موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Summary

هنا نقدم طريقة للتعبير عن بروتينات الهستون الأسيتية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية وتجميع النيوكليوسومات المعاد تشكيلها في المختبر.

Abstract

يمكن التعبير بسهولة عن بروتينات الهستون الأسيتية في الإشريكية القولونية ترميز متحولة، N^ε-أسيتيل ليسين (AcK) محددة ميتانوساركينا مازي بيروليسين tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ورنا cognate (tRNA^Pyl)لتجميع الرتابات المعاد تشكيلها مع الهستونات المحددة الموقع. MmAcKRS1 و TRNA^Pyl تسليم ACK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدمج AcK في مواقع ال ليسين H3. يمكن أيضا أن تتطور بسهولة بيروليسيل-TRNA synthetase (PylRS) لدمج الأحماض الأمينية غير الكانانية الأخرى (ncAAs) لتعديل البروتين محددة الموقع أو وظيفية. هنا نحن بالتفصيل طريقة لدمج AcK باستخدام نظام MmAcKRS1 في H3 الهستون ودمج البروتينات H3 أسيتيلاتيد في mononucleosomes المعاد تشكيلها. يمكن استخدام أحاديات النوكليوسومات المعاد تشكيلها في المقايسات الكيميائية الحيوية والملزمة ، وتحديد الهيكل ، وأكثر من ذلك. يعد الحصول على النويدات أحادية النواة المعدلة أمرا حاسما لتصميم التجارب المتعلقة باكتشاف تفاعلات جديدة وفهم علم الوراثة اللاجينية.

Introduction

لقد استخدمنا PylRS و TRNA^Pyl لتجميع وتجميع mononucleosomes المعاد تشكيلها مع الهستونات الأسيتيlated الموقع محددة. وقد ثبت PylRS لا تقدر بثمن كأداة لتوسيع الشفرة الوراثية لإنتاج البروتينات مع تعديلات ما بعد التحويل (PTMs) وتطورت وراثيا لدمج حوالي 200 ncAAs مختلفة. PylRS يدمج في وقف الكهرمان codon، وإزالة المنافسة من الأحماض الأمينية الأخرى أثناء الترجمة. تم اكتشاف PylRS لأول مرة في archaea الميثانوجينية ، ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في البيولوجيا الكيميائية لدمج مجموعات كيميائية تفاعلية جديدة في البروتينات^1،2.

تم تطوير MmAcKRS1 من ميتانوساركينا مازي PylRS وكثيرا ما تستخدم في مختبرنا لتركيب البروتينات الأسيتيلاتيد^3،4،5،6. MmAcKRS1 يسلم AcK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدمج ACK في K4، K9، K14، K18، K23، K27، K36، K56، K64، و K79 هيستون H3 مواقع ليسين لدراسة نشاط سيرتوين 1، 2، 6، و 7 على mononucleosomes أسيتيلاتيد^4،5،6. هنا نحن بالتفصيل هذه الطريقة للتعبير عن الهستونات أسيتيلاتيد وإعادة تشكيل النيوكليوسومات الأسيتيlated.

Protocol

1. البناء البلازميد

1. تبدأ من خلال تحديد البروتين الهستون الذي سيتم أسيتيلاتيد وفي أي موقع ليسين. تحور الموقع إلى وقف الكهرمان كودون (TAG) باستخدام موقع موجهة mutagenesis.
   ملاحظة: هناك أربعة البلازميدات المصممة سابقا المستخدمة للتعبير عن بروتينات الهستون. تم استنساخ جميع بروتينات الهستون الأربعة في ناقلات pETDuet-1 مع علامة الهستيدين N-terminal. Histone H4 يتضمن أيضا علامة سومو، وأصل colE1 النسخ المتماثل مع عدد نسخة من حوالي 40، ومقاومة الأمبيسلين، ومروج T7.
   1. تصميم التمهيديات إلى الأمام وعكس التي تحتوي على طفرة TAG في الموقع المطلوب (استبدال كودون ليسين القائمة مع codon وقف العنبر) في واحدة من أربعة البلازميدات بروتين الهستون.
   2. استخدام PCR كامل البلازميد لتضخيم TAG التي تحتوي على البلازميد. تحديد درجة حرارة التلين المناسبة للمبرمجين. بشكل عام، فإن درجة حرارة ذوبان (T_m)من التمهيديات ناقص 5 درجة مئوية تكون كافية. إذا واجهت صعوبة في الحصول على منتج PCR ، يمكن استخدام تدرج درجة الحرارة حول T_m - 5 °C لتحسين درجة حرارة التلاحم للتضخيم.
      ملاحظة: في هذه التجربة تم استخدام بوليمرات PFU المعبر عنها داخليا لمدة 30 دورة مع الشروط التالية: 94 درجة مئوية لمدة 30 s (التشبع)، ودرجة حرارة التلين لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق (أو دقيقة واحدة لكل كيلوبيس-أزواج). لمزيد من التفاصيل حول هذا النوع من طريقة PCR انظر ليو ونايسميث⁷.
   3. تنظيف المنتج PCR مع مجموعة تنظيف PCR باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تحليل المنتج PCR بواسطة أجاروز هلام الكهربائي وتلطيخ بروميد الإيثيديوم اللاحقة.
   4. Ligate وplasmid عن طريق احتضان مع T4 ligase بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
2. أولا تحويل TAG التي تحتوي على البلازميد (أمبير^R)إلى الإشريكية القولونيةالمختصة كيميائيا . اختيار ما لا يقل عن 4 مستعمرات من التحول وتنقية البلازميد. جعل مخزونات الخلايا من كل مع الجلسرين باستخدام أساليب قياسية وتخزينها في -80 درجة مئوية. أرسل للتسلسل لتأكيد طفرة TAG المطلوبة.
3. بمجرد تأكيد التسلسل ، شارك في تحويل البلازميد المحتوي على TAG (Amp^R)مع pEVOL-AckRS (Chl^R)إلى CobB المختص كيميائيا (الهستون الوحيد ليسين deacetylase المعروف في E. coli.) حذف خلايا BL21 باستخدام طريقة الصدمة الحرارية. pEVOL هو plasmid مع منتصف عدد النسخ إلى انخفاض عدد نسخة p15A الأصل.
   ملاحظة: تم بناء سلسلة pEVOL من البلازميدات استنادا إلى الدراسات السابقة التي أظهرت زيادة التعبير عن الزوج aaRS متعامد / TRNA^Tyr كانت فعالة في خفض اقتطاع البروتين وفي زيادة الغلة الإجمالية للبروتينات متحولة⁸. إذا لم يكن من السهل الوصول إلى خلايا حذف CobB ، فانتقل إلى خلايا BL21 المختصة كيميائيا. CobB هو سيرتوين مثل الهستون ليسين deacetylase ونيكوتيناميد يمكن أن تضاف في التركيز النهائي 5 MM خلال التعبير البروتين الهستون لمنع كوب كنهج بديل⁹.
4. جعل مخزون الخلية وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. أسيتيلاتيد الهستون البروتين التعبير

1. إعداد 1 لتر من الوسائط 2YT autoclaved (أو حجم الاختيار) في قارورة الثقافة.
2. تلقيح 20 مل من وسائط 2YT التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع مخزون الخلايا التي تم تحويلها المشتركة التي تحتوي على البلازميد المحتوي على TAG (أمبير^R)وpEVOL-AckRS (Chl^R)وتنمو عند 37 درجة مئوية إلى OD = 0.6 (4-6 ساعة).
3. إضافة المضادات الحيوية المناسبة إلى 1 لتر من وسائل الإعلام 2YT autoclaved والتطعيم مع ثقافة بداية 20 مل. تنمو عند 37 درجة مئوية إلى OD = 0.6-0.8 (2-3 ساعة).
4. إضافة عوامل تحريضية والأستيتيل (AcK) إلى التركيزات النهائية من IPTG 1 mM, 0.2٪ أرابينوس, وAcK 5 mM.
5. تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة.
6. الكريات الخلايا في 2700 س ز لمدة 15 دقيقة.
7. تخزين بيليه الخلية في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
8. من هذه الخطوة فصاعدا إبقاء العينة على الجليد في جميع الأوقات. حل بيليه الخلية في 50 مل من العازلة تحلل الهستون لكل 1 لتر من الثقافة.
9. Sonicate وفقا للدورة التالية: 1 ق على، 1 ق قبالة، المجموع في الوقت المحدد: 3 دقيقة في 60٪ السعة.
10. بيليه إدراج الهيئات في 41600 × غرام لمدة 45 دقيقة.
11. تجاهل الهيئات إدراج supernatant وإعادة الإنفاق في 30 مل من العازلة تحلل الهستون. بيليه إدراج يبشر في 41600 × ز لمدة 30 دقيقة.
12. تجاهل الهيئات إدراج supernatant وإعادة الإنفاق في 30 مل من العازلة غسل بيليه. بيليه إدراج الهيئات في 41600 × غرام لمدة 30 دقيقة.
13. تجاهل الهيئات فائقة التناسل وتذوب إدراج في 25 مل من 6 م جوانيدين هيدروكلوريد (GuHCl) العازلة. احتضان مع التحريض في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن احتضان هيئات الإدماج مع التحريض بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
14. بيليه إدراج يبشر في 41600 × ز لمدة 45 دقيقة. احتضان supernatant مع 1 مل من راتنج ني-NTA متساوية مع 6 M GuHCl العازلة لمدة 2 ساعة.
15. المضي قدما في تنقية Ni-NTA في ظل ظروف مشوهة. اغسل العمود ب 3 وحدات تخزين عمود من المخزن المؤقت لغسل العمود. Elute بروتين الهستون الأسيتي مع 10 مل من العازلة elution.
    ملاحظة: محاولة تركيز البروتين هنا هو خيار ولكن الهستونات الأسيتيlated لا يمكن التنبؤ بها جدا ويمكن أن تعجل بسهولة. لا ينصح بالتركيز على 2 مل في الحجم الإجمالي.
16. dialyze على نطاق واسع بروتين الهستون أسيتيلاتيد ضد 5٪ حمض الخليك العازلة لإزالة الأملاح. Dialyze لمدة 3 ساعة في وقت واحد في 4 درجة مئوية، وتبادل لعازلة جديدة لا تقل عن 6 مرات.
    ملاحظة: لتحسين نقاء البروتين، هناك خيار ل dialyze ضد المياه النقية. ومع ذلك، وهذا يسبب هطول الأمطار كبيرة وانخفاض في الغلة التي قد تكون غير مرغوب فيها لبروتينات الهستون الأسيتيلاتيد منخفضة الغلة.
17. الكوت والليوفليزي البروتين، وتخزينها إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية. البرية نوع البروتينات الهستون تسفر عموما 10-50 ملغ / لتر في حين أن بروتينات الهستون الأسيتيlated تسفر عن أقل من 10 ملغ / لتر اعتمادا على موقع اليسين محددة. على سبيل المثال، يبلغ متوسط H3K79Ac 5 ملغم/لتر.

3. البرية نوع الهستون البروتين التعبير

1. لتجميع النوى الكاملة، والتعبير عن جميع البروتينات الهستون 4. عند التعبير عن وتنقية نوع البرية histones البروتوكول هو نفسه كما هيستونات أسيتيلاتيد باستثناء ما يلي:
   1. لا تقم بإجراء التحويل المشترك. لا تستخدم pEVOL-AcKRS للتعبير عن الهستون نوع البرية. ضبط المضادات الحيوية وفقا لذلك.
   2. لا تستخدم خط الخلية حذف كوب أو إضافة نيكوتيناميد، AcK، أو أرابينوس أثناء تحريض التعبير الخلوي.

4. إعداد الحمض النووي 601

ملاحظة: تم تجميع تسلسل الحمض النووي الأمثل المصمم مسبقا لتحديد المواقع النيوكليوسوم المباشر مع ثمانيات الهستون لإنتاج مونونوكليوسوم بكفاءة عالية. ويشار إلى هذا التسلسل باسم 601 DNA أو تسلسل Widom. وقد أصبح هذا التسلسل تسلسل الحمض النووي القياسية للدراسات المختبرية من النيوكليوسومات من الكروماتين إعادة عرض المقايسات لقياس جزيء واحد¹⁰.

1. لإعداد كميات كبيرة من الحمض النووي 601 للتجميع النيوكليوسوم، تحويل pGEM-3z/601 إلى أعلى 10 خلايا وتنمو 10 مل من الثقافة لتضخيم البلازميد واستخراج. استخدام عدة استخراج البلازميد واتبع توصية الشركة المصنعة.
2. استخدام البوليمرات PFU أعرب في المنزل (أكثر كفاءة) لهذا البروتوكول تضخيم. إعداد تفاعل PCR: لتفاعل 250 ميكرولتر، استخدام 207.5 ميكرولتر autoclaved MQ_{H 2}O، 25 ميكرولتر 10x PFU العازلة، 5 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام: ctggagaatcccgggccg، 5 ميكرولتر عكس التمهيدي: acaggatgtatatatctgacg، 5 ميكرولتر مزيج DNTP، 2.5 ميكرولتر إنزيم PFU. نحن عادة تشغيل 60 ردود الفعل في وقت واحد للحصول على ما يكفي من الحمض النووي لتجميع.
3. استخدام درجة حرارة التلين من 52 درجة مئوية لمدة 30 ق وفترة تمديد 30 ق إذا باستخدام البوليميراز PFU. وإلا اتبع الشروط الموصى بها من قبل الشركات المصنعة.
4. وبمجرد الانتهاء من PCR، استخدم مجموعة تنظيف PCR من الاختيار لتنقية المنتج PCR.

5. جمعية اوكتامر الهستون

1. حل aliquots من الكريات البروتين الهستون H2A، H2B، H3، وH4 بحيث يكون هناك مخزون منفصل من كل بروتين الهستون في مخزن GuHCl مع حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
2. حساب تركيز كل بروتين الهستون عن طريق قياس امتصاص_{A 280.}
3. إذا كان الامتصاص أكبر من 1 لأي بروتين، تخفيف مع العازلة GuHCl للحصول على تركيز أكثر دقة.
4. الجمع بين H2A و H2B البروتينات في نسبة الضرس 1:1 وتمييع إلى تركيز البروتين الكلي من 4 ميكروغرام / ميكرولتر. كرر لH3 و H4.
5. Dialyze بالتسلسل عند 4 درجة مئوية مقابل 2 M TE العازلة بين عشية وضحاها، 1 M TE العازلة لمدة 2 ساعة و 0.5 M TE العازلة لمدة 5 ساعة.
   ملاحظة: الخطوات الثانية والثالثة من غسيل الكلى يسبب تشكيلات غير مستقرة من البروتين لتسريع بها. ومن المتوقع أن تشهد هطول الأمطار الغزيرة في هذه الخطوات.
6. إزالة الترسبات عن طريق الطرد المركزي عند 16,800 × ز عند 4 °C.
7. مرة أخرى، حساب تركيز ديمرات الهستون (خليط H2A/H2B) و tetramers (خليط H3/H4) قياس امتصاص A_280.
8. مزيج dimers و tetramers في نسبة 1:1 الضرس وضبط NaCl إلى 2 M بإضافة NaCl الصلبة.
9. يمكن تخزين ثماني الهستون عند 4 درجة مئوية وهو أكثر استقرارا من الدامرات والتترامرات. أبدا تجميد ثماني الهستون لأن هذا يمكن أن يسبب تفكيك.
10. إذا تجميع مع الهستونات الأسيتيlated، ببساطة استبدال البروتين نوع البرية مع البروتين الأسيتيلاتيد في الإجراء.

6. التجمع النوى

1. استخدم 100x TE العازلة وNaCl الصلبة لضبط 601 الحمض النووي إلى 2M TE العازلة. أضف الحمض النووي 601 في 2M TE العازلة إلى ثماني الهستون في نسبة الضرس من 0.85:1 إلى 0.90:1. يمكن إضافة نسبة أقل من الحمض النووي إذا كان الحمض النووي المجاني موجودا في تحليل تحول الجل.
2. نقل خليط الحمض النووي-الهستون كيس غسيل الكلى ومكان في حوالي 200 مل من العازلة TE 2M (أو أكثر إذا تجميع عينات متعددة) ويحرك بلطف جدا في 4 درجة مئوية.
3. تعيين مضخة التجذم لتطهير بالتنقيط ببطء في أي عازلة TE الملح. عندما يتضاعف حجم تقريبا، صب من نصف حجم. القيام بذلك على الأقل 4 مرات في المجموع. مع مضخة هذا يمكن أن يستغرق 4-8 ساعة اعتمادا على حجم البداية. تتشكل النيوكليوسومات عندما ينخفض تركيز الملح إلى 150 مليون متر (يقاس بمقياس الملوحة).
4. بعد تقليل تركيز الملح إلى 150 mM، dialyze ضد 20 متر TE العازلة بين عشية وضحاها.
5. إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي وقياس تركيز النوى من قبل قراءة_{A 260} باستخدام قارئ لوحة.
6. إضافة له-TEV protease (TEV: نوى 1:30, ث:ث) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C لإزالة جميع العلامات الهستيدين. إزالة الشوائب العلامة الهستيدين من الحل النيوكليوسوم بواسطة راتنج ني-NTA سحب إلى أسفل.
7. لوضع النوى وتجانس العينة، واحتضان في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: بالنسبة للمواقع التي تم تحديدها بشكل خاص غير مستقرة، قد لا تكون هذه الخطوة مستحسنة.
8. تخزين النوى على المدى القصير (بضعة أسابيع) في 4 °C.
9. للتخزين على المدى الطويل، النوى dialyze ضد المخزن المؤقت وتخزينها في -80 درجة مئوية.

النتائج

يمكن تقييم الديمرات والتترامر والأوكتامات عن طريق تشغيل هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ (الشكل 1 والشكل 2). هنا يمكنك أن ترى أن بعض tetramers أسيتيلاتيد لديها عائد أقل من غيرها(الشكل 1). في الواقع، كلما اقتربنا من المنطقة الأساسية، انخفض ال?...

Discussion

من الضروري اتباع هذا البروتوكول بكل التفاصيل أثناء التجربة. النوى ليست مستقرة جدا والكثير من التجربة والخطأ قد ذهب إلى تحديد هذا البروتوكول. من المهم إزالة الرواسب في كل خطوة (أو كلما لوحظ) لأن الجسيمات يمكن أن تتداخل بسهولة مع عمليات التجميع. دائما احتفظ بعينات الهستون على الثلج إذا تم تخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler