JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

Abstract

השימוש בתבנית RNA אותנטית הוא קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA ויראלית שיכולה להנחות הן גילוי מכני והן פיתוח מבחנים בוירולוגיה. תבנית ה- RNA של וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים, כגון הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אינה מולקולת RNA בלבד אלא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין עטוף נוקלאופרטאין (N). למרות החשיבות של תבנית RNA אותנטית, הדור וההרכבה של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין כזה נשארים מתוחכמים ודורשים הבהרת עומק. האתגר העיקרי הוא כי N RSV overexpressed נקשר באופן לא ספציפי RNAs הסלולר כדי ליצור חלקיקים אקראיים דמויי nucleocapsid (NCLPs). כאן, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג N ללא RNA (N0)תחילה על ידי שיתוף הבעה N עם phosphoprotein מלווה (P), ולאחר מכן הרכבת N0 עם אוליגוס RNA עם רצף RNA ספציפי RSV כדי להשיג נוקליקופסידים ספציפיים לנגיף (NCs). פרוטוקול זה מראה כיצד להתגבר על הקושי בהכנת מתחם ריבונוקלאופרוטאין ויראלי מאתגר באופן מסורתי.

Introduction

וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים כוללים פתוגנים אנושיים משמעותיים רבים, כגון כלבת, אבולה ווירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV)1,2. RSV הוא הגורם המוביל למחלות בדרכי הנשימה כגון ברונכיוליטיס ודלקת ריאות אצל ילדים צעירים ומבוגרים ברחבי העולם3. נכון לעכשיו, אין חיסונים יעילים או טיפולים אנטי ויראליים זמינים כדי למנוע או לטפל RSV4. כחלק ממחזור החיים, הגנום RSV משמש כתבנית לשכפול על ידי פולימראז RNA תלוי RSV לייצר אנטיגנום, אשר בתורו פועל כתבנית כדי ליצור גנום צאצאים. הן הגנום והן האנטיגנום RNAs הם עטופים לחלוטין על ידי נוקלאופרוטין (N) כדי ליצור את nucleocapsids (NCs)3. מכיוון שה- NCs משמשים כתבניות הן עבור שכפול והן עבור שעתוק על-ידי פולימראז RSV, הרכבת NC נכונה חיונית עבור הפולימראז כדי לקבל גישה לתבניות עבור סינתזת RNA5. מעניין, בהתבסס על ניתוחים מבניים של פולימראז נגיפי NNS, הוא שיערו כי מספר חלבוני N להתיר באופן חולף מן NCs כדי לאפשר את הגישה של פולימראז rebind ל- RNA לאחר סינתזת RNA6,7,8,9,10,11,12.

נכון לעכשיו, מבחני פולמור RNA RSV הוקמה באמצעות פולימראז RSV מטוהר על תבניות RNA עירום קצר13,14. עם זאת, הפעילויות של פולימראז RSV אינן מגיעות אופטימלית, כפי שנצפה במוצרים שאינם מעובדים וביטול שנוצר על ידי פולימראז RSV בעת שימוש בתבניות RNA עירום. חוסר NC עם RNA ספציפי לנגיף הוא מחסום עיקרי להבנה מכנית נוספת של סינתזת RNA RSV. לכן, שימוש בתבנית RNA אותנטית הופך לצורך קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA RSV. המבנים הידועים של חלקיקים דמויי nucleocapsid (NCLPs) מ RSV ווירוסי RNA NNS אחרים מגלים כי RNAs ב- NCLPs הם או RNAs הסלולר אקראי או ממוצע RNAs גנומי ויראלי15,16,17,18,19. יחד, המשוכה העיקרית היא ש- N נקשר באופן לא ספציפי ל- RNAs סלולריים כדי ליצור NCLP כאשר N מתרשם יתר על ה- 0 בתאים המארחים.

כדי להתגבר על משוכה זו, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג RNA חינם (N0)הראשון להרכיב N0 עם RNA גנומי ויראלי אותנטי לתוך NCLPs20. העיקרון של פרוטוקול זה הוא להשיג כמות גדולה של N ללא רנ"א רקומביננטי (N0)על ידי שיתוף להביע N עם מלווה, תחום N-מסוף של RSV פוספופרוטאין (PNTD). N0P מטוהר יכול להיות מגורה והרכיב לתוך NCLPs על ידי הוספת אוליגוס RNA ספציפי RSV, ובמהלך תהליך ההרכבה, המלווה PNTD נעקר על תוספת של אוליגוס RNA.

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור הדור וההרכבה של NCs ספציפיים RNA RSV. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיבוט המולקולרי, הכנת החלבון, הרכבת במבחנה ואימות ההרכבה המורכבת. אנו מדגישים את אסטרטגיית השיבוט כדי ליצור מבנים דו-סיסטרוניים לדו-קיום חלבונים לשיבוט מולקולרי. להכנת חלבונים, אנו מתארים את ההליכים של תרבית התא, מיצוי החלבון וטיהור קומפלקס החלבון. לאחר מכן אנו דנים בשיטה להרכבה במבחנה של NCs ספציפיים RNA RSV. לבסוף, אנו משתמשים כרומטוגרפיה אי-הכללת גודל (SEC) ומיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) כדי לאפיין לדמיין ותמחה את NCLPs התאספו.

Protocol

1. שיבוט מולקולרי

הערה: שיבוט עצמאי ליגאז (LIC) שימש להכנת RSV דו סיסטרוני דו-קיום לבנות פלסמיד. LIC היא שיטה שפותחה בתחילת שנות התשעים, המשתמשת בפעילות האקסו 3'-5 ' של פולימראז ה- T4 DNA כדי ליצור overhangs עם משלימות בין הווקטור לבין להוסיף DNA21,22. המבנים נעשו באמצעות DNA וקטורי 2BT-10, אשר מורכב 10x התג שלו במסוף N של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF)(איור 1).

  1. בצע ליניאריזציה של וקטורים LIC באמצעות עיכול SSPI.
    1. שלב 10 μL של מאגר SSPI 10X, 4 μL של אנזים SSPI בריכוז של 5 U / μL, נפח שווה ערך של 5 מיקרוגרם של DNA miniprep וקטורית, ו ddH סטרילי2O עד 100 μL.
    2. דגירה את העיכול במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. להפעיל את העיכול על 1.0% ג'ל agarose להפקת DNA וקטור.
    4. השתמש בערכת מיצוי ג'ל לביצוע מיצוי וטיהור. להשעות את הנפח הסופי של DNA וקטור ב 30 μL של ddH2O ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את מוסיף ה- DNA עבור N1-391 ו- P1-126 באמצעות פריימר קדימהN 1-391, N1-391 פריימר הפוך, P1-126 קדימה פריימר, ו P1-126 קדם הפוך (טבלה 1).
    הערה: יש חפיפה מספקת עם הווקטור הליניארי כדי להבטיח טמפרטורת התכה של בין 55 °C (60 °F) ו 60 °C (60 °F). עבור פריימר הפוך, יש חפיפה מספקת עם הגדיל המשלים ההפוך של הווקטור הליניארי מאותה סיבה.
    1. בצע הגברה PCR של תוסף ה- DNA באמצעות התנאים בטבלה 2 ובטבלה 3.
    2. חלץ את תוסף הדנ"א המוגבר. הפעל את מוצרי PCR מהשלב הקודם על ג'ל agarose 1.0%, ולאחר מכן לחלץ ולטהר את הרצועות על ידי מיצוי ג'ל. להשעות את הנפח הסופי של DNA שחולצו ב 15 μL של ddH2O.
  3. T4 טיפול פולימראז DNA של וקטור ולהכניס DNA (טבלה 4).
    הערה: יש לבצע את הטיפול בנפרד עבור ה- DNA הווקטורי וה- DNA של הכנס.
    1. דגירה את התערובת במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חום להשבית את הפולימראז ב 75 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחסן את תערובת התגובה ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. אנאל וקטור LIC וקטור הכנס.
    1. הגדר שליטה שלילית עם 2 μL של DNA וקטורי LIC ו 2 μL של ddH סטרילי2O.
    2. לשלב 2 μL של הכנס DNA ו 2 μL של DNA וקטור LIC מן התגובות הקודמות T4 DNA פולימראז בצינור 0.2 מ"ל.
    3. בצע את תגובת חישול בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    4. להרוות את התגובה עם 1.3 μL של EDTA בריכוז של 25 מ"מ.
    5. להפוך את התגובה לתוך 100 μL של E. coli Top10 תאים מוסמכים צלחת אותם על צלחת בחירת אמפילין23,24.
  5. זהה את המבנים החיוביים.
    1. הכינו את פתרון המיני-פרזיפ של הפלסמיד. זה יכול להיעשות באמצעות קטיף מושבה וחיסון במדיה LB. בדרך כלל, 3 מושבות מספיקות.
    2. דגירה את התערובת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה את התערובת ב 4,560 x g במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.
    4. Resuspend כדורי ב 250 μL של מאגר P1 ולהכין minipreps פלסמיד באמצעות ערכת miniprep ספין.
    5. בצע ניתוח עיכול של מוצר miniprep באמצעות AseI או אנזימי הגבלה אחרים.
    6. לטעון דגימות על 0.8% ג'ל agarose ולהפעיל את פלסמיד מתעכל. לנתח את הג'ל תחת מנורת UV.
    7. השתמש בשירות רצף כדי לאמת את רצף המוצר החיובי.
  6. השג את תוסף הדנ"א הדו-קיום.
    1. בצע PCR כדי להשיג N1-391 ו P1-126 באמצעות 2BT-10 N שנבנה בעבר1-391 ו 2BT-10 P1-126 כתבניות.
    2. בצע את PCR 1st כדי להשיג N1-391 מ 2BT-10 N1-391 לבנות באמצעות תנאי PCR בטבלה 2 וטבלה 3 עם N1-391 פריימר קדימה פריימר הפוך 5'-GTGAAGATCCTGGCTTGGGGGGGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3'.
    3. בצע את PCR2 nd כדי להשיג P1-126 מ 2BT-10 P1-126 לבנות באמצעות פריימר קדימה: 5'-CCGCCGGCATGCATCAGCCAGGATTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 וה-P1-126 הפוך פריימר (השתמש בתנאי PCR בטבלה 2 וטבלה 3).
    4. לבסוף, לבצע PCR חפיפה על המוצרים המעורבים של 2 תגובות PCR הקודם למזג N1-391 ו P1-126. השתמש בפריימריז קדימהN 1-391 וב-P1-126 הפוך פריימר. השתמש בתנאי PCR בטבלה 5 ובטבלה 6.
  7. הצטרף לווקטור ולתווסף הדנ"א.
    1. טפל במוצר PCR החופף עם פולימראז DNA T4 בעקבות הפרוטוקול בשלב 1.3.
    2. אנאל וקטור LIC ומוצר PCR בעקבות הפרוטוקול בשלב 1.4.
    3. זהה את המבנים החיוביים הבאים לפרוטוקול בשלב 1.5.

2. ביטוי חלבון וטיהור

הערה: השתמש E. coli עבור המבנה הדו-סיסטרוני של דו-קיום של N ו P. תרבות התאים ב 37 °C (69 °F), אבל לבצע את הביטוי בטמפרטורה מופחתת (16 °C (60 °F) לילה. לטהר את קומפלקס החלבון באמצעות שילוב של כרומטוגרפיה של עמודת קובלט, החלפת יון והדרת גודל (איור 2).

  1. השתמש בזן E. coli BL21(DE3) לייצור חלבונים. לגדול 4 L תרביות תא ב 37 °C (LB במרק לוריא) בינוני עד OD600 מגיע 0.6.
  2. להוריד את הטמפרטורה ל 16 °C (66 °F). שעה לאחר מכן, לגרום לביטוי עם 0.5 מ"מ איזופרופיל 1-thio - D-galactopyranoside (IPTG) לילה.
  3. צנטריפוגה התאים ב 4,104 x g במשך 25 דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant.
  4. Resuspend כדורי התא ב 200 מ"ל של מאגר תמוגה A (50 מ"מ נתרן פוספט, pH 7.4, 500 מ"מ NaCl, 5 mM imidazole, 10% גליצרול, ו 0.2% NP40). השתמש 50 מ"ל של מאגר תמוגה כדי resuspend כדורי התא מ 1 L של תרבות התא.
  5. Lyse התאים על ידי sonication במשך 15 דקות, 3 שניות על, ו 3 שניות את. ואז תאי צנטריפוגה ב 37,888 x g במשך 40 דקות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול על ידי הקפאת התאים לפני sonication במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  6. טען את supernatant לתוך עמודת כבידה קובלט (קוטר x אורך: 2.5 ס"מ x 10 ס"מ) עם ~ 10mL של חרוזים מראש שווה עם 5-10 עמודות נפחים (CV) של מאגר תמוגה.
  7. לשטוף את העמודה עם 5 קורות חיים של חיץ B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% גליצרול, ו 5 mM imidazole) ו 5 קורות חיים של חיץ C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% גליצרול, ו 5 mM imidazole).
  8. אלוט את החלבון מן החרוזים באמצעות 2 קורות חיים של חיץ D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, ו 250 mM imidazole).
  9. לדלל את החלבון eluted 5x עם חיץ QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% גליצרול) עבור עמודת Q.
  10. לשטוף את 5 מ"ל של עמודת Q עם מאגר QA כדי לאיזוי העמודה, ולאחר מכן לטעון את המדגם מדולל לתוך העמודה Q באמצעות משאבה peristaltic (למשל, ארנב).
  11. טען את עמודת ה-Q למכונת HPLC יחד עם מאגר QA ומאגר QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% גליצרול). הגדר את קצב הזרימה כ- 1 מ"ל/דקה.
  12. הפעל את התוכנית "שטיפת משאבה" כדי לשטוף את המכונה עם מאגר QB ואחריו מאגר QA (1-2 קורות פנים / כל אחד). הגדר את זרימת המערכת ל- 3 מ"ל/דקה.
  13. הגדר את UV1 כדי 280 ננומטר ו UV2 כדי 260 ננומטר. השתמש צלחת 96 עמוק היטב כדי לאסוף את השברים.
  14. חלבונים Elute באמצעות שיפוע צעד של סוכן elution (מאגר QB) החלת 3-4 קורות חיים של כל ריכוז, להגדיל את האחוז על ידי 5% בכל פעם החל 0% QB. קומפלקס חלבון N0P ייצא במאגר 15% QB.
  15. לאחר כל החלבון הוא eluted, לשטוף את הטור עם 100% QB Buffer (2 קורות חיים).
  16. לבודד את החלבון על ידי סינון ג'ל Superdex 200 להגדיל 10/300 עמודה GL (קוטר x אורך: 1.0 ס"מ x 30 ס"מ) ואת שיווי משקל עם חיץ E (20 מ"מ HEPES pH 7.4 ו 200 mM NaCl).
  17. נתח שברים המכילים חלבונים לפי SDS-PAGE.

3. הרכבה במבחנה של NC ספציפי לנגיף

הערה: ההרכבה במבחנה של NC ספציפי RSV (N:RNA) בוצעה על ידי דגירה של מתחם N0P מוכן עם אוליגוס RNA. לאחר מכן, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של ה-SEC כדי להפריד את קומפלקס ההרכבהמה-N 0P ומה-RNA העודף(איור 2).

  1. מערבבים ומדגרים את קומפלקס N0P המטוהר עם אוליגו RNA עם יחס מולקולרי של 1:1.5 בטמפרטורת החדר למשך שעה, בדרך כלל 1 מ"ל של החלבון N0P עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל מספיק לשלב הבא. הגדר את דגימת הבקרה, המכילה רק את אותה כמות של חלבון N0P.
  2. מראש להשוות את סינון הג'ל Superdex 200 להגדיל 10/300 GL עמודה עם המאגר E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
  3. צנטריפוגה המדגם עם 21,130 x g במשך 15 דקות, להסיר כל משקעים לטעון את supernatant לעמודה SEC.
  4. השווה את תמונות הכרומטוגרפיה של ה- SEC של מדגם הרכבת N:RNA ודגימת בקרת N0P, שלב את יחס A260/A280 כדי לזהות אילו פסגות הן N-RNA המורכב, N0P ו- RNA חינם.
  5. לאסוף את שברי השיא, להפעיל את ג'ל SDS-PAGE, או לעשות רשתות.
  6. עבור הרכבה N-RNA קומפלקס, לאסוף את כל השברים של שיא N-RNA, לעשות את החילוץ RNA ולהפעיל את ג'ל Urea-PAGE כדי לבדוק שוב את אורך RNA ספציפי, אשר זהה מעורב דגירה בשלב הראשון.

4. ביצוע רשתות כתמים שליליות

הערה: מיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) היא שיטה שבה המולקולות נספגות לסרט פחמן ולאחר מכן מוטבעות בשכבה של אטומי מתכת כבדה. כתם שלילי EM מייצר ניגודיות תמונה גבוהה, מה שהופך אותו קל לראות וליישר בחישוב את החלקיקים. יתרון נוסף הוא שספיחת החלקיקים לסרט פחמן בדרך כלל גורם למולקולות לדבוק ברשת עם מעט אוריינטציות מועדפות. כאשר המולקולות נמצאות בכיוון דומה, קל להפריד אותן למחלקות נפרדות מבחינה מבנית. כתם שלילי EM היא אפוא הטכניקה המתאימה להנחות הכנת מדגם25,26 (איור 3).

  1. מיקרוגל או חום 5 מל של ddH2O ב זכוכית קטנה באמצעות תנור טונגסטן עד שהוא רותח.
  2. שוקלים 37.5 מ"ג של אורניל formate ומוסיפים 5 מ"ל של ddH מחומם2O כדי להפוך 0.75% אורניל formate כתם פתרון. מערבבים תחת מכוסה מכוסה רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  3. מוסיפים 4 μL של 10 M NaOH לפתרון הכתמים וממשיכים לבחוש במשך 15 דקות, מוגן מפני האור.
  4. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מ"מ למבחנה.
  5. השתמש פריקה זוהרת כדי להפוך את רשתות EM מצופה פחמן מתמשך הידרופילי27.
    הערה: הרשתות ממוקמות בתוך תא המחובר לספק כוח. כאשר מתח גבוה מוחל, הגז בתוך התא מיינן, ואת היונים טעונים שלילית להפקיד על רשתות הפחמן כדי להפוך אותם הידרופילי.
  6. חותכים ומקפלים רצועת פארפילם. Pipet 2 טיפות של 40 μL של החיץ בצד אחד של parafilm, ו pipet עוד 2 טיפות של 40 μL של פתרון כתמים לצד השני.
  7. כדי להפוך את רשתות פחמן EM, להחיל 3 μL של דגימת חלבון במשך 1 דקה.
  8. למחוק את הרשתות נגד נייר סופג.
    הערה: הרשתות נשטפות 2x עם חיץ, ו 1x עם 0.75% uranyl formate כתם פתרון נמחק לאחר כל צעד.
  9. החזק את משטח הרשת בירידה השנייה של 0.75% פתרון הכתמת אורניל formate במשך 30 שניות.
  10. כתם את הרשת נגד נייר סופג כדי להסיר תמיסת כתם עודף ולאפשר לרשת להתייבש באוויר.
  11. אחסן את הרשתות בתיבת הרשת לפני הדימות.

תוצאות

טיהור חלבון N0P נטול RNA
עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג קומפלקס RSV N0P הטרודימרי מסיס בקנה מידה גדול. האורך המלא של חלק N ו- N מסוף של חלבוני P באו לידי ביטוי במשותף עם 10X His-Tag על חלבון N ב E. coli. N 0 Pטוהרבאמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללת קובלט, חילופי יון וגודל. N0P מכיל ה...

Discussion

המבנים הידועים דמויי nucleocapsid חלקיקים (NCLP) של וירוסי RNA שליליים (NNS) ללא סגמנטים מראים כי NCLPs התאספו הם N מורכב עם RNAs הסלולר המארח כאשר overexpressed במערכות ביטוי חיידקי או אוקריוטי15,16,17,18,19. מחקרים קודמים ניסו ל...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

תוכניות המחקר במעבדת ליאנג באמורי נתמכות על ידי המכון הלאומי האמריקאי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרס R01GM130950, וקרן הסטארט-אפ למחקר בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. המחבר מכיר בחברי מעבדת ליאנג לתמיכה מועילה ודיון ביקורתי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSIgmaA9539-500Gmaking construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitMilliporeUFC901024concentrate the protein sample
Ampicillin sodiumGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317Aantibiotic for cell culture
AseINEBR0526Smaking construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose BeadsGold BioH-310-500For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBHeate the sample
dCTPInvitrogen10217016making construct using LIC method
dGTPInvitrogen10218014making construct using LIC method
GlycerolSigmaG5516-4Lmaking solution
HEPESSigmaH3375-100Gmaking solution
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Protein purification
ImidazoleSigmaI5513-100Gmaking solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Ainduce the expression of protein
Microcentrifuge TubesVWR47730-598for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid ProcessorSpectraLabMSX-XL-2020sonicator for lysing cell
Negative stain gridsElectron Microscopy SciencesCF400-Cu-THFor making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 SubstituteSigma74385-1Lmaking solution
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706Purify DNA
SSPI-HFNEBR3132Smaking construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Protein purification
T4 DNA polymeraseSigma70099-3making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus CentrifugeFisher Scientific36-101-0816Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochlorideSigmaT3253-250Gmaking solution
Uranyl FormateElectron Microscopy Sciences22451making negative stain solution

References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173RSVRNANC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved