Сайт Конкретные лизин ацетиляции гистонов для нуклеосомы Восстановление с использованием генетического расширения кода в Escherichia coli

Резюме

Здесь мы представляем метод выражения ацетилированных белков гистона с помощью расширения генетического кода и собираем восстановленные нуклеосомы в пробирке.

Аннотация

Ацетилированные белки гистона могут быть легко выражены в Escherichia coli кодирования мутанта, N^ε-ацетил-лизин (AcK)-специфический Метаносарчина Мази пирролизин тРНК-синтезаз (MmAcKRS1) и его cognate tRNA (tRNA^Pyl) для сборки восстановленных мононуклеом с сайта конкретных ацетилированных гистонов. MmAcKRS1 и tRNA^{Pyl доставляют} AcK на место мутации янтаря в мРНК выбора во время перевода в Escherichia coli. Этот метод широко используется для включения AcK на участках лизина H3. Пирролизил-тРНА синтезаз (PylRS) также может быть легко развивались для включения других неканонических аминокислот (ncAAs) для сайта конкретной модификации белка или функционализации. Здесь мы подробно метод для включения AcK с использованием системы MmAcKRS1 в гистон H3 и интегрировать ацетилированные белки H3 в восстановленных мононуклеозом. Ацетилированные восстановленные мононуклеосомы могут быть использованы в биохимических и связывающих анализах, определении структуры и многое другое. Получение модифицированных мононуклеом имеет решающее значение для разработки экспериментов, связанных с открытием новых взаимодействий и пониманием эпигенетики.

Введение

Мы использовали PylRS и tRNA^{Pyl для} синтеза и сборки восстановленных мононуклеосом с конкретными ацетилированными гистонами. PylRS оказался бесценным в качестве инструмента расширения генетического кода для производства белков с пост-трансляционными модификациями (PTMs) и был генетически эволюционировал, чтобы включить около 200 различных ncAAs. PylRS включает в себя на янтарной остановке кодон, устраняя конкуренцию с другими аминокислотами во время перевода. PylRS был впервые обнаружен в метамфетаминовых археев, и с тех пор был использован в химической биологии для включения новых реактивных химических^{групп в белки 1,2}.

MmAcKRS1 был создан из метаносаркина mazei PylRS и часто используется в нашей лаборатории для синтеза ацетилированных^{белков 3,4,5,6}. MmAcKRS1 поставляет AcK на место мутации янтаря в мРНК выбора во время перевода в Escherichia coli. Этот метод ранее был использован для включения AcK на K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, и K79 histone H3 лизин сайтов для изучения деятельности Sirtuin 1, 2, 6, и 7 на ацетилированных мононуклеозом^4,5,6. Здесь мы подробно этот метод, чтобы выразить ацетилированные гистоны и восстановить ацетилированные нуклеосомы.

протокол

1. Плазмидная конструкция

1. Начните с принятия решения, какой белок гистон будет ацетилирован и на котором лизин сайта. Мутировать сайт к янтарной остановки кодон (TAG) с помощью сайта направлены мутагенез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть четыре ранее разработанных плазмидов, используемых для выражения гистона белков. Все четыре белка гистона были клонированы в вектор pETDuet-1 с тегом N-терминала гистидина. Histone H4 также включает в себя тег SUMO, происхождение репликации colE1 с номером копии около 40, ампициллин устойчивый, и T7 промоутер.
   1. Дизайн вперед и обратной грунтовки, которые содержат мутации TAG в нужном месте (замена существующих лизин кодон с янтарной остановки кодон) в одном из четырех гистон белка плазмиды.
   2. Используйте цельноплазмический ПЦР для усиления TAG, содержащего плазмиду. Определите соответствующую температуру для грунтовок. В целом, температура плавления (Т_м)грунтовки минус 5 градусов по Цельсию будет достаточной. При затруднении получения ПЦР-продукта для оптимизации температурной температуры для усиления можно использовать температуру температуры_Т- м - 5 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте в доме выраженный полимераза ПФУ использовалась в течение 30 циклов со следующими условиями: 94 градуса по Цельсию для 30 с (денатурация), температура анны 30 с, и 72 градусов по Цельсию в течение 6 минут (или 1 мин за килобазу-пары). Для получения более подробной информации об этом типе метода ПЦР см. Лю и Нейсмит⁷.
   3. Очистите продукт PCR с помощью комплекта очистки ПЦР, следуя протоколу производителя. Проанализируйте продукт ПЦР с помощью электрофорезы агарозного геля и последующего окрашивания бромистого этидия.
   4. Ligate плазмид путем инкубации с T4 лигазы ночь при 16 градусов по Цельсию.
2. Сначала превратите TAG, содержащий плазмид (Amp^R)в химически компетентную палочку Escherichia. Выберите минимум 4 колонии из преобразования и очистить плазмиду. Сделать клеточные запасы каждого с глицеролом с помощью стандартных методов и хранить при -80 градусов по Цельсию. Отправить для секвенирования, чтобы подтвердить желаемую мутацию TAG.
3. Как только последовательность подтвердится, совместно трансформировать TAG-содержащие плазмид (Amp^R) с pEVOL-AckRS (Chl^R) в химически компетентных CobB (единственный гистон лизин deacetylase известный в E. coli.) удаление BL21 клеток с использованием метода теплового шока. pEVOL является плазмид с серединой копии числа с низким числом копий p15A происхождения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Серия плазмидов pEVOL была построена на основе предыдущих исследований, которые показали увеличение экспрессии пары orthogonal aaRS/tRNA^Tyr было эффективным в снижении утоления белка и в увеличении общих урожаев^{белков-мутантов 8}. Если ячейки удаления CobB недоступны, протейте с химически компетентными клетками BL21. CobB является Sirtuin-как гистон лизин deacetylase и никотинамид может быть добавлен в 5 мМ окончательной концентрации во время экспрессии белка гистона для ингибирования КобБ в качестве альтернативного подхода⁹.
4. Сделать запас клеток и хранить при -80 градусов по Цельсию.

2. Ацетилированная экспрессия белка гистона

1. Подготовь 1 л автоклавных 2YT-медиа (или громкости выбора) в культурной колбе.
2. Прививка 20 мл 2YT-медиа, содержащего соответствующие антибиотики с совместно преобразованным клеточным запасом, который имеет ТАГ-содержащую плазмиду (Amp^R)и pEVOL-AckRS (Chl^R) и растет на 37 градусов по Цельсию до OD 0,6 (4-6 ч).
3. Добавьте соответствующие антибиотики к 1 л автоматических 2YT-медиа и прививки с 20 мл стартер культуры. Рост на 37 градусов по Цельсию до OD 0,6-0,8 (2-3 ч).
4. Добавьте индуцирующие агенты и ацетиллин (AcK) в окончательные концентрации IPTG 1 мМ, 0,2% арабинозы и AcK 5 мМ.
5. Выращиваем культуру при 37 градусов по Цельсию за 6-8 ч.
6. Пеллетные клетки по 2700 х г в течение 15 мин.
7. Храните гранулы клетки при -80 градусов по Цельсию на ночь.
8. С этого шага и далее держать образец на льду все время. Растворите клеточные гранулы в 50 мл буфера лиза гистона на 1 л культуры.
9. Sonicate в соответствии со следующим циклом: 1 с, 1 с выключенным, всего на время: 3 мин при 60% амплитуды.
10. Пеллет включения органов на 41600 х г в течение 45 мин.
11. Отбросьте сверхнатантные и повторное включение органов в 30 мл буфера лиза гистона. Пеллет включение сулит на 41600 х г в течение 30 мин.
12. Отбросьте сверхнатантные и повторное включение органов в 30 мл буфера для мытья гранул. Пеллет включения органов на 41600 х г в течение 30 мин.
13. Отбросьте супернатант и растворите тела включения в 25 мл 6 M гидрохлорид Гуанидина (GuHCl) буфера. Инкубация с возбуждением при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости органы включения могут быть инкубированы с возбуждением на ночь при 4 градусов по Цельсию.
14. Пеллет включение сулит на 41600 х г в течение 45 мин. Инкубировать супернатант с 1 мл смолы Ni-NTA equilibrated с 6 M GuHCl буфера на 2 ч.
15. Продолжить очистку Ni-NTA в денатурированных условиях. Вымойте столбец с 3 объемами столбца буфера мытья. Elute ацетилированный белок гистона с 10 мл буфера элюции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка сконцентрировать белок здесь вариант, но ацетилированные гистоны очень непредсказуемы и могут легко осаждать. Не рекомендуется концентрироваться последние 2 мл в общем объеме.
16. Обширно диализ ацетилированного белка гистона против 5% буфер уксусной кислоты для удаления солей. Диалайз в течение 3 ч за один раз при 4 градусах Цельсия, обменивая на свежий буфер минимум 6 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения чистоты белка, есть возможность диализует против чистой воды. Однако это приводит к значительным осадкам и снижению урожайности, что может быть нежелательно для низкоутяжеленных ацетилированных белков гистона.
17. Aliquot и лиофилизовать белок, и хранить на неопределенный срок при -80 градусов по Цельсию. Белки дикого типа гистон обычно дают 10-50 мг/л, в то время как ацетилированные белки гистона дают менее 10 мг/л в зависимости от конкретного участка лизина. Например, H3K79Ac в среднем 5 мг/л.

3. Выражение белка дикого типа гистона

1. Чтобы собрать полные нуклеосомы, вырази все 4 белка гистона. При выражении и очистке дикого типа гистонов протокол такой же, как ацетилированные гистоны, за исключением следующих:
   1. Не выполняем совместной трансформации. Не используйте pEVOL-AcKRS для выражения дикого типа гистона. Отрегулируйте антибиотики соответствующим образом.
   2. Не используйте линию ячейки удаления CobB или добавить никотинамид, acK или арабинозу во время индукции клеточной экспрессии.

4. Подготовка 601 ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее разработанная оптимизированная последовательность ДНК для прямого нуклеосомного позиционирования собирается с гистоновыми октамерами для производства мононуклеосомы с высокой эффективностью. Эта последовательность называется 601 ДНК или последовательность Widom. Эта последовательность стала стандартной последовательностью ДНК для исследований в пробирке нуклеосом от хроматина ремоделирования анализов до измерения одной молекулы¹⁰.

1. Чтобы подготовить значительное количество 601 ДНК для нуклеосомной сборки, превратите pGEM-3z/601 в топ-10 клеток и вырастит 10 мл культуры для плазмидного усиления и экстракции. Используйте комплект для извлечения плазмиды и следуйте рекомендации производителя.
2. Для этого протокола усиления используйте для этого протокола усиления использование полимеразы PFU (более эффективной). Настройка реакции ПЦР: для реакции 250 йл, использовать 207,5 мкл autoclaved МЗ H₂O, 25 йл 10x PFU Буфер, 5 йл Вперед Праймер: ctggagaatcccgggccg, 5 йл Обратный праймер: acaggatgtatatatctgacacg, 5 йл DNTP смеси, 2,5 L PFU фермента. Обычно мы запускаем 60 реакций одновременно, чтобы собрать достаточно ДНК.
3. При использовании полимеразы ПФУ используйте аннальную температуру 52 градуса по Цельсию в течение 30 с и время расширения на 30 градусов. В противном случае следуйте рекомендованным производителям условиям.
4. Как только ПЦР будет сделано, используйте PCR очистить комплект выбора для очистки продукта PCR.

5. Собрание октамера гистона

1. Растворите алициты белковых гранул гистона H2A, H2B, H3 и H4, чтобы в GuHCl Buffer был отдельный запас каждого белка гистона общим объемом 100 йл.
2. Рассчитайте концентрацию каждого белка гистона путем измерения поглощения A_280.
3. Если абсорбанс больше, чем 1 для любого белка, разбавить буфером GuHCl, чтобы получить более точную концентрацию.
4. Объедините белки H2A и H2B в соотношении 1:1 моляра и разбавьте к общей концентрации белка 4 мкг/л. Повторите для H3 и H4.
5. Диализ последовательно при 4 кк против 2 M TE буфера ночь, 1 M TE буфер для 2 ч и 0,5 МТ TE буфер для 5 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Второй и третий этапы диализа вызывают нестабильные конформации белка, чтобы выйти. Ожидается, что на этих ступенях ожидаются обильные осадки.
6. Удалить осадки центрифугации при 16800 х г при 4 градусов по Цельсию.
7. Опять же, рассчитать концентрацию гистон димеров (H2A/H2B смеси) и тетрамеров (H3/H4 смеси)_{измерения поглощения A 280.}
8. Смешайте димеры и тетрамеры в соотношении 1:1 моляров и отрегулируйте NaCl до 2 M путем добавления твердого NaCl.
9. Октамер histone можно хранить при 4 градусах Цельсия и более стабилен, чем димеры и тетрамеры. Никогда не замораживайте октамер histone, так как это может привести к разборке.
10. При сборке с ацетилированными гистонами, просто заменить белок дикого типа с ацетилированным белком в процедуре.

6. Нуклеосомная сборка

1. Используйте 100x TE буфер и твердый NaCl для настройки 601 ДНК к 2M TE буфера. Добавьте ДНК 601 в буфере 2M TE к октамеру гистона в соотношении молар 0,85:1 к 0,90:1. Более низкое соотношение ДНК может быть добавлено, если свободная ДНК присутствует в анализе сдвига геля.
2. Передача ДНК-гистоновой смеси в диализный мешок и поместите примерно в 200 мл буфера 2M TE (или больше, если сборка нескольких образцов) и очень осторожно перемешать при 4 градусах Цельсия.
3. Установите перистальтический насос, чтобы очистить медленно капать в не соль TE буфера. Когда объем примерно удвоился, вылейте половину объема. Сделай это по крайней мере 4 раза в общей сложности. С насосом это может занять 4-8 ч в зависимости от стартового объема. Нуклеосомы образуются при снижении концентрации соли до 150 мМ (измеряется измеритым счетчиком солености).
4. После снижения концентрации соли до 150 мМ, диасализует против 20 мМТ te буфера на ночь.
5. Удалите осадки путем центрифугации и измерьте концентрацию нуклеосом с помощью чтения A_{260 с} помощью считыватель пластин.
6. Добавить его-TEV protease (TEV: нуклеосома 1:30, w:w ) и инкубировать на ночь при 4 кк, чтобы удалить все гистидин теги. Удалите примеси гистидина тега из нуклеосомного раствора смолы Ni-NTA съехать вниз.
7. Чтобы распоят нуклеосому и гомогенизировать образец, инкубировать при 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ацетилированных сайтов, которые являются особенно нестабильными, этот шаг не может быть целесообразным.
8. Храните нуклеосомы в течение короткого периода времени (несколько недель) при 4 градусах Цельсия.
9. Для длительного хранения, диасоз нуклеозомы против буфера хранения и хранить при -80 градусов по Цельсию.

Результаты

Димеры, тетрамеры и октамеры можно оценить, запуская гель SDS PAGE 12%(рисунок 1 и рисунок 2). Здесь вы можете видеть, что некоторые из ацетилированных теттрамеров имеют более низкую урожайность, чем другие(рисунок 1). На самом д?...

Обсуждение

Важно следовать этому протоколу во всех деталях во время эксперимента. Нуклеосомы не очень стабильны, и при определении этого протокола было допущено много проб и ошибок. Это ключ к удалению осадков на каждом шагу (или при наблюдении), потому что частицы могут легко вмешиваться в процес?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler