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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Resumen

Las células se exponen continuamente a diversos agentes perjudiciales del ADN, induciendo diferentes respuestas celulares. La aplicación de enfoques bioquímicos y genéticos es esencial para revelar eventos celulares asociados con el reclutamiento y el ensamblaje de complejos de reparación del ADN en el sitio del daño del ADN. En los últimos años, se han desarrollado varias herramientas poderosas para inducir daños en el ADN específicos del sitio. Además, las nuevas técnicas seminales nos permiten estudiar estos procesos a nivel de resolución unicelular utilizando células fijas y vivas. Aunque estas técnicas se han utilizado para estudiar diversos procesos biológicos, aquí presentamos los protocolos más ampliamente utilizados en el campo de la reparación del ADN, inmunotinción por fluorescencia (IF) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que en combinación con el daño del ADN específico del sitio basado en endonucleasa permiten visualizar y cuantificar la ocupación genómica de los factores de reparación del ADN de una manera dirigida y regulada, respectivamente. Estas técnicas proporcionan herramientas poderosas para que los investigadores identifiquen nuevas proteínas unidas al locus genómico dañado, así como sus modificaciones postraduccionales necesarias para su regulación de ajuste fino durante la reparación del ADN.

Introducción

Nuestro genoma está siendo constantemente desafiado por varios agentes dañinos del ADN. Estos ataques pueden derivar de fuentes ambientales, como la luz UV o la irradiación, así como de fuentes endógenas, como subproductos metabólicos causados por estrés oxidativo o errores de replicación1,2. Estas lesiones pueden afectar la integridad de una o ambas cadenas de ADN, y si los errores generados se vuelven persistentes, con frecuencia conduce a translocaciones e inestabilidad del genoma, lo que puede resultar en tumorigénesis3,4. Para mantener la integridad del genoma, se han desarrollado múltiples sistemas de reparación durante la evolución. De acuerdo con las propiedades químicas y físicas de tipos específicos de daño en el ADN, se pueden activar múltiples mecanismos de reparación. Los desajustes, los sitios abásicos, las roturas de una sola cadena y la 8-oxoguanina (8-oxoG) se pueden eliminar mediante la reparación de desajuste o la vía de reparación de escisión de bases5,6. Las lesiones causadas por fotoproductos inducidos por uv y aductos voluminosos pueden ser reparados ya sea por reparación de nucleótido-escisión (NER) o reparación de rotura de doble cadena de ADN (DSBR) proceso7,8. NER consiste en dos sub-vías principales: NER acoplado a transcripción (TC-NER) y NER genómico global (GG-NER). En cuanto a la fase del ciclo celular, tras la inducción de ruptura de doble cadena del ADN, se pueden activar dos sub-vías: unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR)1,9. Nhej, que es la vía dominante en las células en reposo, se puede activar en todas las fases del ciclo celular, lo que representa una vía más rápida pero propensa aerrores 10. Por otro lado, la FC es una vía libre de errores, en la que los DSBs se reparan en base a la búsqueda de secuencia-homología de las cromátidas hermanas, por lo que está presente principalmente en las fases11del ciclo celular S y G2. Además, la unión final mediada por microhomología (MMEJ) es otro mecanismo de reparación DSB, distinto de los ya mencionados, basado en una forma independiente de KU70/80 y RAD51 de re-ligadura de secuencias microhomólogas previamente resecadas flanqueando los extremos de ADN rotos. Por lo tanto, se considera que mmej es propenso a errores y altamente mutagénico12. Durante la reparación del ADN, los DSB pueden inducir la respuesta de daño al ADN (DDR), lo que resulta en la activación de quinasas de punto de control que detienen el ciclo celular durante la reparación13,14,15. El DDR se activa como respuesta al reclutamiento y la difusión extensa de los jugadores dominantes del iniciador del proceso de la reparación alrededor de las lesiones, contribuyendo a la formación de un foco de la reparación. En esta cascada de señalización temprana, la quinasa ATM (Ataxia Telangiectasia Mutada) juega un papel fundamental al catalizar la fosforilación de la variante de histonas H2AX en Ser139 (denominada γH2AX) alrededor de la lesión16. Este evento temprano es responsable de la contratación de factores de reparación adicionales y el inicio de los procesos de reparación aguas abajo. Aunque la función exacta de las proteínas reclutadas en el foco de la reparación todavía no se haya caracterizado completamente, la formación y la dinámica de los focos de la reparación han sido investigadas por varios laboratorios. Estos marcadores se utilizan ampliamente para seguir la cinética de reparación, pero su papel preciso durante el proceso de reparación sigue siendo difícil de alcanzar. Debido a la gran importancia pero la comprensión pobre de los procesos celulares reparación-relacionados de la DNA, varios métodos se han desarrollado hasta ahora para inducir y para visualizar el DDR.

Se han establecido varios métodos y sistemas para inducir el tipo deseado de daño en el ADN. Por ejemplo, algunos agentes [como la neocarzinostatina (NCS), la fleomicina, la bleomicina, la γ-irradiación, los rayos UV] pueden inducir un gran número de roturas aleatorias del ADN en posiciones genómicas no predictivas, mientras que otros (endonucleasas, como AsiSI, I-PpoI o I-SceI, así como el rayado láser) pueden inducir roturas de ADN en loci genómicos conocidos17,18,19,20,21. Aquí, nos centramos en las técnicas basadas en endonucleasas utilizadas actualmente para estudiar el DDR en células de mamíferos y levaduras. Aparte de destacar los principios de estas técnicas, hacemos hincapié tanto en sus ventajas como en sus desventajas.

Protocolo

1. Inmunodetección de proteínas específicas

  1. Preparación del cultivo celular y configuración experimental
    1. Mantenga las células de U2OS en monocapas en el medio de cultivo de DMEM complementado con el suero fetal del becerro del 10%, la glutamina de 2 milímetros, y la solución antibiótico-antimicótica del 1%.
      NOTA: Para la inducción de daño en el ADN basada en endonucleasas, utilice un medio tratado con carbón o libre de esteroides para evitar fugas en el sistema.
    2. Crecen células en un ambiente humidificado al 5% deCO2 a 37 °C hasta un 80% de confluencia, renovando el medio cada 2-3 días.
    3. Aspirar el medio y lavar las células con 1x PBS. Desconecte las células con la solución de tripsina-EDTA. Cuando las células se desprenden, detenga la actividad de la tripsina agregando un medio de cultivo a las células, produciendo una suspensión celular.
    4. Cuente las celdas utilizando una cámara de recuento de celdas. Placa 2 x 104 células/mL/pozo en una placa de 24 pozos, con tapas redondas estériles de 12 mm en cada pozo.
    5. Incubar las células durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% deCO2 para permitir la fijación a las cubiertas.
    6. Trate las células con 10 ng/mL de neocarzinostatina (NCS) pipeteando directamente el agente dañino al medio cultivado. Incube las células con el medio que contiene NCS durante 15 min, luego lávelas con 1x PBS y agregue un medio de cultivo fresco y complementado a las células. De lo contrario, utilice el agente apropiado (es decir, 4-OHT) para inducir DSBs a través de sistemas basados en endonucleasas sin actualizar el medio22.
      NOTA: Alternativamente, utilice la irradiación para inducir daño en el ADN, que va desde 30 min hasta 8 h de tiempo de recuperación mediante el uso de flujo de neutrones entre 2-20 Gy23.
    7. Incubar células durante 1-8 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% deCO2 para seguir la cinética de reparación del ADN.
  2. Fijación de células
    NOTA: Se deben utilizar 300-500 μL de soluciones/pozo en los siguientes pasos (pasos 1.2-1.5) para cubrir todas las células adecuadamente. Cada paso de incubación y lavado (excepto la incubación de anticuerpos) debe realizarse en una coctelera orbital con agitación suave.
    1. Después de la inducción DSB y la incubación de células, retire el medio de las células adjuntas y lave las células una vez con 1x PBS.
    2. Fije las células con la solución del formaldehído-PBS del 4% por 20 minutos en el °C 25.
  3. Permeabilización de células
    1. Retire la solución de fijación y lave las celdas tres veces con 1x PBS durante 5 min cada una.
    2. Retire el PBS y agregue 0.2% Triton X-100 disuelto en PBS. Incubar las muestras durante 20 min.
  4. Bloqueo de sitios de enlace no específicos
    1. Lave las células tres veces con 1x PBS.
    2. Bloquee los sitios de unión inespecítimos con BSA al 5% (albúmina de la fracción V del suero bovino) diluido en PBST (1x PBS complementado con Tween-20 del 0,1%). e incube las muestras permeabilizadas por lo menos 20 minutos.
  5. Tinción de inmunofluorescencia
    1. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo primario (es decir, anti-γH2AX, anti-ADN-PKcs) diluido en solución de BSA-PBST al 1%. Coloque cada cubrebocas boca abajo sobre una película de parafina sobre una gota de 10 μL del anticuerpo anti-γH2AX diluido.
      NOTA: En caso de co-inmunosuficiente diluir adecuadamente ambos anticuerpos en la misma solución de BSA-PBST al 1%.
    2. Incubar las muestras en una cámara de humedad durante 1,5 h a 4 °C.
      NOTA: La incubación también se puede realizar a 4 °C durante la noche.
    3. Coloque los cubrebocas de nuevo siendo lateral hacia arriba en la placa de 24 pozos y lave tres veces durante 5 minutos con 1x PBS.
    4. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo secundario diluido en BSA-PBST al 1%. Coloque cada cubrebocas boca abajo sobre una película de parafina sobre una gota de 10 μL del anticuerpo diluido.
    5. Incubar las muestras en una cámara de humedad a 4 °C durante 1 h.
    6. Coloque los cubrebocas de nuevo siendo lateral hacia arriba en la placa de 24 pozos y lave tres veces durante 5 minutos con 1x PBS.
    7. Antes de retirar la última solución de lavado de PBS, saque suavemente las tapas con una pinza y una aguja y luego colóquelas boca abajo en portaobjetos de vidrio con gotitas de medio de montaje (complementadas con DAPI).
      NOTA: Evite la formación de burbujas de aire. Cuando el medio de montaje se seca, se recomienda sellar los bordes de las cubiertas con esmalte de uñas para evitar el arrugamiento de las muestras.

2. Inmunoprecipitación de la cromatina

  1. Colección celular, reticulado, lisis celular y nuclear, y fragmentación del ADN
    1. Cultivo de aproximadamente 5 x 106 células/mL en un plato de 150 mm para cada muestra.
    2. Retire el medio de cultivo y lave las células dos veces con 1x PBS helado.
    3. Fije las células con una solución de formaldehído-PBS al 1%, coloque las placas en una coctelera orbital y agite suavemente durante 20 min.
      NOTA: El formaldehído es volátil; siempre prepare una solución de trabajo nueva. En algunos casos, la solución de formaldehído contiene metanol para estabilizarlo, pero es mejor usar una solución libre de metanol para evitar interferencias con las reacciones aguas abajo.
    4. Detenga la fijación con glicina de 125 mM e incube en una coctelera orbital con agitación suave durante 5 min a 25 °C.
    5. Coloque las placas sobre hielo y lave dos veces con 1x PBS helado.
    6. Raspe las células en 1x PBS helado y transfiéralos a tubos cónicos de 15 mL.
    7. Centrifugar las células a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet en 2 mL de tampón de lisis celular [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC (cóctel inhibidor de proteasa)] e incubar sobre hielo durante 10 min.
    9. Centrifugar la suspensión celular a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C.
    10. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspiente el pellet en 500-1.500 μL de tampón de lisis nuclear (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) e incube en hielo durante 30-60 min. Transferir el lisato en un tubo cónico de poliestireno adecuado para la sonicación.
      NOTA: Dado que el tampón de lisis nuclear contiene SDS, se precipitará en el hielo y la solución se volverá blanca. La solución debe volverse transparente después de la sonicación.
    11. Sonicar el lysate para esquiar el ADN a un tamaño promedio de fragmento de 300-1,000 bp.
      NOTA: Los ciclos de sonicación apropiados y las condiciones deben establecerse de acuerdo con el tipo de célula y el equipo de sonicación. Los fragmentos menores de 200 pb no son adecuados para ChIP, porque las interacciones nucleosoma-ADN pueden ser interrumpidas.
  2. Reversión de la reticulación, determinación de tamaños de fragmentos sonicados
    1. Saque 100 μL de la muestra sonicada para verificar el tamaño del fragmento de la cromatina sonicada. La cromatina restante debe almacenarse a −80 °C.
    2. Añadir 0,5 mg/mL de ARNasa A a cada 100 μL de la muestra e incubarlas a 37 °C durante 20 min para activar la ARNasa.
    3. Incubar las muestras a 65 °C durante la noche.
    4. Al día siguiente, añadir 500 μg/mL de proteinasa K y SDS al 0,5%, e incubar las muestras a 50 °C durante 3 h.
    5. Añadir 0,5 volúmenes de fenol y 0,5 volúmenes de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    6. Vórtice durante 1 min.
    7. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    8. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    9. Añadir 1 volumen de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    10. Vórtice durante 1 min.
    11. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    12. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    13. Añadir 2,5 volúmenes de etanol al 96% y 0,1 volúmenes de 3 M Na-Acetato pH 5,2.
    14. Incubar durante al menos 20 min a −80 °C.
    15. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    16. Retire el etanol y lave el pellet con 400 μL de etanol al 70%.
    17. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    18. Retire el etanol y seque al aire el pellet.
    19. Resuspend el pellet en 10 μL de TE.
    20. Ejecute las muestras en un gel de agarosa al 0,8%. El tamaño de la cromatina sonicada debe ser de alrededor de 500 pb.
      NOTA: Utilice un tampón de carga libre de azul de bromofenol porque el tamaño de este tinte es de aproximadamente 500 pb, lo que puede perturbar la detección adecuada de fragmentos de cromatina. En su lugar, se recomienda utilizar un tampón de carga complementado con xileno-cianol, que es de aproximadamente 3.000 pb.
    21. Si el tamaño de la cromatina es aceptable, diluya las muestras de cromatina congeladas del paso 2.1. en 3 volúmenes de tampón de dilución (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) y mezclar las muestras vía rotación durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Este paso es necesario para diluir el SDS presente en el tampón de lisis nuclear para evitar interferencias con reacciones aguas abajo, incluida la medición de la concentración de cromatina.
    22. Mida la concentración de ADN de las muestras de cromatina a 260/280 nm utilizando un espectrofotómetro.
  3. Preparación de perlas, pre-limpieza e inmunoprecipitación
    1. Prepare las cuentas (ovejas anti-conejo o ratón IgG) para los pasos de pre-limpieza e inmunoprecipitación. Lave las perlas dos veces durante 10 min a 4 °C con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl y 1X PIC).
    2. Resuspend las cuentas en el mismo volumen de buffer RIPA que en el paso 2.3.1.
    3. Pre-claro 25-30 μg de cromatina de cada muestra con 4 μL de las perlas vía rotación durante 1-2 h a 4 °C.
      NOTA: Agregue tampón RIPA a cada muestra de cromatina hasta 500 μL de volumen final para permitir que las muestras se mezclen correctamente bajo rotación. No olvide sacar cromatina para NAC (No Antibody Control) y TIC (Total Input Control) en el caso de cada conjunto de muestras. Los TICs solo requieren un volumen final de hasta 200 μL.
    4. Precipitar las perlas con un imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    5. Agregue la cantidad adecuada de anticuerpos a cada muestra de cromatina (excepto NAC y TIC) y gire durante la noche a 4 °C.
    6. Al día siguiente, agregue 40 μL de cuentas lavadas a cada muestra (excepto TIC) e incubarlas durante la noche, girando a 4 °C.
  4. Lavado
    1. Lavar una vez con 300 μL de tampón bajo en sal (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) durante 10 min por rotación a 4 °C.
    2. Lavar una vez con 300 μL de tampón high salt (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) durante 10 min por rotación a 4 °C.
    3. Lavar una vez con 300 μL de tampón de LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) durante 10 min mediante rotación a 4 °C.
    4. Lavar dos veces con 300 μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) durante 10 min por rotación, para el primer lavado a 4 °C, y el segundo lavado a 25 °C.
  5. Elución
    1. Añadir 200 μL del tampón de elución (1% SDS y 100 mM NaHCO3)a las perlas e incubar a 65 °C en un termo-agitador durante 15 min con agitación continua (aprox. 400 RPM). Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y elute perlas de nuevo en 200 μL de tampón de elución. Combinar eluatos (400 μL de volumen final).
    2. Añadir NaCl a una concentración final de 200 mM en cada muestra. Complemente las muestras tic con 200 μL de almacenador intermediario de elución y agregue NaCl también.
      Nota : a partir de este paso, TIC debe controlarse en las mismas condiciones que los otros ejemplos.
    3. Incubar las muestras a 65 °C (sin agitar) durante al menos 6 h.
    4. Agregue 1 mL de etanol frío al 100% a cada muestra, gire los tubos dos veces para mezclar y precipite el ADN durante la noche a −80 °C.
    5. Al día siguiente, centrífuga durante 30 min a 13.000 x g a 4 °C.
    6. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 70% de EtOH.
    7. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    8. Deseche el sobrenadante y seque al aire los pellets.
    9. Resuspend los pellets en 100 μL de TE y añadir 0,5 mg/mL de ARNasa A a cada muestra. Incubar a 37 °C durante 20 min para activar la ARNasa.
  6. Inversión de la reticulación
    1. Añadir 500 μg/mL de proteinasa K y 0,5% sds luego incubar las muestras a 50 °C durante 2 h.
      NOTA: Si procede a ChIP-seq, evite la extracción de fenol-cloroformo, ya que inhibe el proceso ngs aguas abajo. En su lugar, se recomienda utilizar un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
    2. Añadir 0,5 volúmenes de fenol y 0,5 volúmenes de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    3. Vórtice durante 1 min.
    4. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    5. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    6. Añadir 1 volumen de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    7. Vórtice durante 1 min.
    8. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    9. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  7. Extracción de ADN
    1. Añadir 2,5 volúmenes de etanol al 96% y 0,1 volúmenes de 3 M Na-Acetato pH 5,2.
    2. Incubar durante al menos 20 min a −80 °C.
    3. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    4. Retire el etanol y lave el pellet con 400 μL de etanol al 70%.
    5. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    6. Retire el etanol y seque al aire el pellet.
    7. Resuspend el pellet en 50 μL de TE.

Resultados

El estudio de los procesos de reparación inducidos por DSB dirigidos al sitio en las células se puede lograr a través de la transfección estable o transitoria. Sin embargo, cabe señalar que la transfección estable asegura una población celular homogénea, lo que da una respuesta celular unificada y por lo tanto más confiable. En el caso de la transfección transitoria, sólo una pequeña proporción de la población celular toma y mantiene el plásmido, lo que introduce diversidad en el experimento. El establecim...

Discusión

Aunque la reparación de la DNA sea un campo de investigación relativamente reciente, nuestro conocimiento se está ampliando rápidamente con la ayuda de varios métodos bioquímicos y microscópicos. Preservar la información genética es crucial para las células, ya que las mutaciones que ocurren en los genes involucrados en los procesos de reparación se encuentran entre las principales causas de tumorigénesis y, por lo tanto, es esencial dilucidar los pasos clave de las vías de reparación del ADN.

Divulgaciones

Ninguno

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la subvención de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la Beca de Investigación János Bolyai de la Academia Húngara de Ciencias BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la beca de corta duración EMBO 8513 y la Fundación Tempus.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), StabilizedSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibodyAbcamab26350
Bovine Serum Fraction V albuminBioseraPM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading BufferThermo Fisher Scientific10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-GlutamineLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
EthanolMolar Chemicals02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approvedGibcoECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acidSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Isoamyl alcoholSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
PhenolSigma AldrichP4557
PIPESSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Protease Inhibitor Cocktail Set IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antibodyAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Acetate-EDTA bufferSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsin from porcine pancreasSigma AldrichT4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054

Referencias

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  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
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  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
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  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
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