可视化和量化基于内分泌酶的站点特定DNA损伤

摘要

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的基本步骤。这些协议通常用于研究DNA损伤相关的细胞过程，并可视化和量化与DNA修复有关的蛋白质的招募。

摘要

细胞不断暴露在各种DNA损伤剂中，诱导不同的细胞反应。应用生化和遗传方法对于揭示与DNA损伤现场DNA修复复合物的招募和组装相关的细胞事件至关重要。在过去几年中，已经开发出几个强大的工具来诱导特定地点的DNA损伤。此外，新的开创性技术使我们能够使用固定细胞和活细胞在单细胞分辨率水平上研究这些过程。虽然这些技术已被用于研究各种生物过程，但在此我们提出了DNA修复、荧光免疫染色 （IF） 和色度素免疫沉淀 （ChIP） 领域使用最广泛的协议，这些协议结合了基于内分泌酶的特定部位 DNA 损伤，从而能够以定向和调节的方式可视化和量化 DNA 修复因子的基因组占用率， 分别。这些技术为研究人员提供了强大的工具，以识别与受损基因组细胞落结合的新型蛋白质，以及它们在DNA修复过程中微调调节所需的转化后修饰。

引言

我们的基因组不断受到各种DNA破坏剂的挑战。这些攻击可能来自环境来源，如紫外线或辐照，以及内源源，如代谢副产品造成的氧化应激或复制错误^1，2。这些病变会影响一个或两个DNA链的完整性，如果生成的错误变得持久，它经常导致转移和基因组不稳定，这可能导致肿瘤^3，4。为了保持基因组完整性，在进化过程中开发了多个修复系统。根据特定类型DNA损伤的化学和物理特性，可以激活多个修复机制。不匹配，基本站点，单线断裂，和8-牛瓜氨酸（8-oxoG）可以通过不匹配修复或基切除修复路径^5，6去除。由紫外线诱发的光产品和笨重的副产品引起的病变可以通过核苷酸切除修复 （NER） 或 DNA 双链断裂修复 （DSBR） 过程^7，8来修复。NER 由两个主要子通路组成:转录耦合 NER （TC-NER） 和全球基因组 NER （GG-NER）。关于细胞周期阶段，在DNA双链断裂诱导后，可以激活两个子通路:非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）1，9。NHEJ是静息细胞的主要通路，可以在所有细胞周期阶段激活，代表一个更快但容易出错的通路^10。另一方面，HR是一个无差错的途径，其中DSB修复基于序列同源搜索的姐妹染色体，因此它主要存在于S和G2细胞周期阶段^11。此外，微家学介质端连接 （MMEJ） 是另一种 DSB 修复机制，与上述机制不同，基于 KU70/80 和 RAD51 独立的方法，将先前重新分离的微霍洛序列重新连接在破碎的 DNA 末端两侧。因此，MMEJ被认为是容易出错和高度诱变的^12。在DNA修复过程中，DSB可以诱导DNA损伤反应（DDR），这导致激活检查点激酶，在修复期间停止细胞周期13，14，15。DDR 被激活，以响应围绕病变的修复过程的发起人和发起人关键参与者的广泛传播，从而有助于形成修复重点。在这个早期的信号级联中，ATM（阿塔夏泰兰吉拉氏突变）激酶通过在病变¹⁶周围促进Histone变异H2AX（称为+H2AX）的磷化起着关键作用。这一早期事件负责招募额外的维修因素和启动下游维修流程。虽然在修复重点中招募的蛋白质的确切功能尚未完全确定，但几个实验室已经对修复foci的形成和动力学进行了调查。这些标记被广泛用于跟踪修复动能，但它们在修复过程中的精确作用仍然难以捉摸。由于对DNA修复相关细胞过程的重要性，但缺乏了解，迄今已开发出几种方法来诱导和可视化DDR。

建立了各种方法和系统来诱导所需的DNA损伤类型。例如，一些代理 [如新卡齐诺他汀 （NCS）， 异黄素， 白细胞素，γ照射，紫外线]可以诱导大量的随机DNA断裂在非预测基因组位置，而其他（内核素，如AsiSI，I-PpoI或I-SceI，以及激光剥离）可以诱导DNA断裂在已知的基因组洛西17，18，19，20，21。在这里，我们专注于目前用于研究哺乳动物和酵母细胞中的DDR的内分泌酶技术。除了强调这些技术的原则外，我们还强调它们的优点和缺点。

研究方案

1. 特定蛋白质的免疫检测

1. 细胞培养和实验设置的准备
   1. 在DMEM培养基的单层中保持U2OS细胞，辅以10%胎儿小腿血清、2mM谷氨酰胺和1%抗生素抗菌溶液。
      注意:对于基于内分泌酶的DNA损伤诱导，使用木炭处理或无类固醇介质，以避免系统泄漏。
   2. 在潮湿的 5% CO₂ 环境中在 37 °C 至 80% 的汇合度下生长细胞，每 2-3 天更新一次介质。
   3. 吸气介质，用1倍PBS清洗细胞。分离细胞与特林-EDTA解决方案。当细胞分离时，通过在细胞中加入培养介质来停止试金素活性，从而产生细胞悬浮。
   4. 使用细胞计数室计算细胞。板 2 x 10⁴ 细胞/mL/井在 24 井板上，每个井有无菌的 12 mm 圆形覆盖唇。
   5. 在潮湿的 5% CO 2 大气中，在 37 °C 下孵育₂₄ 小时的细胞，以便附着在覆盖唇上。
   6. 用10纳克/mL的新卡齐诺他汀（NCS）治疗细胞，将有害剂直接输送到培养的介质上。用含有NCS的介质孵育细胞15分钟，然后用1x PBS清洗它们，并在细胞中加入新鲜的补充培养介质。否则，使用适当的代理（即4-OHT）通过基于内分泌酶的系统诱导DSB，而不刷新介质^22。
      注意:或者，使用辐照诱导DNA损伤，从30分钟到8小时的恢复时间，使用中子通量之间的2-20Gy^23。
   7. 在潮湿的 5% CO₂ 大气中在 37 °C 下孵育 1-8 小时的细胞，以遵循 DNA 修复的动力学。
2. 固定单元格
   注:300-500 μL 的解决方案/井应用于以下步骤（步骤 1.2-1.5），以充分覆盖所有单元格。每个孵化和洗涤步骤（抗体孵化除外）应在具有温和搅拌的轨道摇床上进行。
   1. 在DSB诱导和细胞孵化后，从附着的细胞中取出介质，用1x PBS清洗细胞一次。
   2. 在 25 °C 下用 4% 甲醛-PBS 溶液修复细胞 20 分钟。
3. 细胞的渗透
   1. 拆下固定溶液，用 1x PBS 清洗电池三次，每次 5 分钟。
   2. 取出 PBS 并添加 0.2% 的 Triton X-100 溶解在 PBS 中。将样品孵化20分钟。
4. 阻止非特定绑定站点
   1. 用 1x PBS 清洗细胞三次。
   2. 用PBST稀释的5%BSA（牛血清分数V白蛋白）（1x PBS补充0.1%Tween-20）阻止非特定的结合点，并孵育渗透样品至少20分钟。
5. 免疫荧光染色
   1. 加入适量的原发性抗体（即抗+H2AX，抗DNA-PKcs）稀释在1%的BSA-PBST溶液中。将每个盖片倒置到石蜡薄膜上，放在稀释的抗 +H2AX 抗体的 10 μL 滴上。
      注意:在共同免疫染色稀释的情况下，在同一1%BSA-PBST溶液中适当稀释两种抗体。
   2. 在 4 °C 的湿度室中将样品孵育 1.5 小时。
      注:孵化也可以在4°C过夜进行。
   3. 将盖片放回侧面放入 24 井板中，用 1x PBS 洗三次 5 分钟。
   4. 加入在 1% BSA-PBST 中稀释的适当量的二级抗体。将每个盖片倒置到石蜡薄膜上，放在稀释抗体的 10 μL 滴上。
   5. 在 4 °C 的湿度室中将样品孵育 1 小时。
   6. 将盖片放回侧面放入 24 井板中，用 1x PBS 洗三次 5 分钟。
   7. 在取出最后的 PBS 洗涤液之前，使用钳子和针头轻轻取出盖片，然后用安装介质液滴（辅以 DAPI）将盖片倒置到玻璃滑梯上。
      注意:避免气泡的形成。当安装介质干燥时，建议用指甲油密封盖唇的边缘，以防止样品枯萎。

2. 色质免疫沉淀

1. 细胞收集、交联、细胞和核裂解以及DNA碎片化
   1. 每个样品在 150 mm 的盘子中培养大约 5 x 10⁶ 个细胞/mL。
   2. 取出培养介质，用冰冷的1x PBS清洗细胞两次。
   3. 用1%甲醛-PBS溶液固定细胞，将板放在轨道摇床上，轻轻搅拌20分钟。
      注:甲醛挥发性:始终准备新的工作解决方案。在某些情况下，甲醛溶液含有甲醇来稳定甲醇，但最好使用无甲醇溶液来避免干扰下游反应。
   4. 停止用125mM甘油固定，并在轨道摇床上孵育，在25°C下轻轻搅拌5分钟。
   5. 将盘子放在冰上，用冰冷的1x PBS洗两次。
   6. 将细胞刮在冰冷的1x PBS中，并将其转移到15mL圆锥管中。
   7. 在 4 °C 下将细胞在 2，500 x g 下离心 5 分钟。
   8. 小心地吸气超高分子，在2mL的细胞裂解缓冲液[5 mM PIPES pH 8.0，85mM KCl，0.5%NP-40，1x PIC（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中重新吸气颗粒]，并在冰上孵育10分钟。
   9. 在 4 °C 下将电池悬架离心2，500 x g，5 分钟。
   10. 小心地丢弃超高分子，在 500-1，500 μL 的核裂解缓冲器（50 mM Tris-HCl pH 8.0，10 m EDTA pH 8.0，0.8% SDS，1x PIC）中重新吸管颗粒，并在冰上孵育 30-60 分钟。将解冻剂转移到适合声波的聚苯乙烯锥形管中。
       注:由于核裂解缓冲器包含SDS，它会沉淀在冰上，溶液将变白。解决方案应在声波化后变为透明。
   11. 将裂解物的声波剪切至平均片段大小为 300-1，000 bp。
       注:应根据细胞类型和声波设备设置相应的声波周期和条件。小于 200 bp 的碎片不适合 ChIP，因为核糖体-DNA 相互作用可能会中断。
2. 反转交互连，确定声波碎片大小
   1. 取出 100 μL 的声波样品，以验证声波色素的碎片大小。剩余的色素应储存在 +80 °C 下。
   2. 将 0.5 毫克/mL RNase A 添加到每 100 μL 的样品中，并在 37 °C 下孵育 20 分钟，以激活 RNase。
   3. 在 65 °C 的夜间孵育样品。
   4. 第二天，加入500微克/mL的蛋白酶K和0.5%的SDS，并在50°C的3小时孵育样品。
   5. 在每个样品中加入0.5卷酚和0.5卷氯仿-二甲基酒精混合物（24:1）。
   6. 漩涡 1 分钟。
   7. 离心机在 13，000 x g 10 分钟。
   8. 将上水相转移到新的微中心导管。
   9. 在每个样品中加入1卷氯仿-二甲酰酒精混合物（24:1）。
   10. 漩涡 1 分钟。
   11. 离心机在 13，000 x g 10 分钟。
   12. 将上水相转移到新的微中心导管。
   13. 加入2.5卷96%乙醇和0.1卷3M纳醋酸pH 5.2。
   14. 在 +80 °C 下孵育至少 20 分钟。
   15. 在 4 °C 下将样品在 13，000 x g 下离心 10 分钟。
   16. 取出乙醇，用 400 微升 70% 乙醇清洗颗粒。
   17. 在 4 °C 下将样品在 13，000 x g 下离心 10 分钟。
   18. 取出乙醇，将颗粒晾干。
   19. 在 10 μL 的 TE 中重新使用颗粒。
   20. 在 0.8% 的玫瑰凝胶上运行样品。声波色素大小应在 500 bp 左右。
       注:使用溴酚蓝色无载料缓冲器，因为这种染料的大小约为500 bp，这可能会干扰染色质片段的正确检测。相反，建议使用加载缓冲器，辅以二甲苯-氰化油，即大约 3，000 bp。
   21. 如果染色质大小可以接受，则从第 2.1 步稀释冷冻染色质样本。在 3 卷稀释缓冲 （10 mM Tris-HCl pH 8.0， 0.5 m EGTA pH 8.0， 1% 特里顿 X-100， 140 mM NaCl， 1x PIC） 和混合样品通过旋转 10 分钟在 4 °C.
       注:此步骤是必要的，以稀释存在于核裂解缓冲器中的SDS，以避免干扰下游反应，包括测量染色质浓度。
   22. 使用光谱光度计测量色度样本在 260/280 nm 下的 DNA 浓度。
3. 珠子的准备、预清理和免疫沉淀
   1. 准备珠子（绵羊抗兔或小鼠IgG）的预清除和免疫沉淀步骤。在 4 °C 下用 RIPA 缓冲器（50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0、1% 特里顿 X-100、0.1% 纳-DOC、0.1% SDS、150 mM NaCl 和 1X PIC）清洗珠子两次，10 分钟洗珠。
   2. 将珠子重新用于与第 2.3.1 步相同的 RIPA 缓冲体积。
   3. 在 4 °C 下通过旋转 1-2 小时，预先清除每个样品的 25-30 μg 色度，并配以 4 μL 的珠子。
      注:将 RIPA 缓冲器添加到每个色度素样本中，最高可达 500 μL 的最终体积，让样品在旋转下正确混合。不要忘记在每个样本集的情况下，为 NAC（无抗体控制）和 TIC（总输入控制）取出染色素。TIC 仅要求最终体积高达 200 μL。
   4. 用磁铁沉淀珠子，将超高分子转移到新的微中心管中。
   5. 将适量的抗体添加到每个染色质样本（NAC 和 TIC 除外），并在 4 °C 下在夜间旋转。
   6. 第二天，在每个样品中加入40微升的洗珠（TIC除外），并在一夜之间孵育，在4°C下旋转。
4. 洗涤
   1. 用 300 μL 低盐缓冲器 （20 m Tris-HCl pH 8.0， 150 m M NaCl， 2 m EDTA pH 8.0， 1% 特里顿 X-100， 0.1% SDS， 1x PIC） 洗一次，10 分钟通过旋转在 4 °C.
   2. 用 300 μL 高盐缓冲器 （20 m Tris-HCl pH 8.0， 300 m M NaCl， 2 m EDTA pH 8.0， 1% 特里顿 X-100， 0.1% SDS， 1x PIC） 洗一次，10 分钟通过旋转在 4 °C.
   3. 用 300 μL 的 LiCl 缓冲器 （250 mM LiCl， 1% NP-40， 1% Na-DOC， 1 m EDTA pH 8.0， 10 mM Tris-HCl pH 8.0， 1x PIC） 洗一次，10 分钟通过旋转在 4 °C.
   4. 用 300 μL 的 TE（10 m M Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0）洗两次，通过旋转洗 10 分钟，第一次在 4 °C 下洗，第二次在 25 °C 洗。
5. 洗脱
   1. 在珠子中加入 200 μL 的洗脱缓冲器（1% SDS 和 100 mM NaHCO_3），在 65 °C 的热摇床中孵育 15 分钟，持续摇晃（约 400 RPM）。在 200 μL 的 Elution 缓冲器中，将超高纳特再次转移到新的管子和易拉珠上。组合 eluates （400 μL 最终卷）。
   2. 将 NaCl 添加到每个样品中最终浓度为 200 mM 的浓度。用 200 μL 的 Elution 缓冲器补充 TIC 样本，并添加 NaCl。
      注:从此步骤中，TIC 应在与其他样品相同的条件下处理。
   3. 在 65 °C（不摇晃）下孵育样品至少 6 小时。
   4. 在每个样品中加入1mL的冷100%乙醇，旋转管子两次混合，并在+80°C下沉淀DNA过夜。
   5. 第二天，离心机在4°C下以13，000 x g 为30分钟。
   6. 丢弃超高超剂，用 70% 的 EtOH 清洗颗粒。
   7. 在 4 °C 下将样品在 13，000 x g 下离心 10 分钟。
   8. 丢弃超高超剂，空气干燥颗粒。
   9. 将颗粒重新消耗在 100 μL 的 TE 中，并在每个样品中加入 0.5 毫克/毫升的 RNase A。在 37 °C 下孵育 20 分钟以激活 RNase。
6. 交互的逆转
   1. 加入 500 μg/mL 的蛋白酶 K 和 0.5% SDS，然后在 50 °C 下孵育样品 2 小时。
      注:如果继续使用 ChIP-seq，请避免提取苯酚-氯仿，因为它会抑制下游 NGS 过程。相反，建议使用市售套件（参见 材料表）。
   2. 在每个样品中加入0.5个苯酚和0.5个氯仿-乙酰酒精混合物（24:1）。
   3. 漩涡 1 分钟。
   4. 离心机在 13，000 x g 10 分钟。
   5. 将上水相转移到新的微中心导管。
   6. 在每个样品中加入1卷氯仿-二甲酰酒精混合物（24:1）。
   7. 漩涡 1 分钟。
   8. 离心机在 13，000 x g 10 分钟。
   9. 将上水相转移到新的微中心导管。
7. 脱氧核糖核酸提取
   1. 加入2.5卷96%乙醇和0.1卷3M纳醋酸pH 5.2。
   2. 在 +80 °C 下孵育至少 20 分钟。
   3. 在 4 °C 下将样品在 13，000 x g 下离心 10 分钟。
   4. 取出乙醇，用 400 微升 70% 乙醇清洗颗粒。
   5. 在 4 °C 下将样品在 13，000 x g 下离心 10 分钟。
   6. 取出乙醇，将颗粒晾干。
   7. 在 50 μL 的 TE 中重新使用颗粒。

结果

研究细胞中由现场指导的DSB诱导修复过程可以通过稳定或瞬态瞬时感染来实现。然而，应该指出的是，稳定的转染确保了同质细胞群，从而提供了统一的、因此更可靠的细胞反应。在瞬态瞬态感染的情况下，只有一小部分细胞群占据并维持质粒，这为实验带来了多样性。建立ER-I-PpoI或ER-AsiSI内分泌酶细胞系统需要50%的汇流细胞群，这更有效地通过编码内分泌酶的质粒进行感染。对于转染，也可使?...

讨论

虽然DNA修复是一个相对较新的研究领域，但我们的知识正在各种生化和微观方法的帮助下迅速扩展。保存遗传信息对细胞至关重要，因为参与修复过程的基因发生突变是肿瘤的主要原因之一，因此阐明DNA修复途径的关键步骤至关重要。

生化技术（即西斑、免疫沉淀、质谱等）需要大量的细胞，所研究的修复过程是所需细胞群的快照。执行 ChIP 实验是费力的，麻烦和许多考虑?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody	Abcam	ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved	Gibco	ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054