JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.

Abstract

تتعرض الخلايا باستمرار لمختلف العوامل الضارة بالحمض النووي، مما يؤدي إلى استجابات خلوية مختلفة. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية أمر ضروري في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة بتوظيف وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع. وعلاوة على ذلك، تسمح لنا التقنيات الأساسية الجديدة بدراسة هذه العمليات على مستوى دقة الخلية الواحدة باستخدام الخلايا الثابتة والحية على حد سواء. على الرغم من أن هذه التقنيات قد استخدمت لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة، وهنا نقدم البروتوكولات الأكثر استخداما في مجال إصلاح الحمض النووي، والتأني المناعي الفلوري (IF) وChromatin Immunoprecipitation (ChIP)، والتي في تركيبة مع تلف الحمض النووي الموقع القائم على الإنتونوكليز تجعل من الممكن تصور وقياس الإشغال الجينومي لعوامل إصلاح الحمض النووي بطريقة موجهة ومنظمة، على التوالي. توفر هذه التقنيات أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالجراد الجينومي التالف بالإضافة إلى تعديلاتها اللاحقة للترجمة اللازمة لتنظيمها الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي.

Introduction

الجينوم لدينا هو باستمرار تواجه تحديا من قبل مختلف العوامل الضارة الحمض النووي. ويمكن أن تستمد هذه الاعتداءات من مصادر بيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع، وكذلك من مصادر داخلية، مثل المنتجات الثانوية الأيضية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي أو أخطاء النسخ المتماثل1،2. يمكن أن تؤثر هذه الآفات على سلامة أحد أو كل من خيوط الحمض النووي ، وإذا أصبحت الأخطاء المتولدة مستمرة ، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى عمليات النقل وعدم استقرار الجينوم ، مما قد يؤدي إلى تكوين الورم3،4. للحفاظ على سلامة الجينوم، تم تطوير أنظمة إصلاح متعددة أثناء التطور. وفقا للخصائص الكيميائية والفيزيائية لأنواع محددة من تلف الحمض النووي ، يمكن تنشيط آليات إصلاح متعددة. عدم التطابق، والمواقع abasic، فواصل حبلا واحد، و 8-oxoguanine (8-oxoG) يمكن إزالتها إما عن طريق إصلاح عدم التطابق أو قاعدة الختان إصلاح المسار5،6. الآفات الناجمة عن المنتجات الضوئية الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية والإضافات الضخمة يمكن إصلاحها إما عن طريق إصلاح النيوكليوتيدات الختان (NER) أو إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBR) عملية7،8. يتكون NER من مسارين فرعيين رئيسيين: NER المقترن بالنص (TC-NER) وNER الجينوم العالمي (GG-NER). فيما يتعلق بمرحلة دورة الخلية، بعد التعريفي كسر حبلا مزدوجة الحمض النووي، يمكن تنشيط مسارين فرعيين: غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب متجانسة (HR)1،9. يمكن تنشيط NHEJ ، وهو المسار المهيمن في الخلايا يستريح ، في جميع مراحل دورة الخلية ، مما يمثل مسارا أسرع ولكن عرضة للخطأ10. من ناحية أخرى، الموارد البشرية هو مسار خالية من الأخطاء، والتي يتم إصلاح DSBs على أساس البحث تسلسل التماثل من الكروماتيدات الشقيقة، وبالتالي فهو موجود أساسا في مراحل دورة الخلية S و G211. وعلاوة على ذلك، فإن الانضمام إلى نهاية الميكروهوميكولوجيا بوساطة (MMEJ) هو آلية إصلاح أخرى ل DSB، تختلف عن تلك المذكورة أعلاه، استنادا إلى طريقة KU70/80-وRAD51 المستقلة لإعادة ربط تسلسلات microhomologous التي تم استئصالها سابقا والتي تحيط بنهايات الحمض النووي المكسورة. لذلك، يعتبر MMEJ أن تكون عرضة للخطأ ومطفرة للغاية12. أثناء إصلاح الحمض النووي، DSBs يمكن أن تحفز استجابة تلف الحمض النووي (DDR)، مما يؤدي إلى تفعيل kinases نقطة التفتيش التي توقف دورة الخلية أثناء إصلاح13،14،15. يتم تنشيط DDR كرد فعل على التوظيف والانتشار الواسع النطاق للاعبين الرئيسيين البادئين في عملية الإصلاح حول الآفات ، مما يساهم في تشكيل تركيز الإصلاح. في هذه السلسلة الإشارات المبكرة، وM ATM (Ataxia Telangiectasia تحور) كيناز يلعب دورا محوريا من خلال تحفيز الفوسفور من البديل الهستون H2AX في Ser139 (يشار إليها باسم γH2AX) حول الآفة16. هذا الحدث المبكر هو المسؤول عن توظيف عوامل إصلاح إضافية وبدء عمليات الإصلاح المصب. على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة للبروتينات المجندة في محور الإصلاح لم يتم توصيفها بالكامل بعد ، فقد تم التحقيق في تشكيل وديناميات بؤر الإصلاح من قبل العديد من المختبرات. وتستخدم هذه العلامات على نطاق واسع لمتابعة الحركية إصلاح، ولكن دورها الدقيق خلال عملية الإصلاح لا يزال بعيد المنال. نظرا للأهمية الكبيرة ولكن سوء فهم العمليات الخلوية ذات الصلة إصلاح الحمض النووي، وقد وضعت عدة طرق حتى الآن للحث وتصور DDR.

وقد تم إنشاء أساليب ونظم مختلفة للحث على النوع المطلوب من تلف الحمض النووي. على سبيل المثال، بعض العوامل [مثل نيوكارزينوستاتين (NCS)، phleomycin، bleomycin، γ الإشعاع، الأشعة فوق البنفسجية] يمكن أن تحفز أعدادا كبيرة من فواصل الحمض النووي العشوائي في المواقف الجينومية غير التنبؤية، في حين أن الآخرين (endonucleases، مثل AsiSI، I-PpoI أو I-SceI، فضلا عن شريط الليزر) يمكن أن تحفز فواصل الحمض النووي في loci الجينوم المعروفة17،18،19،20،21. هنا، ونحن نركز على التقنيات القائمة على الإندونوكليز المستخدمة حاليا لدراسة DDR في الثدييات وخلايا الخميرة. وبصرف النظر عن تسليط الضوء على مبادئ هذه التقنيات، ونحن نؤكد على كل من مزاياها وعيوبها.

Protocol

1. الشفط المناعي لبروتينات محددة

  1. إعداد ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
    1. الحفاظ على خلايا U2OS في monolayers في DMEM الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني، 2 mM الجلوتامين، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية.
      ملاحظة: للحصول على تحريض تلف الحمض النووي القائم على الإندونوكليز، استخدم وسيطا معالجا بالفحم أو خاليا من الستيرويد لتجنب تسرب النظام.
    2. تنمو الخلايا في بيئة رطبة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية حتى 80٪ التقاء، وتجديد المتوسطة كل 2-3 أيام.
    3. يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x. فصل الخلايا مع حل تريبسين-EDTA. عندما تنفصل الخلايا، أوقف نشاط التريبسين بإضافة وسيط ثقافي إلى الخلايا، مما يؤدي إلى تعليق الخلية.
    4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا. لوحة 2 × 104 خلايا / مل / جيدا على لوحة 24 جيدا، مع العقيمة 12 ملم جولة coverslips في كل بئر.
    5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في جو رطب 5٪ CO2 للسماح المرفق على coverlips.
    6. علاج الخلايا مع 10 نانوغرام / مل من neocarzinostatin (NCS) عن طريق الأنابيب مباشرة وكيل الضارة إلى المتوسطة المستزرعة. احتضان الخلايا مع المتوسطة التي تحتوي على NCS لمدة 15 دقيقة، ثم غسلها مع برنامج تلفزيوني 1x وإضافة الطازجة، وتكملة متوسطة الثقافة إلى الخلايا. خلاف ذلك ، استخدم العامل المناسب (أي 4-OHT) لحث DSBs عبر الأنظمة القائمة على الإندونوكليز دون تحديث المتوسط22.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التشعيع للحث على تلف الحمض النووي، بدءا من 30 دقيقة حتى 8 ساعة من وقت الاسترداد باستخدام تدفق النيوترون بين 2-20 Gy23.
    7. احتضان الخلايا لمدة 1-8 ساعة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي5٪ CO 2 المرطب لمتابعة حركية إصلاح الحمض النووي.
  2. تثبيت الخلايا
    ملاحظة: يجب استخدام 300-500 ميكرولتر من الحلول/البئر في الخطوات التالية (الخطوات 1.2-1.5) لتغطية كافة الخلايا بشكل كاف. يجب إجراء كل خطوة حضانة وغسل (باستثناء حضانة الأجسام المضادة) على شاكر مداري مع هياج لطيف.
    1. بعد التعريفي DSB واحتضان الخلايا، وإزالة المتوسطة من الخلايا المرفقة وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1x.
    2. إصلاح الخلايا مع 4٪ حل الفورمالديهايد-PBS لمدة 20 دقيقة في 25 درجة مئوية.
  3. إعادة الخلايا إلى ما قبل الخلايا
    1. إزالة حل تحديد وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.2 ٪ تريتون العاشر - 100 حلها في برنامج تلفزيوني. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة.
  4. حظر مواقع الربط غير المحددة
    1. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
    2. كتلة مواقع ملزمة غير محددة مع 5٪ BSA (مصل البقر كسر الخامس الألبومين) المخفف في PBST (1x PBS تكملها 0.1٪ توين-20)، واحتضان العينات permeabilized لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  5. تلطيخ الفلورة المناعية
    1. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية (أي المضادة γH2AX، المضادة للحمض النووي-PKcs) المخفف في 1٪ BSA-PBST الحل. ضع كل غطاء رأسا على عقب على فيلم بارافين على قطرة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المضادة ل γH2AX.
      ملاحظة: في حالة وجود نقص المناعة المشتركة تمييع بشكل مناسب على حد سواء الأجسام المضادة في نفس الحل 1٪ BSA-PBST.
    2. احتضان العينات في غرفة الرطوبة لمدة 1.5 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحضانة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. وضع coverlips مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1x.
    4. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA-PBST. ضع كل غطاء رأسا على عقب على فيلم البارافين على قطرة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف.
    5. احتضان العينات في غرفة الرطوبة في 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    6. وضع coverlips مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1x.
    7. قبل إزالة آخر حل الغسيل PBS، تأخذ بلطف من coverlips باستخدام ملاقط وإبرة ومن ثم وضعها رأسا على عقب على الشرائح الزجاجية مع قطرات من المتوسطة المتصاعدة (تستكمل مع DAPI).
      ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات الهواء. عندما يجف المتوسط المتصاعد ، يوصى بختم حواف الأغطية بطلاء الأظافر لمنع تذبل العينات.

2. التكفير المناعي الكروماتين

  1. جمع الخلايا، والربط المتبادل، والتحلل الخلوي والنووية، وتفتيت الحمض النووي
    1. ثقافة ما يقرب من 5 ×10 6 خلايا / مل في طبق 150 ملم لكل عينة.
    2. إزالة ثقافة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الجليد الباردة 1x PBS.
    3. إصلاح الخلايا مع 1٪ حل الفورمالديهايد-PBS، ووضع لوحات على شاكر المدارية، والتحريض بلطف لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: الفورمالديهايد متقلب; إعداد حل عمل جديد دائما. في بعض الحالات ، يحتوي محلول الفورمالديهايد على الميثانول لتثبيته ، ولكن من الأفضل استخدام محلول خال من الميثانول لتجنب التداخل مع ردود الفعل المصب.
    4. وقف التثبيت مع 125 mM الجليسين واحتضان على شاكر المداري مع التحريض لطيف لمدة 5 دقائق في 25 °C.
    5. وضع لوحات على الجليد وغسل مرتين مع الجليد الباردة 1x PBS.
    6. كشط الخلايا في الجليد الباردة 1x PBS ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 مل.
    7. طرد الخلايا في 2500 س غ لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    8. يستنشق بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 2 مل من العازلة تحلل الخلية [5 mM PIPES pH 8.0، 85 MM KCl، 0.5٪ NP-40، 1x PIC (كوكتيل مثبطات البروتيز)] واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    9. الطرد المركزي تعليق الخلية في 2500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    10. تجاهل بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 500-1500 ميكرولتر من العازلة تحلل النووية (50 mM تريس-HCl pH 8.0، 10 M EDTA درجة الحموضة 8.0، 0.8٪ SDS، 1x PIC) واحتضان على الجليد لمدة 30-60 دقيقة. نقل الليسترات إلى أنبوب البوليسترين المخروطية مناسبة ل sonication.
      ملاحظة: بما أن المخزن المؤقت للتحلل النووي يحتوي على SDS، فإنه سيعجل على الجليد، وسوف يتحول الحل إلى اللون الأبيض. يجب أن يتحول الحل شفافا بعد sonication.
    11. Sonicate lysate لقص الحمض النووي إلى متوسط حجم جزء من 300-1000 نقطة أساس.
      ملاحظة: يجب تعيين دورات sonication المناسبة والشروط وفقا لنوع الخلية ومعدات sonication. شظايا أصغر من 200 نقطة أساس ليست مناسبة لChIP، لأن التفاعلات بين الحمض النووي والنوكليوسوم يمكن أن تتعطل.
  2. عكس الوصلات المتقاطعة ، وتحديد أحجام شظايا sonicated
    1. إخراج 100 ميكرولتر من العينة سونيكاتيد للتحقق من حجم جزء من الكروماتين سونيكاتيد. يجب تخزين الكروماتين المتبقي عند -80 درجة مئوية.
    2. إضافة 0.5 ملغم / مل RNase A إلى كل 100 ميكرولتر من العينة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتنشيط RNase.
    3. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. في اليوم التالي، إضافة 500 ميكروغرام / مل من البروتين K و 0.5٪ SDS، واحتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
    5. إضافة 0.5 حجم الفينول و 0.5 حجم الكلوروفورم isoamyl مزيج الكحول (24:1) إلى كل عينة.
    6. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    7. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    8. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    9. إضافة 1 حجم الكلوروفورم isoamyl مزيج الكحول (24:1) إلى كل عينة.
    10. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    11. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    12. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    13. إضافة 2.5 أحجام من الإيثانول 96٪ وحجم 0.1 من 3 M Na-خلات الأسيتات الأسكتية 5.2.
    14. حضانة لمدة 20 دقيقة على الأقل في −80 درجة مئوية.
    15. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    16. إزالة الإيثانول وغسل بيليه مع 400 ميكرولتر من الإيثانول 70٪.
    17. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    18. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه.
    19. Resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من TE.
    20. تشغيل العينات على هلام agarose 0.8٪. يجب أن يكون حجم الكروماتين سونيكاتيد حوالي 500 نقطة أساس.
      ملاحظة: استخدام بروموفينول الأزرق خالية تحميل العازلة لأن حجم هذه الصبغة هو ما يقرب من 500 نقطة أساس، والتي يمكن أن تزعج الكشف السليم من شظايا الكروماتين. بدلا من ذلك، فمن المستحسن استخدام تحميل المخزن المؤقت تكملها xylene-سيانول، وهو ما يقرب من 3،000 نقطة أساس.
    21. إذا كان حجم الكروماتين مقبولا، قم بتخفيف عينات الكروماتين المجمدة من الخطوة 2.1. في 3 مجلدات من تخفيف العازلة (10 mM تريس-HCl pH 8.0، 0.5 mM EGTA pH 8.0، 1٪ تريتون X-100، 140 mM NaCl، 1x PIC) وخلط العينات عن طريق التناوب لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتخفيف SDS الموجودة في العازلة تحلل النووية لتجنب التداخل مع ردود الفعل المصب، بما في ذلك قياس تركيز الكروماتين.
    22. قياس تركيز الحمض النووي لعينات الكروماتين في 260/280 نانومتر باستخدام مطياف.
  3. إعداد الخرز، ما قبل التطهير، و سرعة المناعة
    1. إعداد الخرز (الأغنام المضادة للأرنب أو الماوس IgG) لخطوات ما قبل التطهير والمناعة. غسل الخرز مرتين لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية مع RIPA العازلة (50 mM تريس-HCl pH 8.0، 1 mM EDTA pH 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ Na-DOC، 0.1٪ SDS، 150 mM NaCl و 1X PIC).
    2. Resuspend الخرز في نفس وحدة التخزين من المخزن المؤقت RIPA كما في الخطوة 2.3.1.
    3. واضحة مسبقا 25-30 ميكروغرام كروماتين من كل عينة مع 4 ميكرولتر من الخرز عن طريق التناوب لمدة 1-2 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: إضافة RIPA المخزن المؤقت لكل عينة كروماتين تصل إلى 500 ميكرولتر من حجم النهائي للسماح للنماذج مزيج بشكل صحيح تحت دوران. لا تنسى أن تأخذ بها الكروماتين لNAC (لا تحكم الأجسام المضادة) وTIC (التحكم في إجمالي المدخلات) في حالة كل مجموعة عينة. تتطلب TICs فقط حجم نهائي يصل إلى 200 ميكرولتر.
    4. عجل الخرز مع المغناطيس ونقل supernatant إلى أنبوب جديد microcentrife.
    5. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة لكل عينة الكروماتين (باستثناء NAC وTIC) وتدوير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    6. في اليوم التالي، أضف 40 ميكرولتر من الخرز المغسول إلى كل عينة (باستثناء TIC) واحتضانها بين عشية وضحاها، بالتناوب عند 4 درجات مئوية.
  4. غسل
    1. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من الملح المنخفض العازلة (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 150 mM NaCl، 2 mM EDTA درجة الحموضة 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، 1x PIC) لمدة 10 دقيقة عن طريق التناوب في 4 درجة مئوية.
    2. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من العازلة الملح العالي (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 300 م م NaCl، 2 mM EDTA درجة الحموضة 8.0، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، 1x PIC) لمدة 10 دقيقة عن طريق التناوب في 4 درجة مئوية.
    3. غسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر من العازلة LiCl (250 mM LiCl، 1٪ NP-40، 1٪ Na-DOC، 1 mM EDTA pH 8.0، 10 mM Tris-HCl pH 8.0، 1x PIC) لمدة 10 دقائق عن طريق الدوران عند 4 درجة مئوية.
    4. اغسل مرتين مع 300 ميكرولتر من TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0، 1 mM EDTA pH 8.0) لمدة 10 دقائق عن طريق الدوران، للغسل الأول عند 4 درجات مئوية، والغسيل الثاني عند 25 درجة مئوية.
  5. إلوتيون
    1. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة elution (1٪ SDS و 100 mM NaHCO3) إلى الخرز واحتضان في 65 درجة مئوية في شاكر الحرارية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر (حوالي 400 دورة في الدقيقة). نقل supernatant إلى أنبوب جديد والخرز elute مرة أخرى في 200 ميكرولتر من العازلة Elution. الجمع بين eluates (400 ميكرولتر الحجم النهائي).
    2. أضف NaCl إلى تركيز نهائي قدره 200 mM في كل عينة. تكملة عينات TIC مع 200 ميكرولتر من العازلة Elution وإضافة NaCl كذلك.
      ملاحظة: من هذه الخطوة، يجب معالجة TIC تحت نفس الشروط مثل العينات الأخرى.
    3. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية (دون اهتزاز) لمدة 6 ساعة على الأقل.
    4. أضف 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ إلى كل عينة، وتناوب الأنابيب مرتين لخلطها، وعجل الحمض النووي بين عشية وضحاها عند −80 درجة مئوية.
    5. في اليوم التالي، الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 13،000 × ز في 4 درجة مئوية.
    6. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 70٪ EtOH.
    7. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. تجاهل supernatant والهواء الجاف الكريات.
    9. Resuspend الكريات في 100 ميكرولتر من TE وإضافة 0.5 ملغم / مل من RNase A إلى كل عينة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتنشيط RNase.
  6. عكس الربط المتداخل
    1. إضافة 500 ميكروغرام / مل من البروتين K و 0.5٪ SDS ثم احتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: إذا الشروع في ChIP-seq، تجنب استخراج الفينول الكلوروفورم، كما أنه يمنع عملية NGS المصب. وبدلا من ذلك، يوصى باستخدام مجموعة أدوات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    2. إضافة 0.5 حجم الفينول و 0.5 حجم مزيج الكحول الكلوروفورم isoamyl (24:1) إلى كل عينة.
    3. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    5. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
    6. أضف 1 حجم من مزيج الكحول الكلوروفورم isoamyl (24:1) إلى كل عينة.
    7. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
    8. جهاز طرد مركزي عند 13,000 x g لمدة 10 دقائق.
    9. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
  7. استخراج الحمض النووي
    1. إضافة 2.5 أحجام من الإيثانول 96٪ وحجم 0.1 من 3 M Na-خلات الأسيتات الأسكتية 5.2.
    2. حضانة لمدة 20 دقيقة على الأقل في −80 درجة مئوية.
    3. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. إزالة الإيثانول وغسل بيليه مع 400 ميكرولتر من الإيثانول 70٪.
    5. طرد مركزي العينات في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    6. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه.
    7. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر من TE.

النتائج

يمكن تحقيق دراسة عمليات الإصلاح التي يسببها DSB الموجهة من الموقع في الخلايا عن طريق العدوى المستقرة أو العابرة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العدوى المستقرة تضمن وجود مجموعة خلايا متجانسة ، مما يعطي استجابة خلوية موحدة وبالتالي أكثر موثوقية. في حالة العدوى العابرة ، فإن نسبة صغيرة فقط من ?...

Discussion

على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتوسع بسرعة بمساعدة طرق كيميائية حيوية ومجههرية مختلفة. الحفاظ على المعلومات الوراثية أمر بالغ الأهمية للخلايا لأن الطفرات التي تحدث في الجينات المشاركة في عمليات الإصلاح هي من بين الأسباب الرئيسية لنشأة الورم وب...

Disclosures

اي

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل منحة المكتب الوطني للبحوث والتطوير والابتكار GINOP-2.3.2-15-2016-00020، GINOP-2.3.2-15-2016-00036، GINOP-2.2.1-15-2017-00052، EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009، NKFI-FK 132080، منحة أبحاث يانوس بولياي التابعة للأكاديمية المجرية للعلوم BO/27/20، ÚNKP-20-5-SZTE-265، زمالة إمبو قصيرة الأجل 8513، ومؤسسة تيمبوس.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), StabilizedSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibodyAbcamab26350
Bovine Serum Fraction V albuminBioseraPM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading BufferThermo Fisher Scientific10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-GlutamineLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
EthanolMolar Chemicals02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approvedGibcoECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acidSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Isoamyl alcoholSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
PhenolSigma AldrichP4557
PIPESSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Protease Inhibitor Cocktail Set IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antibodyAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Acetate-EDTA bufferSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsin from porcine pancreasSigma AldrichT4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 DSBs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved