אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לבטא חלבוני histone אצטילאט באמצעות הרחבת קוד גנטי להרכיב נוקלאוזומים מחדש במבחנה.

Abstract

חלבוני histone אצטילאט יכול לבוא לידי ביטוי בקלות ב Escherichia coli קידוד מוטציה, N^ε-אצטיל-ליצין (AcK) ספציפי מתנוסרצ'ינה מזי פירוסין tRNA-סינתטאז (MmAcKRS1) ו tRNA קוגנטיבי שלה (tRNA^Pyl)להרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטון אצטילאט ספציפי לאתר. MmAcKRS1 ו- tRNA^Pyl מספקים AcK באתר מוטציה ענבר ב mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia coli. טכניקה זו שימשה בהרחבה כדי לשלב AcK באתרי ליזין H3. סינתזת Pyrrolysyl-tRNA (PylRS) ניתן גם להתפתח בקלות לשלב חומצות אמינו לא קאנוניות אחרות (ncAAs) עבור שינוי חלבון ספציפי לאתר או פונקציונליזציה. כאן אנו מפרטים שיטה לשלב AcK באמצעות מערכת MmAcKRS1 לתוך H3 histone ולשלב חלבוני H3 אצטילאט לתוך mononucleosomes מחדש. מונונוקלאוזומים משוחזרים אצטילאטים יכולים לשמש מבחנים ביוכימיים ומחייבים, קביעת מבנה ועוד. השגת מונונוקלאוזומים מותאמים היא חיונית לתכנון ניסויים הקשורים לגילוי אינטראקציות חדשות והבנת אפיגנטיקה.

Introduction

השתמשנו ב-PylRS וב-tRNA^Pyl כדי לסנתז ולהרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטוני אצטילציה ספציפיים לאתר. PylRS הוכיחה את עצמה ככלי להרחבת קוד גנטי לייצור חלבונים עם שינויים לאחר תרגום (PTMs) והתפתחה גנטית כדי לשלב כ -200 ncAAs שונים. PylRS משלבת בקודון עצירת ענבר, הסרת תחרות מחומצות אמינו אחרות במהלך התרגום. PylRS התגלה לראשונה בארכיאולוגיה מתנוגנית, ומאז נוצל בביולוגיה כימית כדי לשלב קבוצות כימיות תגובתיות חדשניות לחלבונים^1,2.

MmAcKRS1 התפתח מ מתנוזרצ'ינה mazei PylRS ומשמש לעתים קרובות במעבדה שלנו לסינתזה של חלבונים acetylated^3,4,5,6. MmAcKRS1 מספק AcK באתר מוטציה ענבר mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia קולי. טכניקה זו שימשה בעבר לשלב AcK ב K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, ו K79 היסטון H3 לידין אתרים ללמוד את הפעילות של Sirtuin 1, 2, 6, ו 7 על מונונוקלאוזומים acetylated^4,5,6. כאן אנו מפרטים שיטה זו כדי להביע היסטונים אצטילאטים ו לבנות מחדש נוקלאוזומים acetylated.

Protocol

1. בניית פלסמיד

1. התחילו בהחלטה איזה חלבון היסטון יהיה אצטילאט ובאיזה אתר ליסטין. מוטציה האתר כדי לעצור ענבר קודון (TAG) באמצעות mutagenesis מכוון האתר.
   הערה: ישנם ארבעה פלסמידים שתוכננו בעבר מנוצלים לביטוי של חלבוני היסטון. כל ארבעת חלבוני ההיסטון שוכפלו לווקטור pETDuet-1 עם תג היסטידין N-terminal. Histone H4 כולל גם תג SUMO, המקור של colE1 שכפול עם מספר עותק של כ 40, אמיטצילין עמיד, ו מקדם T7.
   1. עצבו פריימרים קדמיים ומתהווכים המכילים מוטציית TAG באתר הרצוי (החלפת קודון ליצין קיים בקודון עצירת הענבר) באחד מארבעת פלסמידי החלבון של היסטון.
   2. השתמש ב- PCR שלם כדי להגביר את התג המכיל פלסמיד. קבעו טמפרטורת חישול מתאימה לפריימרים. באופן כללי, טמפרטורת ההיתוך (T_m)של פרייומרים מינוס 5 מעלות צלזיוס יהיה מספיק. אם יש קושי בהשגת מוצר PCR, ניתן להשתמש במעבר טמפרטורה סביב T_m - 5 °C (60 °F) כדי למטב את טמפרטורת חישול להגברה.
      הערה: בניסוי זה פולימראז PFU מבוטא בתוך הבית שימש במשך 30 מחזורים עם התנאים הבאים: 94 °C (94 °C (30 s (denaturation), חישול טמפרטורה עבור 30 s, ו 72 °C (6 דקות (או 1 דקה לקילו-בייס-זוגות). לפרטים נוספים על סוג זה של שיטת PCR ראו ליו ונייסמית'⁷.
   3. נקה את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR על-ידי ביצוע פרוטוקול היצרן. לנתח את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose וכתמים אתידיום ברומיד הבאים.
   4. Ligate פלסמיד על ידי דגירה עם T4 ligase לילה ב 16 °C (66 °F).
2. ראשית להפוך את תג המכיל פלסמיד (Amp^R)לתוך כימית מוסמך Escherichia coli. בחר מינימום של 4 מושבות מהשינוי ולטהר את הפלסמיד. הפוך את מלאי התאים של כל אחד עם גליצרול בשיטות סטנדרטיות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. שלח רצף כדי לאשר את המוטציה הרצויה TAG.
3. לאחר שהרצף מאושר, הפוך במשותף את הפלסמיד המכיל תג (Amp^R)עם pEVOL-AckRS (Chl^R)לקובB בעל יכולת כימית (הליסין deacetylase ההיסטון היחיד הידוע בתאי BL21 E. coli). pEVOL הוא פלסמיד עם מספר עותק בינוני למקור p15A בעל העתקה נמוכה.
   הערה: סדרת pEVOL של פלסמידים נבנו בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו ביטוי מוגבר של זוג aaRS / tRNA^Tyr אורתוגונלי היה יעיל בהפחתת חיתוך חלבון ובהגדלת התפוקה הכוללת של חלבונים מוטנטים⁸. אם תאי מחיקה של CobB אינם נגישים, המשך עם תאי BL21 בעלי יכולת כימית. CobB הוא ליצרין ליצרין דמוי סירטואין וניקוטינמיד ניתן להוסיף בריכוז סופי של 5 מ"מ במהלך ביטוי חלבון היסטון כדי לעכב את CobB כגישה חלופית⁹.
4. הפוך מלאי תא ולאחסן ב -80 °C (69 °F).

2. ביטוי חלבון histone אצטילאט

1. הכן 1 L של מדיה 2YT autoclaved (או נפח של בחירה) בבקבוק תרבות.
2. לחסן 20 מ"ל של 2YT מדיה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה עם מלאי תאים טרנספורמציה משותפת כי יש פלסמיד המכיל תג (Amp^R)ו pEVOL-AckRS (Chl^R)ולגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6 (4-6 שעות).
3. הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה ל-1 ליטר של מדיה 2YT אוטומטית וחסן עם תרבות המתנע של 20 מ"ל. לגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6-0.8 (2-3 שעות).
4. הוסף סוכני גרימת אצטיליסין (AcK) לריכוזים הסופיים של IPTG 1 מ"מ, 0.2% arabinose, ו AcK 5 mM.
5. לגדל את התרבות ב 37 °C (67 °F) עבור 6-8 שעות.
6. כדורי תאים ב 2,700 x g במשך 15 דקות.
7. לאחסן את גלולת התא ב -80 מעלות צלזיוס לילה.
8. מצעד זה ואילך לשמור את המדגם על הקרח כל הזמן. להמיס את גלולת התא ב 50 מ"ל של מאגר תמוגה היסטון לכל 1 L של תרבות.
9. Sonicate על פי המחזור הבא: 1 s על, 1 הנחה, סה"כ בזמן: 3 דקות ב 60% משרעת.
10. גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 45 דקות.
11. השלך את גופי ההכללה העל-טבעיים וההתחדשות ב- 30 מ"ל של מאגר תמוגה של היסטון. גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 30 דקות.
12. השלך את גופי הכללה supernatant ו resuspend ב 30 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה. גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 30 דקות.
13. להשליך את גופי הכללה supernatant ולהמיס ב 25 מ"ל של 6 M Guanidine הידרוכלוריד (GuHCl) חיץ. דגירה עם עצבנות ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות.
    הערה: במידת הצורך, גופי הכללה ניתן לדגור עם עצבנות לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
14. גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 45 דקות. דגירה supernatant עם 1 מ"ל של שף Ni-NTA שווה עם 6 M GuHCl חיץ עבור 2 שעות.
15. המשך עם טיהור Ni-NTA בתנאים מפורקים. שטפו את העמודה עם נפח של 3 עמודות של מאגר שטיפת עמודות. חלבון histone Elute עם 10 מ"ל של חיץ אלוטיון.
    הערה: ניסיון לרכז את החלבון כאן הוא אופציה אבל היסטוני אצטילציה הם מאוד בלתי צפויים והוא יכול בקלות לזרז. לא מומלץ להתרכז מעבר ל-2 מ"ל בנפח הכולל.
16. דיאליז נרחב חלבון histone אצטילאט נגד 5% חומצה אצטית חוצץ כדי להסיר מלחים. Dialyze עבור 3 שעות בכל פעם ב 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ טרי מינימום של 6 פעמים.
    הערה: לשיפור טוהר החלבון, קיימת אפשרות לחייג נגד מים טהורים. עם זאת, זה גורם משקעים משמעותיים וירידה בתפוקה אשר עשוי להיות לא רצוי עבור חלבונים histone אצטילציה בתשואה נמוכה.
17. Aliquot ו lyophilize חלבון, ולאחסן ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס. חלבוני היסטון מסוג פראי מניבים בדרך כלל 10-50 מ"ג/ל' ואילו חלבוני היסטון עם אצטילאט מניבים פחות מ-10 מ"ג/ליטר בהתאם לאתר הליצין הספציפי. לדוגמה, H3K79Ac ממוצעים 5 מ"ג / ליטר.

3. ביטוי חלבון היסטון מסוג פראי

1. להרכבת נוקלאוזומים מלאים, יש לבטא את כל 4 חלבוני ההיסטון. כאשר מבטאים ומטהרים היסטונים מסוג פראי הפרוטוקול זהה להיסטוני האצטילאט למעט הדברים הבאים:
   1. אל תבצע המרה משותפת. אין להשתמש ב- pEVOL-AcKRS עבור ביטוי histone מסוג בר. התאימו אנטיביוטיקה בהתאם.
   2. אין להשתמש בקו תא מחיקה של CobB או להוסיף Nicotinamide, AcK או arabinose במהלך אינדוקציה של ביטוי תאי.

4. הכנת 601 DNA

הערה: רצף דנ"א ממוטב שתוכנן בעבר למיקום נוקלאוזום ישיר מורכב עם תמנוני היסטון כדי לייצר מונונוקלאוזום ביעילות גבוהה. רצף זה נקרא 601 DNA או רצף Widom. רצף זה הפך לרצף הדנ"א הסטנדרטי למחקרי חוץ גופיות של נוקלאוזומים ממסיעות שיפוץ כרומטין למדידות מולקולה אחת¹⁰.

1. כדי להכין כמויות משמעותיות של 601 DNA להרכבה גרעינית, להפוך pGEM-3z/601 לתוך למעלה 10 תאים ולגדול 10 מ"ל של תרבות עבור הגברה פלסמיד ומיצוי. השתמש בערכת חילוץ פלסמיד ופעל בהתאם להמלצת היצרן.
2. השתמש בפולימראז PFU מבוטא בתוך הארגון (יעיל יותר) עבור פרוטוקול הגברה זה. הגדר תגובת PCR: לתגובת 250 μL, להשתמש 207.5 μL autoclaved MQ H₂O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL קדימה פריימר: ctggagaatccctggccg, 5 μL הפוך פריימר: acaggatgtatatatctctgacacg, 5 μL dNTP לערבב, 2.5 מיקרול PFU אנזים. אנחנו בדרך כלל רצים 60 תגובות בבת אחת כדי לקבל מספיק DNA להרכיב.
3. השתמש בטמפרטורת חישול של 52 °C (70 °F) עבור 30 s וזמן הארכה של 30 s אם באמצעות פולימראז PFU. אחרת, פעל בהתאם לתנאים המומלצים על-ידי היצרנים.
4. לאחר ש- PCR נעשה, השתמש בערכת ניקוי PCR לבחירתך כדי לטהר את מוצר PCR.

5. הרכבה של אוקטמר היסטון

1. להמיס aliquots של כדורי חלבון histone H2A, H2B, H3, ו H4 כך שיש מלאי נפרד של כל חלבון histone במאגר GuHCl עם נפח כולל של 100 μL.
2. לחשב את הריכוז של כל חלבון histone על ידי מדידת ספיגת A_280.
3. אם הספיגה גדולה מ-1 עבור חלבון כלשהו, יש לדלל עם מאגר GuHCl כדי לקבל ריכוז מדויק יותר.
4. ערבבו חלבוני H2A ו-H2B ביחס טוחנת של 1:1 ודללו לריכוז חלבון כולל של 4 מיקרוגרם/μL. חזרו על הפעולה עבור H3 ו-H4.
5. חייג ברצף ב- 4 °C (70 °F) מול מאגר TE של 2 M למשך לילה, מאגר TE M אחד עבור 2 שעות ומאגר TE של 0.5 M למשך 5 שעות.
   הערה: השלב השני והשלישי של הדיאליזה גורם קונפורמציות לא יציבות של חלבון לזרז החוצה. הוא צפוי לראות משקעים כבדים בשלבים אלה.
6. הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ב 16,800 x g ב 4 מעלות צלזיוס.
7. שוב, לחשב את הריכוז של דימרים histone (תערובת H2A / H2B) ו tetramers (תערובת H3/H4) מדידת ספיגת A_280.
8. מערבבים דימרים וטטרמה ביחס טוחנת של 1:1 ומתאימים את NaCl ל-2 מ' על ידי תוספת של NaCl מוצק.
9. תמנון Histone ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס והוא יציב יותר מאשר dimers ו tetramers. לעולם אל תקפיא את תמנון היסטון מכיוון שזה יכול לגרום לפירוק.
10. אם הרכבה עם היסטוני אצטילאט, פשוט להחליף את החלבון סוג הבר עם חלבון אצטילאט בהליך.

6. הרכבה נוקלאוזום

1. השתמש במאגר TE 100x וב- NaCl מלא כדי להתאים 601 דנ"א למאגר TE של 2M. הוסף את ה- DNA של 601 במאגר TE של 2M לתמנון histone ביחס טוחנת של 0.85:1 ל- 0.90:1. ניתן להוסיף יחס נמוך יותר של דנ"א אם קיים דנ"א חופשי בניתוח משמרת הג'ל.
2. מעבירים את תערובת הדנ"א-histone לשקית דיאליזה ומניחים כ-200 מ"ל של מאגר TE 2M (או יותר אם מרכיבים דגימות מרובות) ומערבבים בעדינות רבה ב-4 מעלות צלזיוס.
3. הגדר משאבה פריסטלית לטיהור כדי לטפטף באיטיות ללא מאגר TE מלח. כאשר עוצמת הקול הוכפלה בערך, שפוך חצי מעוצמת הקול. עשה זאת לפחות 4 פעמים בסך הכל. עם משאבה זה יכול לקחת 4-8 שעות בהתאם לנפח ההתחלה. גרעינים נוצרים כאשר ריכוז המלח מצטמצם ל-150 מ"ר (נמדד על ידי מד מליחות).
4. לאחר ריכוז המלח מצטמצם ל 150 מ"מ, dialyze נגד מאגר TE 20 מ"מ לילה.
5. הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ולמדוד את הריכוז של הגרעינים על ידי קריאה_{A 260} באמצעות קורא צלחת.
6. הוסף פרוטאז His-TEV (TEV: נוקלאוזום 1:30, w:w) ודגר לילה ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל תגי היסטידין. הסר את זיהומים תג היסטידין מתמיסת הגרעין על ידי שף Ni-NTA למשוך למטה.
7. כדי למקם את הגרעין הומוגנית המדגם, דגירה ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות.
   הערה: עבור אתרים עם אצטילאט שאינם יציבים במיוחד, ייתכן שצעד זה לא מומלץ.
8. יש לאחסן גרעינים לטווח קצר (כמה שבועות) ב-4 מעלות צלזיוס.
9. לאחסון לטווח ארוך, נוקלאוזומים dialyze נגד מאגר אחסון ולאחסן ב -80 °C (60 °F).

תוצאות

ניתן להעריך דימרים, טטרמרים ושמיניות על ידי הפעלת ג'ל SDS PAGE של 12%(איור 1 ואיור 2). כאן ניתן לראות שלחלק מהטטרמרים בעלי האצטילאט יש תשואה נמוכה יותר מאחרים (איור 1). למעשה, ככל שאזור הליבה קרוב יותר לאזור הליבה, כך התשואה נצפתה נמ?...

Discussion

זה חיוני כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה בכל פרט במהלך ניסוי. Nucleosomes אינם יציבים מאוד הרבה ניסוי וטעייה נכנסה לתוך קביעת פרוטוקול זה. זה המפתח להסרת משקעים בכל שלב (או בכל פעם שנצפה) כי חלקיקים יכולים בקלות להפריע לתהליכי ההרכבה. תמיד לשמור דגימות היסטון על קרח. אם נוקלאוזומים מאוחסנים ב 4 מעלות צל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler