizzando un gradiente graduale di agente di eluizione (QB Buffer) applicando 3-4 CV di ogni concentrazione, aumentando la percentuale del 5% ogni volta a partire dallo 0% QB. Ilcomplesso proteicoN 0 P eserà al 15% di QB Buffer.
  15. Una volta eluito tutta la proteina, lavare la colonna con 100% QB Buffer (2 CV).
  16. Isolare la proteina mediante filtrazione in gel Superdex 200 Aumentare la colonna 10/300 GL (diametro x lunghezza: 1,0 cm x 30 cm) ed equilibrare con tampone E (20 mM HEPES pH 7,4 e 200 mM NaCl).
  17. Analizza le frazioni contenenti proteine di SDS-PAGE.

3. Assemblaggio in vitro del NC specifico del virus

NOTA: L'assemblaggio in vitro del NC specifico per RSV (N:RNA) è stato eseguito incubando il complesso N0P preparato con oligo di RNA. Quindi, la cromatografia SEC è stata utilizzata per separare il complesso di assemblaggio dalla N0P e dall'RNA in eccesso (Figura 2).

  1. Mescolare e incubare il complesso purificato N0P con oligo di RNA con il rapporto molecolare di 1:1,5 a temperatura ambiente per 1 ora, di solito 1 mL della proteina N0P con una concentrazione di 1 mg / mL è sufficiente per il passo successivo. Impostare il campione di controllo, che contiene solo la stessa quantità di proteina N0P.
  2. Pre-equilibrare la filtrazione in gel Superdex 200 Aumentare la colonna 10/300 GL con il tampone E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
  3. Centrifugare il campione con 21.130 x g per 15 minuti, rimuovere eventuali precipitazioni e caricare il supernatante nella colonna SEC.
  4. Confrontare le immagini di cromatografia SEC del campione di assemblaggio N:RNA e del campione di controllo N0P, combinare il rapporto A260/A280 per identificare quali picchi sono l'N-RNA assemblato, N0P e l'RNA libero.
  5. Raccogliere le frazioni di picco, eseguire il gel SDS-PAGE o creare griglie.
  6. Per il complesso di N-RNA di assemblaggio, raccogliere tutte le frazioni del picco di N-RNA, fare l'estrazione dell'RNA ed eseguire il gel Urea-PAGE per ricontrollare la lunghezza dell'RNA specifico, che è lo stesso di miscelato e incubato al primo passo.

4. Fare griglie di macchie negative

NOTA: La microscopia elettronica a macchia negativa (EM) è un metodo in cui le molecole vengono adsorbiti in una pellicola di carbonio e quindi incorporati in uno strato di atomi di metallo pesante. La macchia negativa EM produce un elevato contrasto dell'immagine, rendendo facile la vedere e allineando computazalmente le particelle. Un altro vantaggio è che l'adsorbimento delle particelle in una pellicola di carbonio di solito induce le molecole ad aderire alla griglia con pochi orientamenti preferiti. Quando le molecole hanno un orientamento simile, è facile separarle in classi strutturalmente distinte. La macchia negativa EM è quindi la tecnica appropriata per guidare la preparazione delcampione 25,26 (Figura 3).

  1. Microonde o calore 5 mL di ddH2O in un piccolo bicchiere di vetro usando un riscaldatore di tungsteno fino a quando non bolle.
  2. Pesare 37,5 mg di formato uroril e aggiungere a 5 mL di ddH 2 Oriscaldatoper fare una soluzione di colorazione in formato 0,75% di uranil. Mescolare sotto un becher coperto di foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
  3. Aggiungere 4 μL di 10 M NaOH alla soluzione di colorazione e continuare a mescolare per 15 minuti, protetti dalla luce.
  4. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 mm in una provetta.
  5. Utilizzare la scarica luminosa per rendere idrofile le reti EM continue rivestite di carbonio27.
    NOTA: Le griglie sono posizionate all'interno di una camera collegata a un alimentatore. Quando viene applicata l'alta tensione, il gas all'interno della camera ionizza e gli ioni caricati negativamente si depositano sulle reti di carbonio per renderli idrofili.
  6. Tagliare e piegare una striscia di parafilm. Pipetta 2 gocce di 40 μL del tampone su un lato del parafilm e pipetta altre 2 gocce di 40 μL di soluzione di colorazione sull'altro lato.
  7. Per realizzare le griglie di carbonio EM, applicare 3 μL di campione proteico per 1 minuto.
  8. Asciugare le griglie contro una carta assorbente.
    NOTA: Le griglie vengono lavate 2 volte con tampone e 1x con la soluzione di colorazione in formato 0,75% di uranil cancellato dopo ogni passaggio.
  9. Tenere la superficie della griglia nella seconda goccia dello 0,75% di soluzione di colorazione in formato uranil per 30 secondi.
  10. Asciugare la griglia contro una carta assorbente per rimuovere la soluzione di macchia in eccesso e lasciare asciugare la griglia all'aria.
  11. Archiviare le griglie nella casella della griglia prima dell'imaging.

Risultati

Purificazione della proteina N0P priva di RNA
Con questo protocollo, è possibile ottenere un complesso eterodimerico solubile RSV N0P su larga scala. L'intera lunghezza della parte terminale N e N delle proteine P è stata co-espressa con 10X His-Tag sulla proteina N in E. coli. N0P è stato purificato usando una colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni. N0P contiene sia il terminale N che N a tutta lunghezza P...

Discussione

Le strutture note di particelle nucleocapside-simili (NCLP) dei virus RNA a senso negativo non commentati (NNS) mostrano che gli NLP assemblati sono il complesso N con RNA cellulari ospiti quando sovraespresso nei sistemi di espressione batterica o eucariotica15,16,17,18,19. Studi precedenti hanno tentato di ottenere l'N privo di RNA con una varietà di metodi...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

I programmi di ricerca nel laboratorio Liang di Emory sono supportati dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) degli Stati Uniti, dal National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio R01GM130950 e dal Research Start-Up Fund presso la Emory University School of Medicine. L'autore riconosce i membri del laboratorio Liang per il supporto utile e la discussione critica.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSIgmaA9539-500Gmaking construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitMilliporeUFC901024concentrate the protein sample
Ampicillin sodiumGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317Aantibiotic for cell culture
AseINEBR0526Smaking construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose BeadsGold BioH-310-500For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBHeate the sample
dCTPInvitrogen10217016making construct using LIC method
dGTPInvitrogen10218014making construct using LIC method
GlycerolSigmaG5516-4Lmaking solution
HEPESSigmaH3375-100Gmaking solution
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Protein purification
ImidazoleSigmaI5513-100Gmaking solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Ainduce the expression of protein
Microcentrifuge TubesVWR47730-598for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid ProcessorSpectraLabMSX-XL-2020sonicator for lysing cell
Negative stain gridsElectron Microscopy SciencesCF400-Cu-THFor making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 SubstituteSigma74385-1Lmaking solution
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706Purify DNA
SSPI-HFNEBR3132Smaking construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Protein purification
T4 DNA polymeraseSigma70099-3making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus CentrifugeFisher Scientific36-101-0816Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochlorideSigmaT3253-250Gmaking solution
Uranyl FormateElectron Microscopy Sciences22451making negative stain solution

Riferimenti

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