Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.

Résumé

Les protéines histones acétylées peuvent être facilement exprimées dans Escherichia coli codant pour un mutant, N^ε-acétyl-lysine (AcK)-methanosarcina mazi pyrrolysine ARNt-synthétase (MmAcKRS1) et son ARNt apparenté (ARNt^Pyl)pour assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. MmAcKRS1 et tRNA^Pyl délivrent AcK à un emplacement ambré de mutation dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été largement utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine H3. La pyrrolysyl-ARNt synthétase (PylRS) peut également être facilement évoluée pour incorporer d’autres acides aminés non canoniques (NCAAs) pour la modification ou la fonctionnalisation des protéines spécifiques au site. Ici, nous détaillons une méthode pour incorporer AcK en utilisant le système MmAcKRS1 dans l’histone H3 et intégrer les protéines H3 acétylées dans les mononucléosomes reconstitués. Les mononucléosomes reconstitués acétylés peuvent être utilisés dans les tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour concevoir des expériences liées à la découverte de nouvelles interactions et à la compréhension de l’épigénétique.

Introduction

Nous avons utilisé PylRS et tRNA^Pyl pour synthétiser et assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. PylRS s’est avéré inestimable en tant qu’outil d’expansion du code génétique pour produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles (PTM) et a été génétiquement évolué pour incorporer environ 200 NCA différents. PylRS incorpore au codon ambré, éliminant la concurrence d’autres acides aminés pendant la traduction. PylRS a été découvert pour la première fois dans les archées méthanogènes, et a depuis été utilisé en biologie chimique pour incorporer de nouveaux groupes chimiques réactifs dans les protéines^1,2.

MmAcKRS1 a été développé à partir de Methanosarcina mazei PylRS et fréquemment utilisé dans notre laboratoire pour la synthèse de protéines acétylées^3,4,5,6. MmAcKRS1 délivre ack à un site de mutation ambrée dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été précédemment utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 et K79 de l’histone H3 afin d’étudier l’activité de la sirtuine 1, 2, 6 et 7 sur les mononucléosomes acétylés^4,5,6. Ici, nous détaillons cette méthode pour exprimer les histones acétylées et reconstituer les nucléosomes acétylés.

Protocole

1. Construction du plasmide

1. Commencez par décider quelle protéine d’histone sera acétylée et à quel site de lysine. Muter l’emplacement au codon ambrique (TAG) utilisant la mutagenèse dirigée par site.
   REMARQUE: Il existe quatre plasmides précédemment conçus utilisés pour l’expression de protéines histones. Chacun des quatre protéines d’histone a été cloné dans le vecteur pETDuet-1 avec une étiquette N-terminale d’histidine. L’histone H4 comprend également une étiquette SUMO, l’origine de la réplication colE1 avec un numéro de copie d’environ 40, résistante à l’ampicilline et un promoteur T7.
   1. Concevoir des amorces avant et arrière qui contiennent une mutation de TAG au site désiré (remplaçant un codon existant de lysine par le codon arrêt ambré) dans l’un des quatre plasmides de protéine d’histone.
   2. Utilisez la PCR à plasmide entier pour amplifier le plasmide contenant le TAG. Déterminez une température de recuit appropriée pour les amorces. En général, la température de fusion (T_m)des amorces moins 5 °C sera suffisante. Si des difficultés sont rencontrées pour obtenir un produit PCR, un gradient de température autour de T_m - 5 °C peut être utilisé pour optimiser la température de recuit pour l’amplification.
      REMARQUE: Dans cette expérience, une PFU polymérase exprimée en interne a été utilisée pendant 30 cycles dans les conditions suivantes: 94 °C pour 30 s (dénaturation), température de recuit pendant 30 s et 72 °C pendant 6 min (ou 1 min par paires kilobase). Pour plus de détails sur ce type de méthode PCR, voir Liu et Naismith⁷.
   3. Nettoyez le produit PCR avec un kit de nettoyage PCR en suivant le protocole du fabricant. Analyser le produit pcr par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration subséquente au bromure d’éthidium.
   4. Ligater le plasmide en incubant avec de la T4 ligase pendant une nuit à 16 °C.
2. Transformez d’abord le plasmide contenant tag (Amp^R)en Escherichia colichimiquement compétent. Choisissez un minimum de 4 colonies de la transformation et purifiez le plasmide. Faites des stocks de cellules de chacun avec du glycérol en utilisant des méthodes standard et stockez à -80 °C. Envoyer pour le séquençage pour confirmer la mutation tag désirée.
3. Une fois la séquence confirmée, co-transformer le plasmide contenant tag (Amp^R)avec pEVOL-AckRS (Chl^R)en CobB chimiquement compétent (la seule histone lysine désacétylase connue dans E. coli.) délétion BL21 cellules en utilisant la méthode de choc thermique. pEVOL est un plasmide dont le nombre de copies est moyen à faible nombre de copies p15A.
   REMARQUE: La série pEVOL de plasmides a été construite sur la base d’études précédentes qui ont montré une expression accrue de la paire orthogonale aaRS / ARNt^Tyr était efficace pour diminuer la troncation des protéines et augmenter les rendements globaux des protéines mutantes^8. Si les cellules de délétion cobB ne sont pas accessibles, procéder avec les cellules BL21 chimiquement compétentes. CobB est une histone de type sirtuine lysine désacétylase et nicotinamide peut être ajouté à une concentration finale de 5 mM au cours de l’expression de la protéine histone pour inhiber CobB comme une approche alternative^9.
4. Faites un stock de cellules et conservez-le à -80 °C.

2. Expression de la protéine d’histone acétylée

1. Préparer 1 L de milieu autoclavé 2YT (ou volume de choix) dans une fiole de culture.
2. Inoculer 20 mL de milieu 2YT contenant les antibiotiques appropriés avec le stock cellulaire co-transformé qui a le plasmide contenant tag (Amp^R)et pEVOL-AckRS (Chl^R) et se développer à 37 °C à OD = 0,6 (4-6 h).
3. Ajouter les antibiotiques appropriés aux 1 L de milieu autoclavé de 2YT et inoculer avec la culture de démarrage de 20 mL. Cultiver à 37 °C à DO = 0,6-0,8 (2-3 h).
4. Ajouter des agents inducteurs et de l’acétyllysine (AcK) aux concentrations finales d’IPTG 1 mM, d’arabinose à 0,2% et d’AcK 5 mM.
5. Cultiver la culture à 37 °C pendant 6-8 h.
6. Cellules granulées à 2 700 x g pendant 15 min.
7. Conservez la pastille cellulaire à -80 °C pendant la nuit.
8. À partir de cette étape, gardez l’échantillon sur la glace en tout temps. Dissoudre le culot cellulaire dans 50 mL de tampon de lyse histone par 1 L de culture.
9. Soniquer selon le cycle suivant: 1 s on, 1 s off, total sur le temps: 3 min à 60% d’amplitude.
10. Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 45 min.
11. Jeter les corps d’inclusion surnageants et ressusciter dans 30 mL de tampon de lyse histone. L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 30 min.
12. Jeter les corps d’inclusion surnageants et remises en suspension dans 30 mL de tampon de lavage de granulés. Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 30 min.
13. Jeter le surnageant et dissoudre les corps d’inclusion dans 25 mL de tampon de chlorhydrate de guanidine 6 M (GuHCl). Incuber avec agitation à 37 °C pendant 1 h.
    REMARQUE: Si nécessaire, les corps d’inclusion peuvent être incubés avec agitation pendant la nuit à 4 ° C.
14. L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 45 min. Incuber le surnageant avec 1 mL de résine Ni-NTA équilibré avec un tampon GuHCl 6 M pendant 2 h.
15. Procéder à la purification ni-NTA dans des conditions dénaturées. Lavez la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon de lavage de colonne. Elute protéine acétylée d’histone avec 10 ml de tampon d’élution.
    REMARQUE: Tenter de concentrer la protéine ici est une option, mais les histones acétylées sont très imprévisibles et peuvent facilement précipiter. Il n’est pas recommandé de se concentrer au-delà de 2 mL en volume total.
16. Dialysez abondamment la protéine d’histone acétylée contre 5% tampon d’acide acétique pour éliminer les sels. Dialyser pendant 3 h à la fois à 4 °C, en échangeant contre un tampon frais au moins 6 fois.
    REMARQUE: Pour une meilleure pureté des protéines, il existe une option pour dialyser contre l’eau pure. Cependant, cela provoque une précipitation importante et une réduction du rendement qui peuvent être indésirables pour les protéines histones acétylées à faible rendement.
17. Aliquote et lyophiliser les protéines et conserver indéfiniment à -80 °C. Les protéines histones de type sauvage donnent généralement 10-50 mg/L tandis que les protéines histones acétylées donnent moins de 10 mg/L selon le site spécifique de lysine. Par exemple, le H3K79Ac est en moyenne de 5 mg/L.

3. Expression de la protéine histone de type sauvage

1. Pour assembler des nucléosomes complets, exprimez les 4 protéines d’histones. Lors de l’expression et de la purification d’histones de type sauvage, le protocole est le même que les histones acétylées, sauf les suivantes:
   1. N’effectuez pas de co-transformation. N’utilisez pas pEVOL-AcKRS pour l’expression d’histones de type sauvage. Ajustez les antibiotiques en conséquence.
   2. N’utilisez pas de lignée cellulaire de délétion cobB et n’ajoutez pas de nicotinamide, d’acK ou d’arabinose pendant l’induction de l’expression cellulaire.

4. Préparation de l’ADN 601

REMARQUE: Une séquence d’ADN optimisée précédemment conçue pour diriger le positionnement des nucléosomes est assemblée avec des octamères d’histones pour produire un mononoyau à haute efficacité. Cette séquence est appelée ADN 601 ou séquence de Widom. Cette séquence est devenue la séquence d’ADN standard pour les études in vitro de nucléosomes, des essais de remodelage de la chromatine aux mesures d’une seule molécule^10.

1. Pour préparer des quantités importantes d’ADN 601 pour l’assemblage de nucléosomes, transformez pGEM-3z/601 en cellules Top 10 et cultivez 10 mL de culture pour l’amplification et l’extraction du plasmide. Utilisez une trousse d’extraction plasmidique et suivez les recommandations du fabricant.
2. Utilisez une PFU polymérase exprimée interne (plus efficace) pour ce protocole d’amplification. Configurer une réaction PCR : Pour une réaction de 250 μL, utilisez 207,5 μL de MQ H₂O autoclavé, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer : ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer : acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL DFU enzyme. Nous exécutons généralement 60 réactions à la fois pour obtenir suffisamment d’ADN pour s’assembler.
3. Utilisez une température de recuit de 52 °C pendant 30 s et un temps d’extension de 30 s si vous utilisez de la PFU polymérase. Sinon, suivez les conditions recommandées par les fabricants.
4. Une fois la PCR terminée, utilisez une trousse de nettoyage par PCR de votre choix pour purifier le produit de PCR.

5. Assemblage de l’octamère des histones

1. Dissoudre les aliquotes des pastilles de protéines histones H2A, H2B, H3 et H4 afin qu’il y ait un stock distinct de chaque protéine histone dans guHCl Buffer avec un volume total de 100 μL.
2. Calculer la concentration de chaque protéine histone en mesurant l’absorbance A_280.
3. Si l’absorbance est supérieure à 1 pour n’importe quelle protéine, diluer avec le tampon GuHCl pour obtenir une concentration plus précise.
4. Combiner les protéines H2A et H2B dans un rapport molaire de 1:1 et diluer pour atteindre une concentration totale en protéines de 4 μg/μL. Répéter pour H3 et H4.
5. Dialyser séquentiellement à 4 °C contre un tampon 2 M TE pendant la nuit, un tampon 1 M TE pendant 2 h et un tampon TE 0,5 M pendant 5 h.
   REMARQUE: Les deuxième et troisième étapes de la dialyse provoquent des conformations instables de protéines à précipiter. On s’attend à de fortes précipitations à ces étapes.
6. Éliminer les précipités par centrifugation à 16 800 x g à 4 °C.
7. Encore une fois, calculer la concentration de dimères histones (mélange H2A/H2B) et de tétramères (mélange H3/H4) en mesurant l’absorbance A_280.
8. Mélanger les dimères et les tétramères dans un rapport molaire de 1:1 et ajuster NaCl à 2 M par l’ajout de NaCl solide.
9. L’octamère histone peut être stocké à 4 °C et est plus stable que les dimères et les tétramères. Ne figez jamais l’octamère des histones car cela peut provoquer un démontage.
10. Si vous assemblez avec des histones acétylées, remplacez simplement la protéine de type sauvage par la protéine acétylée dans la procédure.

6. Assemblage de nucléosomes

1. Utilisez un tampon TE 100x et du NaCl solide pour ajuster l’ADN 601 au tampon 2M TE. Ajouter l’ADN 601 dans le tampon 2M TE à l’octamère des histones dans un rapport molaire de 0,85:1 à 0,90:1. Un rapport inférieur d’ADN peut être ajouté si l’ADN libre est présent dans l’analyse de gel shift.
2. Transférer le mélange ADN-histone dans un sac de dialyse et placer dans environ 200 mL de tampon 2M TE (ou plus si l’assemblage de plusieurs échantillons) et remuer très doucement à 4 °C.
3. Réglez une pompe péristaltique à purger pour qu’elle s’égoutte lentement dans aucun tampon de SEL TE. Lorsque le volume a à peu près doublé, versez la moitié du volume. Faites-le au moins 4 fois au total. Avec une pompe, cela peut prendre 4-8 h en fonction du volume de départ. Les nucléosomes se forment lorsque la concentration en sel est réduite à 150 mM (mesurée par salinitémètre).
4. Une fois la concentration en sel réduite à 150 mM, dialysez-le contre un tampon TE de 20 mM pendant la nuit.
5. Éliminer les précipités par centrifugation et mesurer la concentration des nucléosomes par lecture A₂₆₀ à l’aide d’un lecteur de plaque.
6. Ajouter la protéase His-TEV (TEV : nucléosome 1:30, w:w) et incuber pendant la nuit à 4 °C pour enlever toutes les étiquettes d’histidine. Éliminer les impuretés de l’étiquette histidine de la solution de nucléosome par la résine Ni-NTA tirer vers le bas.
7. Pour positionner le nucléosome et homogénéiser l’échantillon, incuber à 60 °C pendant 1 h.
   REMARQUE: Pour les sites acétylés qui sont particulièrement instables, cette étape peut ne pas être conseillée.
8. Conserver les nucléosomes à court terme (quelques semaines) à 4 °C.
9. Pour le stockage à long terme, dialysez les nucléosomes contre le tampon de stockage et stockez-les à -80 °C.

Résultats

Les dimères, les tétramères et les octamères peuvent être évalués en exécutant un gel PAGE SDS à 12 %(figure 1 et figure 2). Ici, vous pouvez voir que certains des tétramères acétylés ont un rendement inférieur à d’autres (Figure 1). En fait, plus on se rapproche de la région centrale, plus le rendement observé est faible. Cela est probablement dû à l’acétylation interférant ...

Discussion

Il est essentiel de suivre ce protocole dans les moindres détails lors d’une expérience. Les nucléosomes ne sont pas très stables et beaucoup d’essais et d’erreurs ont été consacrés à la détermination de ce protocole. Il est essentiel d’éliminer les précipités à chaque étape (ou chaque fois qu’elles sont observées), car les particules peuvent facilement interférer avec les processus d’assemblage. Gardez toujours les échantillons d’histones sur la glace. Si les nucléosomes sont stockés à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler