Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode, um acetylierte Histonproteine mittels genetischer Codeerweiterung auszudrücken und rekonstituierte Nukleosomen in vitro zusammenzusetzen.

Zusammenfassung

Acetylatierte Histonproteine können leicht in Escherichia coli exprimiert werden, die eine Mutante, N^ε-Acetyl-Lysin (AcK)-spezifische Methanosarcina mazi pyrrolysinttRNA-Synthetase (MmAcKRS1) und ihre kognade tRNA (tRNA^Pyl) zur Zusammenstellung rekonstituierter Mononukleosomen mit MmAcKRS1 und tRNA^Pyl liefern AcK an einer Bernsteinmutationsstelle in der mRNA der Wahl während der Translation in Escherichia coli. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um AcK an H3-Lysin-Standorten zu integrieren. Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS) kann auch leicht entwickelt werden, um andere nichtkanonische Aminosäuren (ncAAs) für die standortspezifische Proteinmodifikation oder -funktionalisierung zu integrieren. Hier beschreiben wir eine Methode, AcK mit dem MmAcKRS1-System in Histon H3 zu integrieren und acetylierte H3-Proteine in rekonstituierte Mononukleosomen zu integrieren. Acetylierte rekonstituierte Mononukleosomen können in biochemischen und verbindlichen Assays, Strukturbestimmung und mehr verwendet werden. Die Beschaffung modifizierter Mononukleosomen ist entscheidend für die Entwicklung von Experimenten im Zusammenhang mit der Entdeckung neuer Wechselwirkungen und dem Verständnis der Epigenetik.

Einleitung

Wir haben PylRS und tRNA^Pyl verwendet, um rekonstituierte Mononukleosomen mit standortspezifischen acetylierten Histonen zu synthetisieren und zusammenzusetzen. PylRS hat sich als genetisches Codeerweiterungstool zur Herstellung von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) als unschätzbar erwiesen und wurde genetisch weiterentwickelt, um etwa 200 verschiedene ncAAs zu integrieren. PylRS enthält an einem Bernstein-Stop-Codon, wodurch die Konkurrenz von anderen Aminosäuren während der Übersetzung entfernt wird. PylRS wurde zuerst in methanogenen Archaeen entdeckt und wird seitdem in der chemischen Biologie verwendet, um neuartige reaktive chemische Gruppen in Proteine^1,2zu integrieren.

MmAcKRS1 wurde aus Methanosarcina mazei PylRS entwickelt und häufig in unserem Labor für die Synthese von acetylierten Proteinen^3,4,5,6verwendet. MmAcKRS1 liefert AcK an einer Bernsteinmutationsstelle in der mRNA der Wahl während der Übersetzung in Escherichia coli. Diese Technik wurde bisher verwendet, um AcK an K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 und K79 Histon H3 Lysin-Sites zu integrieren, um die Aktivität von Sirtuin 1, 2, 6 und 7 auf acetylierten Mononukleosomen^4,5,6zu untersuchen. Hier beschreiben wir diese Methode, um acetylierte Histone auszudrücken und acetylierte Nukleosomen zu rekonstruieren.

Protokoll

1. Plasmidkonstruktion

1. Beginnen Sie mit der Entscheidung, welches Histonprotein acetyliert wird und an welcher Lysin-Stelle. Mutieren Sie die Seite zum Bernstein-Stop-Codon (TAG) mit Website gerichtet Etagenese.
   HINWEIS: Es gibt vier zuvor entwickelte Plasmide, die für die Expression von Histonproteinen verwendet werden. Alle vier Histonproteine wurden mit einem N-terminalen Histidin-Tag in den pETDuet-1-Vektor geklont. Histone H4 enthält auch ein SUMO-Tag, den Ursprung der Replikation colE1 mit einer Kopiernummer von etwa 40, Ampicillin-resistent, und ein T7-Promoter.
   1. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine TAG-Mutation an der gewünschten Stelle enthalten (ersetzen eines vorhandenen Lysin-Codons durch das Bernstein-Stop-Codon) in einem der vier Histonproteinplasmide.
   2. Verwenden Sie Vollplasmid-PCR, um das TAG-haltige Plasmid zu verstärken. Bestimmen Sie eine geeignete Glühtemperatur für die Primer. Im Allgemeinen reicht die Schmelztemperatur (T_m) der Primer minus 5 °C aus. Bei Schwierigkeiten bei der Herstellung eines PCR-Produkts kann ein Temperaturgradient um T_m - 5 °C verwendet werden, um die Glühtemperatur für die Amplifikation zu optimieren.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurde eine hauseigene pFU-Polymerase für 30 Zyklen mit folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 30 s (Denaturierung), Glühtemperatur für 30 s und 72 °C für 6 min (oder 1 min pro Kilobase-Paar). Weitere Informationen zu dieser Art von PCR-Methode finden Sie unter Liu und Naismith⁷.
   3. Bereinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Bereinigungskit, indem Sie das Herstellerprotokoll befolgen. Analysieren Sie das PCR-Produkt durch Agarose-Gel-Elektrophorese und anschließende Ethidiumbromidfärbung.
   4. Ligate das Plasmid durch Inkubieren mit T4 Ligase über Nacht bei 16 °C.
2. Verwandeln Sie zunächst das TAG-haltige Plasmid (Amp^R) in chemisch kompetente Escherichia coli. Wählen Sie mindestens 4 Kolonien aus der Transformation und reinigen Sie das Plasmid. Machen Sie Zellbestände mit Glycerin nach Standardmethoden und lagern Sie bei -80 °C. Senden Sie zur Sequenzierung, um die gewünschte TAG-Mutation zu bestätigen.
3. Sobald die Sequenz bestätigt ist, transformieren Sie das TAG-haltige Plasmid (Amp^R) mit pEVOL-AckRS (Chl^R) in chemisch kompetentes CobB (das einzige in E. coli.) bekannte Histonlysin-Deacetylase, das BL21-Zellen mit der Wärmeschockmethode löscht. pEVOL ist ein Plasmid mit einer Mittleren Kopierzahl bis zum Ursprung p15A mit niedriger Kopiernummer.
   HINWEIS: Die pEVOL-Reihe von Plasmiden wurde auf der Grundlage früherer Studien erstellt, die zeigten, dass eine erhöhte Expression des orthogonalen AaRS/tRNA^Tyr-Paares wirksam bei der Verringerung der Proteinkürzung und bei der Erhöhung der Gesamtausbeute mutierter Proteine⁸war. Wenn CobB-Deletionszellen nicht zugänglich sind, fahren Sie mit chemisch kompetenten BL21-Zellen fort. CobB ist ein Sirtuin-ähnliches Histon-Lysin-Deacetylase und Nicotinamid kann in einer Endkonzentration von 5 mM während der Histonproteinexpression zugesetzt werden, um CobB als alternativen Ansatz zu hemmen⁹.
4. Machen Sie einen Zellbestand und lagern Sie bei -80 °C.

2. Acetylatierte Histonproteinexpression

1. Bereiten Sie 1 L autoklavierte 2YT-Medien (oder Volumen ihrer Wahl) in einem Kulturkolben vor.
2. 20 ml 2YT-Medien mit den entsprechenden Antibiotika mit dem kotransformierten Zellbestand, der das TAG-haltige Plasmid (Amp^R) und pEVOL-AckRS (Chl^R) enthält, impfen und bei 37 °C bis OD = 0,6 (4-6 h) wachsen.
3. Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika zu den 1 L autoklavierten 2YT-Medien hinzu und impfen Sie mit der 20 ml-Starterkultur. Wachsen bei 37 °C bis OD = 0,6-0,8 (2-3 h).
4. Fügen Sie induzierende Mittel und Acetyllysin (AcK) zu den Endkonzentrationen von IPTG 1 mM, 0,2% Arabinose und AcK 5 mM hinzu.
5. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C für 6-8 h.
6. Pelletzellen bei 2.700 x g für 15 min.
7. Lagern Sie das Zellpellet über Nacht bei -80 °C.
8. Ab diesem Schritt halten Sie die Probe immer auf Eis. Lösen Sie das Zellpellet in 50 ml Histonlysepuffer pro 1 L Kultur.
9. Beschallen nach dem folgenden Zyklus: 1 s an, 1 s aus, gesamtzeit: 3 min bei 60% Amplitude.
10. Pellet-Einschlusskörper bei 41.600 x g für 45 min.
11. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Einschlusskörper in 30 ml Histonlysepuffer wieder aus. Pellet-Einschluss verheißt bei 41.600 x g für 30 min.
12. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Einschlusskörper in 30 ml Pelletwaschpuffer wieder aus. Pellet-Einschlusskörper bei 41.600 x g für 30 min.
13. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie die Einschlüsse in 25 ml von 6 M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) Puffer auf. Mit Rührung bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    HINWEIS: Bei Bedarf können Einschlusskörper über Nacht bei 4 °C mit Rührung inkubiert werden.
14. Pellet-Einschluss verheißt 45 min. 41.600 x g. Inkubieren Sie den Überstand mit 1 ml Ni-NTA Harz, der mit 6 M GuHCl Puffer für 2 h ausgeglichen wird.
15. Fahren Sie mit der Ni-NTA-Reinigung unter denaturierten Bedingungen fort. Waschen Sie die Spalte mit 3 Spaltenvolumen des Spaltenwaschpuffers. Elute acetylierte Stonprotein mit 10 ml Elutionspuffer.
    HINWEIS: Der Versuch, das Protein hier zu konzentrieren, ist eine Option, aber acetylierte Histone sind sehr unvorhersehbar und können leicht ausfallen. Es wird nicht empfohlen, sich über 2 ml gesamtvolumen zu konzentrieren.
16. Extensiv dialysieren das acetylierte Histonprotein gegen 5% Essigsäurepuffer, um Salze zu entfernen. Dialyse für 3 h zu einer Zeit bei 4 °C, Austausch gegen frischen Puffer mindestens 6 mal.
    HINWEIS: Für eine verbesserte Proteinreinheit gibt es eine Option, gegen reines Wasser zu dialysieren. Dies führt jedoch zu einer erheblichen Niederschlagsmenge und Ertragsminderung, die bei ertragsarmen acetylierten Histonproteinen unerwünscht sein kann.
17. Aliquot und Lyophilize Protein, und speichern sie unbegrenzt bei -80 °C. Wildtyp-Histonproteine ergeben in der Regel 10-50 mg/L, während acetylierte Histonproteine je nach spezifischer Lysin-Site weniger als 10 mg/L ergeben. H3K79Ac durchschnittlich 5 mg/L.

3. Wildtyp-Histonproteinexpression

1. Um vollständige Nukleosomen zu montieren, drücken Sie alle 4 Histonproteine aus. Beim Ausdrücken und Reinigen von Wildtyphistonen ist das Protokoll mit den acetylierten Histonen identisch, mit Ausnahme der folgenden:
   1. Führen Sie keine Co-Transformation durch. Verwenden Sie pEVOL-AcKRS nicht für den Typ Histone-Ausdruck. Passen Sie Antibiotika entsprechend an.
   2. Verwenden Sie keine CobB-Deletionszelllinie oder fügen Sie Nicotinamid, AcK oder Arabinose während der Induktion der zellulären Expression hinzu.

4. Herstellung von 601 DNA

HINWEIS: Eine zuvor entwickelte optimierte DNA-Sequenz zur direkten Nukleosompositionierung wird mit Histon-Okimatoren zusammengesetzt, um Mononukleosom mit hoher Effizienz zu produzieren. Diese Sequenz wird als 601 DNA oder die Widom-Sequenz bezeichnet. Diese Sequenz ist zur Standard-DNA-Sequenz für In-vitro-Studien von Nukleosomen von Chromatin-Remodeling-Assays bis hin zu Einzelmolekülmessungen¹⁰geworden.

1. Um signifikante Mengen von 601 DNA für die Nukleom-Montage vorzubereiten, transformieren Sie pGEM-3z/601 in Top 10 Zellen und wachsen 10 ml Kultur für die Plasmidverstärkung und Extraktion. Verwenden Sie ein Plasmid-Extraktionskit und folgen Sie der Empfehlung des Herstellers.
2. Verwenden Sie für dieses Amplifikationsprotokoll eine im Eigenen Haus ausgedrückte PFU-Polymerase (effizienter). Einrichten einer PCR-Reaktion: Verwenden Sie für die 250-L-Reaktion 207,5 l autoklaviertes MQ H₂O, 25 l 10x PFU-Puffer, 5 l Vorwärts-Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 l Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 l dNTP-Mix, 2,5 l PFU-Enzym. Wir führen in der Regel 60 Reaktionen auf einmal aus, um genügend DNA zu erhalten, um sich zusammenzusetzen.
3. Verwenden Sie eine Glühtemperatur von 52 °C für 30 s und eine Verlängerungszeit von 30 s bei Verwendung von PFU-Polymerase. Ansonsten folgen Sie den empfohlenen Bedingungen des Herstellers.
4. Sobald PCR fertig ist, verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit ihrer Wahl, um das PCR-Produkt zu reinigen.

5. Montage des Histon-Oktobeers

1. Lösen Sie Aliquots der Histonproteinpellets H2A, H2B, H3 und H4 auf, so dass es einen separaten Vorrat an jedem Histonprotein in GuHCl Buffer mit einem Gesamtvolumen von 100 l gibt.
2. Berechnen Sie die Konzentration jedes Histonproteins, indem Sie die A_{280-Absorption} messen.
3. Wenn die Absorption für jedes Protein größer als 1 ist, verdünnen Sie mit GuHCl-Puffer, um eine genauere Konzentration zu erhalten.
4. Kombinieren Sie H2A- und H2B-Proteine in einem 1:1-Molarenverhältnis und verdünnen Sie sie auf eine Gesamtproteinkonzentration von 4 g/l. Wiederholen Sie dies für H3 und H4.
5. Dialyse sequenziell bei 4 °C gegen 2 M TE Puffer über Nacht, 1 M TE Puffer für 2 h und 0,5 M TE Puffer für 5 h.
   HINWEIS: Der zweite und dritte Schritt der Dialyse bewirkt, dass instabile Konformationen des Proteins ausfallen. Es wird erwartet, dass es an diesen Stufen starke Niederschläge gibt.
6. Ausscheide durch Zentrifugation bei 16.800 x g bei 4 °C entfernen.
7. Berechnen Sie erneut die Konzentration von Histondimermen (H2A/H2B-Gemisch) und Tetrameren (H3/H4-Gemisch), die die A_{280-Absorption} messen.
8. Mischen Sie Dimere und Tetramere in einem 1:1-Molarenverhältnis und stellen Sie NaCl durch Zugabe von festem NaCl auf 2 M ein.
9. Histon-Oktomater kann bei 4 °C gelagert werden und ist stabiler als Dimere und Tetramere. Niemals Histone-Okamer einfrieren, da dies zu Einer Demontage führen kann.
10. Wenn Sie sich mit acetylierten Histonen zusammensetzen, ersetzen Sie einfach das Wildtyp-Protein durch das acetylierte Protein im Verfahren.

6. Nukleosom-Montage

1. Verwenden Sie 100x TE-Puffer und soliden NaCl, um 601 DNA auf 2M TE-Puffer einzustellen. Fügen Sie die 601 DNA in 2M TE Puffer zu Histon-Okamer in einem Molaren-Verhältnis von 0,85:1 bis 0,90:1 hinzu. Ein niedrigeres Verhältnis von DNA kann hinzugefügt werden, wenn freie DNA in der Gelverschiebungsanalyse vorhanden ist.
2. Das DNA-Histon-Gemisch einen Dialysebeutel übertragen und in ca. 200 ml 2M TE-Puffer (oder mehr bei der Montage mehrerer Proben) platzieren und bei 4 °C sehr sanft umrühren.
3. Stellen Sie eine peristaltische Pumpe ein, um langsam in keinen SalzTE-Puffer zu tropfen. Wenn sich das Volumen ungefähr verdoppelt hat, gießen Sie die Hälfte des Volumens aus. Tun Sie dies mindestens 4 Mal insgesamt. Bei einer Pumpe kann dies je nach Startvolumen 4-8 h dauern. Nukleosomen bilden sich, wenn die Salzkonzentration auf 150 mM reduziert wird (gemessen am Salzgehaltsmesser).
4. Nachdem die Salzkonzentration auf 150 mM reduziert wurde, dialysieren Sie gegen einen 20 mM TE Puffer über Nacht.
5. Ausscheidungen durch Zentrifugation entfernen und die Konzentration der Nukleosomen mit_einem Plattenleser messen.
6. Fügen Sie His-TEV Protease (TEV: Nukleosome 1:30, w:w ) und inkubieren über Nacht bei 4 °C, um alle Histidin-Tags zu entfernen. Entfernen Sie die Histidin-Tag-Verunreinigungen aus der Nukleosomlösung durch Ni-NTA-Harz nach unten ziehen.
7. Um das Nukleosom zu positionieren und die Probe zu homogenisieren, bei 60 °C für 1 h inkubieren.
   HINWEIS: Für acetylierte Standorte, die besonders instabil sind, ist dieser Schritt möglicherweise nicht ratsam.
8. Nukleosomen kurzfristig (einige Wochen) bei 4 °C lagern.
9. Zur Langzeitlagerung Nukleosomen gegen Speicherpuffer dialysieren und bei -80 °C lagern.

Ergebnisse

Dimere, Tetramere und Okmamer können mit einem 12% SDS PAGE Gel bewertet werden (Abbildung 1 und Abbildung 2). Hier können Sie sehen, dass einige der acetylierten Tetramere eine geringere Ausbeute haben als andere (Abbildung 1). In der Tat, je näher an der Kernregion, desto niedriger der Ertrag beobachtet. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Acetylierung zurückzuführen, die die Zusammenstellu...

Diskussion

Es ist wichtig, dieses Protokoll während eines Experiments bis ins kleinste Detail zu befolgen. Nukleosomen sind nicht sehr stabil und viel Versuch und Irrtum ist in die Bestimmung dieses Protokolls gegangen. Es ist der Schlüssel, um Ausscheidungen bei jedem Schritt (oder wann immer beobachtet) zu entfernen, da Partikel leicht die Montageprozesse stören können. Halten Sie seine Tonproben immer auf Eis. Werden Nukleosomen zu lange bei 4 °C gelagert, können sie sich spontan zerlegen. Achten Sie darauf, alle Proben vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler