Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Résumé

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Résumé

Les cellules sont continuellement exposées à divers agents dommageables de l’ADN, induisant différentes réponses cellulaires. L’application d’approches biochimiques et génétiques est essentielle pour révéler les événements cellulaires associés au recrutement et à l’assemblage de complexes de réparation de l’ADN sur le site des dommages à l’ADN. Au cours des dernières années, plusieurs outils puissants ont été développés pour induire des dommages à l’ADN spécifiques au site. De plus, de nouvelles techniques séminales nous permettent d’étudier ces processus au niveau de résolution unicellulaire en utilisant à la fois des cellules fixes et vivantes. Bien que ces techniques aient été utilisées pour étudier divers processus biologiques, nous présentons ici les protocoles les plus largement utilisés dans le domaine de la réparation de l’ADN, de l’immunomarquage par fluorescence (IF) et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), qui, en combinaison avec les dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase, permettent de visualiser et de quantifier l’occupation génomique des facteurs de réparation de l’ADN de manière dirigée et régulée, respectivement. Ces techniques fournissent aux chercheurs des outils puissants pour identifier de nouvelles protéines liées au locus génomique endommagé ainsi que leurs modifications post-traductionnelles nécessaires à leur régulation fine lors de la réparation de l’ADN.

Introduction

Notre génome est constamment mis à l’épreuve par divers agents nuisibles à l’ADN. Ces agressions peuvent provenir de sources environnementales, telles que la lumière UV ou l’irradiation, ainsi que de sources endogènes, telles que les sous-produits métaboliques causés par le stress oxydatif ou les erreurs de réplication^1,2. Ces lésions peuvent affecter l’intégrité d’un ou des deux brins d’ADN, et si les erreurs générées deviennent persistantes, cela conduit fréquemment à des translocations et à une instabilité du génome, ce qui peut entraîner une tumorigenèse^3,4. Pour maintenir l’intégrité du génome, de multiples systèmes de réparation ont été développés au cours de l’évolution. Selon les propriétés chimiques et physiques de types spécifiques de dommages à l’ADN, de multiples mécanismes de réparation peuvent être activés. Des non-concordances, des emplacements d’abase, des ruptures monocaténaires, et de la 8-oxoguanine (8-oxoG) peuvent être enlevées par la réparation de disparité ou la voie de réparation de base-excision^5,6. Les lésions provoquées par des photoproduits induits par les UV et des adduits encombrants peuvent être réparées soit par la réparation d’excision de nucléotides (NER), soit par le procédé de réparation de rupture double brin de l’ADN (DSBR)^7,8. Le NER se compose de deux sous-voies principales : le NER couplé à la transcription (TC-NER) et le NER génomique global (GG-NER). En ce qui concerne la phase du cycle cellulaire, suite à l’induction de rupture double brin de l’ADN, deux sous-voies peuvent être activées : l’joignantage d’extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR)^1,9. Nhej, qui est la voie dominante dans les cellules au repos, peut être activé dans toutes les phases du cycle cellulaire, ce qui représente une voie plus rapide mais sujette aux erreurs¹⁰. D’autre part, HR est une voie sans erreur, dans laquelle les DSB sont réparés sur la base de la recherche d’homologie de séquence des chromatides sœurs, donc il est principalement présent dans les phases de cycle cellulaire S et G2^11. En outre, l’assemblage d’extrémité microhomologie-négocié (MMEJ) est un autre mécanisme de réparation DSB, distinct de ceux mentionnés ci-dessus, basé sur un KU70/80- et RAD51-indépendant de la re-ligature des séquences microhomologous précédemment réséquées flanquant les extrémités brisées d’ADN. Par conséquent, MMEJ est considéré comme sujet aux erreurs et hautement mutagène¹². Lors de la réparation de l’ADN, les DSB peuvent induire la réponse aux dommages à l’ADN (DDR), ce qui entraîne l’activation des points de contrôle kinases qui arrêtent le cycle cellulaire pendant la réparation^13,14,15. Le DDR est activé en réponse au recrutement et à la diffusion étendue des acteurs clés initiateurs du processus de réparation autour des lésions, contribuant à la formation d’un centre de réparation. Dans cette cascade de signalisation précoce, la kinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) joue un rôle pivot en catalysant la phosphorylation de la variante histone H2AX à Ser139 (appelée γH2AX) autour de la lésion^16. Cet événement précoce est responsable du recrutement de facteurs de réparation supplémentaires et du lancement de processus de réparation en aval. Bien que la fonction exacte des protéines recrutées au centre de réparation n’ait pas encore été entièrement caractérisée, la formation et la dynamique des foyers de réparation ont été étudiées par plusieurs laboratoires. Ces marqueurs sont largement utilisés pour suivre la cinétique de réparation, mais leur rôle précis pendant le processus de réparation reste insaisissable. En raison de la grande importance mais de la mauvaise compréhension des processus cellulaires liés à la réparation de l’ADN, plusieurs méthodes ont été développées jusqu’à présent pour induire et visualiser le DDR.

Diverses méthodes et systèmes ont été mis en place pour induire le type souhaité de dommages à l’ADN. Par exemple, certains agents [tels que la néocarzinostatine (NCS), la phléomycine, la bléomycine, l’irradiation γ, les UV] peuvent induire un grand nombre de cassures d’ADN aléatoires à des positions génomiques non prédictives, tandis que d’autres (endonucléases, telles que AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, ainsi que le striping au laser) peuvent induire des ruptures d’ADN à des loci génomiques connus^{17,18,19,20,21.} Ici, nous nous concentrons sur les techniques à base d’endonucléase actuellement utilisées pour étudier le DDR dans les cellules de mammifères et de levures. En plus de souligner les principes de ces techniques, nous soulignons à la fois leurs avantages et leurs inconvénients.

Protocole

1. Immunodétection de protéines spécifiques

1. Préparation de la culture cellulaire et installation expérimentale
   1. Maintenez les cellules d’U2OS dans des monocouches dans le milieu de culture de DMEM complété avec du sérum foetal de veau de 10%, de la glutamine de 2 mM, et de la solution antibiotique-antimycotique de 1%.
      REMARQUE: Pour l’induction de dommages à l’ADN à base d’endonucléase, utilisez un milieu traité au charbon de bois ou sans stéroïdes pour éviter les fuites du système.
   2. Cultiver les cellules dans un environnement humidifié à 5% de_CO2 à 37 °C jusqu’à 80% de confluence, en renouvelant le milieu tous les 2-3 jours.
   3. Aspirer le milieu et laver les cellules avec 1x PBS. Détachez les cellules avec une solution de trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se détachent, arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant un milieu de culture aux cellules, ce qui donne une suspension cellulaire.
   4. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules. Plaque 2 x 10⁴ cellules/mL/puits sur une plaque de 24 puits, avec des lamelle ronde stériles de 12 mm dans chaque puits.
   5. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de_CO2 pour permettre leur fixation sur les lamelle.
   6. Traiter les cellules avec 10 ng/mL de néocarzinostatine (NCS) en canalisant directement l’agent nocif vers le milieu cultivé. Incuber les cellules avec le milieu contenant du NCS pendant 15 min, puis les laver avec 1x PBS et ajouter du milieu de culture frais et complété aux cellules. Sinon, utilisez l’agent approprié (c’est-à-dire, 4-OHT) pour induire des DSB via des systèmes à base d’endonucléase sans rafraîchir le milieu^22.
      REMARQUE: Alternativement, utiliser l’irradiation pour induire des dommages à l’ADN, allant de 30 min à 8 h de temps de récupération en utilisant un flux de neutrons entre 2-20 Gy²³.
   7. Incuber les cellules pendant 1-8 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de_CO2 pour suivre la cinétique de la réparation de l’ADN.
2. Fixation des cellules
   NOTA : 300 à 500 μL de solutions/puits doivent être utilisés dans les étapes suivantes (étapes 1.2 à 1.5) pour couvrir toutes les cellules de manière adéquate. Chaque étape d’incubation et de lavage (à l’exception de l’incubation d’anticorps) doit être effectuée sur un agitateur orbital avec une agitation douce.
   1. Après l’induction dsb et l’incubation des cellules, retirez le milieu des cellules attachées et lavez les cellules une fois avec 1x PBS.
   2. Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde-PBS à 4 % pendant 20 min à 25 °C.
3. Perméabilisation des cellules
   1. Retirez la solution de fixation et lavez les cellules trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacune.
   2. Retirer le PBS et ajouter 0,2 % de Triton X-100 dissous dans du PBS. Incuber les échantillons pendant 20 min.
4. Blocage de sites de liaison non spécifiques
   1. Lavez les cellules trois fois avec 1x PBS.
   2. Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 5% BSA (albumine de fraction Sérique bovine V) dilué dans du PBST (1x PBS complété par 0,1% Tween-20), et incuber les échantillons perméabilisés pendant au moins 20 min.
5. Coloration par immunofluorescence
   1. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaires (c.-à-d. anti-γH2AX, anti-ADN-PKcs) dilué dans une solution de BSA-PBST à 1 %. Placer chaque lamelle à l’envers sur un film de paraffine sur une gouttelette de 10 μL de l’anticorps anti-γH2AX dilué.
      REMARQUE: En cas de co-immuno-coloration diluer de manière appropriée les deux anticorps dans la même solution BSA-PBST à 1%.
   2. Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité pendant 1,5 h à 4 °C.
      REMARQUE: L’incubation peut également être effectuée à 4 ° C pendant la nuit.
   3. Placez les lamaux de couverture en arrière étant côté vers le haut dans la plaque de 24 puits et lavez trois fois pendant 5 min avec 1x PBS.
   4. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires dilués dans 1 % de BSA-PBST. Placer chaque lamelle à l’envers sur un film de paraffine sur une gouttelette de 10 μL de l’anticorps dilué.
   5. Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité à 4 °C pendant 1 h.
   6. Placez les lamaux de couverture en arrière étant côté vers le haut dans la plaque de 24 puits et lavez trois fois pendant 5 min avec 1x PBS.
   7. Avant de retirer la dernière solution de lavage PBS, retirez délicatement les lamules à l’aide d’une pince à épiler et d’une aiguille, puis placez-les à l’envers sur des lames de verre avec des gouttelettes de support de montage (complétées par du DAPI).
      REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air. Lorsque le support de montage sèche, il est recommandé de sceller les bords des lamelles avec du vernis à ongles pour éviter le ratatinement des échantillons.

2. Immunoprécipitation de la chromatine

1. Collecte cellulaire, réticulation, lyse cellulaire et nucléaire et fragmentation de l’ADN
   1. Culture d’environ 5 x 10⁶ cellules/mL dans une boîte de 150 mm pour chaque échantillon.
   2. Retirer le milieu de culture et laver les cellules deux fois avec du PBS 1x glacé.
   3. Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde-PBS à 1%, placer les plaques sur un agitateur orbital et agiter doucement pendant 20 min.
      NOTA : Le formaldéhyde est volatil; préparez toujours une nouvelle solution de travail. Dans certains cas, la solution de formaldéhyde contient du méthanol pour la stabiliser, mais il est préférable d’utiliser une solution sans méthanol pour éviter toute interférence avec les réactions en aval.
   4. Arrêter la fixation avec de la glycine de 125 mM et incuber sur un agitateur orbital avec agitation douce pendant 5 min à 25 °C.
   5. Placez les plaques sur de la glace et lavez-les deux fois avec du PBS 1x glacé.
   6. Grattez les cellules dans du PBS 1x glacé et transférez-les dans des tubes coniques de 15 mL.
   7. Centrifuger les cellules à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
   8. Aspirer soigneusement le surnageant et ressusciter le culot dans 2 mL de tampon de lyse cellulaire [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (cocktail inhibiteur de protéase)] et incuber sur de la glace pendant 10 min.
   9. Centrifuger la suspension cellulaire à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
   10. Jetez soigneusement le surnageant et ressuscitez la pastille dans 500-1 500 μL de tampon de lyse nucléaire (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) et incuber sur la glace pendant 30-60 min. Transférer le lysat dans un tube conique en polystyrène adapté à la sonication.
       NOTA : Puisque le tampon de lyse nucléaire contient une FDS, il précipitera sur la glace et la solution deviendra blanche. La solution doit devenir transparente après la sonication.
   11. Soniquez le lysat pour ciselé l’ADN à une taille moyenne de fragment de 300-1 000 pb.
       REMARQUE: Les cycles et les conditions de sonication appropriés doivent être réglés en fonction du type de cellule et de l’équipement de sonication. Les fragments inférieurs à 200 pb ne conviennent pas au ChIP, car les interactions nucléosome-ADN peuvent être perturbées.
2. Inversion de la réticulation, détermination de la taille des fragments sonés
   1. Prélever 100 μL de l’échantillon sonique pour vérifier la taille du fragment de la chromatine sonée. La chromatine restante doit être conservée à −80 °C.
   2. Ajouter 0,5 mg/mL de RNase A à chaque 100 μL de l’échantillon et les incuber à 37 °C pendant 20 min pour activer la RNase.
   3. Incuber les échantillons à 65 °C pendant la nuit.
   4. Le lendemain, ajouter 500 μg/mL de protéinase K et 0,5 % de FDS, et incuber les échantillons à 50 °C pendant 3 h.
   5. Ajouter 0,5 volume de phénol et 0,5 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
   6. Vortex pendant 1 min.
   7. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
   8. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
   9. Ajouter 1 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
   10. Vortex pendant 1 min.
   11. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
   12. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
   13. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 96 % et 0,1 volume d’acétate de Na 3 M pH 5,2.
   14. Incuber pendant au moins 20 min à −80 °C.
   15. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   16. Retirer l’éthanol et laver la pastille avec 400 μL d’éthanol à 70 %.
   17. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   18. Retirez l’éthanol et séchez le culot à l’air.
   19. Ressusciter la pastille dans 10 μL de TE.
   20. Exécutez les échantillons sur un gel d’agarose à 0,8%. La taille de la chromatine sonée devrait être d’environ 500 pb.
       REMARQUE: Utilisez un tampon de chargement sans bleu de bromophénol car la taille de ce colorant est d’environ 500 pb, ce qui peut perturber la détection correcte des fragments de chromatine. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser un tampon de chargement complété par du xylène-cyanole, qui est d’environ 3 000 pb.
   21. Si la taille de la chromatine est acceptable, diluer les échantillons de chromatine congelés de l’étape 2.1. dans 3 volumes de tampon de dilution (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) et mélanger les échantillons par rotation pendant 10 min à 4 °C.
       NOTA : Cette étape est nécessaire pour diluer la FDS présente dans le tampon de lyse nucléaire afin d’éviter toute interférence avec les réactions en aval, y compris la mesure de la concentration de chromatine.
   22. Mesurer la concentration d’ADN des échantillons de chromatine à 260/280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
3. Préparation des perles, pré-nettoyage et immunoprécipitation
   1. Préparez des perles (IgG anti-lapin de mouton ou de souris) pour les étapes de pré-nettoyage et d’immunoprécipitation. Laver les billes deux fois pendant 10 min à 4 °C avec un tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl et 1X PIC).
   2. Ressuscitez les billes dans le même volume de tampon RIPA qu’à l’étape 2.3.1.
   3. Chromatine pré-claire de 25-30 μg de chaque échantillon avec 4 μL de billes par rotation pendant 1-2 h à 4 °C.
      REMARQUE: Ajoutez un tampon RIPA à chaque échantillon de chromatine jusqu’à 500 μL de volume final pour laisser les échantillons se mélanger correctement en rotation. N’oubliez pas de retirer la chromatine pour nac (No Antibody Control) et TIC (Total Input Control) dans le cas de chaque ensemble d’échantillons. Les CATI n’ont besoin que d’un volume final allant jusqu’à 200 μL.
   4. Précipitez les perles avec un aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube à microcentrifugation.
   5. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps à chaque échantillon de chromatine (sauf nac et TIC) et tourner pendant la nuit à 4 °C.
   6. Le lendemain, ajoutez 40 μL de billes lavées à chaque échantillon (sauf tic) et incuber pendant la nuit, en tournant à 4 °C.
4. Lavage
   1. Laver une fois avec 300 μL de tampon à faible teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
   2. Laver une fois avec 300 μL de tampon à haute teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 300 mM, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
   3. Laver une fois avec 300 μL de tampon LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) pendant 10 min par rotation à 4 °C.
   4. Laver deux fois avec 300 μL d’ET (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) pendant 10 min par rotation, pour le premier lavage à 4 °C, et le second lavage à 25 °C.
5. Élution
   1. Ajouter 200 μL du tampon d’élution (1 % de FDS et 100 mM de_NaHCO3)aux billes et incuber à 65 °C dans un thermo-agitateur pendant 15 min avec secousse continue (environ 400 tr/min). Transférer à nouveau le surnageant dans un nouveau tube et éluer des billes dans 200 μL de tampon d’élution. Combiner les éluats (volume final de 400 μL).
   2. Ajouter naCl à une concentration finale de 200 mM dans chaque échantillon. Complétez les échantillons TIC avec 200 μL de tampon d’élution et ajoutez également du NaCl.
      Remarque : à partir de cette étape, TIC doit être manipulé dans les mêmes conditions que les autres échantillons.
   3. Incuber les échantillons à 65 °C (sans secouer) pendant au moins 6 h.
   4. Ajouter 1 mL d’éthanol froid à 100 % à chaque échantillon, faire pivoter les tubes deux fois pour les mélanger et précipiter l’ADN pendant la nuit à −80 °C.
   5. Le lendemain, centrifuger pendant 30 min à 13 000 x g à 4 °C.
   6. Jetez le surnageant et lavez le culot avec 70% d’EtOH.
   7. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   8. Jetez le surnageant et séchez les granulés à l’air.
   9. Ressusciter les pastilles dans 100 μL d’ET et ajouter 0,5 mg/mL de RNase A à chaque échantillon. Incuber à 37 °C pendant 20 min pour activer la RNase.
6. Inversion de la réticulation
   1. Ajouter 500 μg/mL de protéinase K et 0,5 % de FDS, puis incuber les échantillons à 50 °C pendant 2 h.
      REMARQUE: Si vous passez à ChIP-seq, évitez l’extraction phénol-chloroforme, car elle inhibe le processus NGS en aval. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser un kit disponible dans le commerce (voir la table des matériaux).
   2. Ajouter 0,5 volume de phénol et 0,5 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
   3. Vortex pendant 1 min.
   4. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
   5. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
   6. Ajouter 1 volume de mélange d’alcool chloroforme-isoamylique (24:1) à chaque échantillon.
   7. Vortex pendant 1 min.
   8. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min.
   9. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifugation.
7. Extraction de l’ADN
   1. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 96 % et 0,1 volume d’acétate de Na 3 M pH 5,2.
   2. Incuber pendant au moins 20 min à −80 °C.
   3. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   4. Retirer l’éthanol et laver la pastille avec 400 μL d’éthanol à 70 %.
   5. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   6. Retirez l’éthanol et séchez le culot à l’air.
   7. Ressusciter la pastille dans 50 μL de TE.

Résultats

L’étude des processus causés par l’ORD dirigés vers le site dans les cellules peut être réalisée par l’intermédiaire de la transfection stable ou transitoire. Cependant, il convient de noter que la transfection stable assure une population cellulaire homogène, ce qui donne une réponse cellulaire unifiée et donc plus fiable. Dans le cas d’une transfection transitoire, seule une petite proportion de la population cellulaire occupe et maintient le plasmide, ce qui introduit de la diversité dans l’expér...

Discussion

Bien que la réparation de l’ADN soit un domaine de recherche relativement récent, nos connaissances s’étendent rapidement à l’aide de diverses méthodes biochimiques et microscopiques. La préservation de l’information génétique est cruciale pour les cellules puisque les mutations survenant dans les gènes impliqués dans les processus de réparation sont parmi les principales causes de la tumorigenèse et, par conséquent, il est essentiel d’élucider les étapes clés des voies de réparation de l’ADN...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody	Abcam	ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved	Gibco	ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054