Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio

Riepilogo

Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N⁰⁾per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).

Abstract

L'uso di un autentico modello di RNA è fondamentale per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA virale che può guidare sia la scoperta meccanicistica che lo sviluppo di saggi in virologia. Il modello di RNA dei virus dell'RNA a senso negativo non commentati (NNS), come il virus respiratorio sincrezionale (RSV), non è una molecola di RNA da sola ma piuttosto un complesso di ribonucleoproteina encapsidata di nucleoproteina (N). Nonostante l'importanza dell'autentico modello di RNA, la generazione e l'assemblaggio di un tale complesso di ribonucleoproteina rimangono sofisticati e richiedono una spiegazione approfondita. La sfida principale è che l'RSV N sovraespresso si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare particelle casuali simili a nucleocapside (NCLP). Qui, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere N (N⁰⁾privo di RNA prima co-esprimendo N con una fosfoproteina chaperone (P), quindi assemblando N^{0 con} oligo di RNA con la sequenza di RNA specifica della RSV per ottenere nucleocapsidi specifici del virus (NC). Questo protocollo mostra come superare la difficoltà nella preparazione di questo complesso di ribonucleoproteina virale tradizionalmente impegnativo.

Introduzione

I virus dell'RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)^1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto il^{mondo 3}. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV⁴. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell'RNA polimerasi dipendente dall'RNA RSV per produrre ....

Protocollo

1. Clonazione molecolare

NOTA: La clonazione indipendente ligasi (LIC) è stata utilizzata per creare un costrutto di coespressione bi-cistronica RSV plasmide. Il LIC è un metodo sviluppato nei primi anni '90, che utilizza l'attività 3'-5' Exo della DNA polimerasi T4 per creare sporgenze con complementarietà tra il vettore e l'inserto del DNA^21,22. I costrutti sono stati realizzati utilizzando il DNA vettoriale 2BT-10, che consiste in un tag 10x His all'N-terminale dell'Open Reading Frame (ORF) (Figura 1).

1. Eseguire la linearizz....

Risultati

Purificazione della proteina N⁰P priva di RNA
Con questo protocollo, è possibile ottenere un complesso eterodimerico solubile RSV N⁰P su larga scala. L'intera lunghezza della parte terminale N e N delle proteine P è stata co-espressa con 10X His-Tag sulla proteina N in E. coli. N⁰P è stato purificato usando una colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni. N⁰P contiene sia il terminale N che N a tutta lunghezza P.......

Discussione

Le strutture note di particelle nucleocapside-simili (NCLP) dei virus RNA a senso negativo non commentati (NNS) mostrano che gli NLP assemblati sono il complesso N con RNA cellulari ospiti quando sovraespresso nei sistemi di espressione batterica o eucariotica^{15,16,17,18,19}. Studi precedenti hanno tentato di ottenere l'N privo di RNA con una varietà di metodi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	SIgma	A9539-500G	making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC901024	concentrate the protein sample
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiotic for cell culture
AseI	NEB	R0526S	making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Heate the sample
dCTP	Invitrogen	10217016	making construct using LIC method
dGTP	Invitrogen	10218014	making construct using LIC method
Glycerol	Sigma	G5516-4L	making solution
HEPES	Sigma	H3375-100G	making solution
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Protein purification
Imidazole	Sigma	I5513-100G	making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator for lysing cell
Negative stain grids	Electron Microscopy Sciences	CF400-Cu-TH	For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	making solution
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purify DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Protein purification
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	making solution
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451	making negative stain solution