エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

要約

この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。

要約

細胞は様々なDNA損傷剤に継続的に曝され、異なる細胞応答を誘導する。生化学的および遺伝的アプローチを適用することは、DNA損傷部位におけるDNA修復複合体の募集および組み立てに関連する細胞事象を明らかにする上で不可欠である。ここ数年、部位特異的なDNA損傷を誘発するための強力なツールが開発されました。さらに、新しい精液技術により、固定細胞と生細胞の両方を用いて、単一細胞分解能レベルでこれらのプロセスを研究することができます。これらの技術は様々な生物学的プロセスの研究に使用されてきたが、本明細書では、エンドヌクレアーゼベースのサイト特異的DNA損傷と組み合わせて、DNA修復の分野で最も広く使用されているプロトコルを提示し、指示された方法でDNA修復因子のゲノム占有率を視覚化し、定量化することを可能にする それぞれ。これらの技術は、損傷したゲノム遺伝子座に結合した新しいタンパク質を同定するための強力なツールと、DNA修復中の微調整調節に必要な翻訳後の改変を同定するための強力なツールを提供する。

概要

私たちのゲノムは、様々なDNA損傷剤によって絶えず挑戦されています。これらの攻撃は、紫外線や照射などの環境源、ならびに酸化ストレスまたは複製エラー^によって引き起こされる代謝副産物などの内因性源から派生することができる^1,2。これらの病変は、一方または両方のDNA鎖の完全性に影響を及ぼし、かつ、発生したエラーが持続する場合、転座やゲノム不安定性を頻繁に引き起こし、腫瘍形成^3、4を生じる可能性がある。ゲノムの完全性を維持するために、進化の間に複数の修復システムが開発されました。特定の種類のDNA損傷の化学的および物理的特性に従って、複数の修復メカニズムを活性化することができる。不一致は、基本的な部位、一本鎖の破断、及び8-オキソグアニン(8-oxoG)は、ミスマッチ修復または塩基切除修復経路^5,6によって除去することができる。UV誘導光産物および嵩高い付加物によって引き起こされる病変は、ヌクレオチド切除修復(NER)またはDNA二本鎖破断修復(DSBR)プロセス^7、8によって修復することができる。NERは、転写結合型NER(TC-NER)およびグローバルゲノムNER(GG-NER)の2つの主要なサブ経路から構成されています。細胞周期相に関しては、DNA二重鎖破断誘導に続いて、2つのサブ経路を活性化することができる:非相同端接合(NHEJ)および相同組換え^(HR)1,9。静止細胞における支配的な経路であるNHEJは、すべての細胞周期段階で活性化することができ、より速いがエラーが起こりやすい経路¹⁰を表す。一方、HRは、エラーのない経路であり、姉妹クロマチドの配列相同性検索に基づいてDSBが修復され、したがって主にSおよびG2細胞周期段階¹¹に存在する。さらに、マイクロホモロジー媒介末結合(MMEJ)は、前述のものとは異なる別のDSB修復機構であり、壊れたDNA末端に隣接する以前に切除された微ホモホノラス配列のKU70/80およびRAD51独立した再結合の方法に基づく。したがって、MMEJはエラーが起こりやすいと考えられ、非常に変異性の高い^12.DNA修復中に、DSBはDNA損傷応答(DDR)を誘導し、修復^13、14、15の間に細胞周期を停止するチェックポイントキナーゼを活性化する。DDRは、病変の周りの修復プロセスのイニシエーターの主要プレーヤーの採用と広範な普及に対する応答として活性化され、修復焦点の形成に寄与する。この初期のシグナル伝達カスケードにおいて、ATM(運動失調毛血管拡張症変異体)キナーゼキナーゼは、病変¹⁶の周囲のSer139(γH2AXと呼ばれる)でヒストン変異体H2AXのリン酸化を触媒することによって極めて重要な役割を果たす。この初期のイベントは、追加の修復要因の募集と下流の修復プロセスの開始を担当します。修復焦点での採用タンパク質の正確な機能はまだ完全に特徴付けられていないが、修復病巣の形成とダイナミクスは、いくつかの研究所によって調査されている。これらのマーカーは、修復キネティクスに従うために広く使用されていますが、修復プロセス中の正確な役割は依然として不可解です。DNA修復関連の細胞プロセスの理解が非常に重要でありながら、DDRを誘導し、可視化するためにこれまでにいくつかの方法が開発されてきました。

所望のDNA損傷を誘発するために、様々な方法やシステムが確立されています。例えば、一部の薬剤(ネオカルジノスタチン(NCS)、フェレオマイシン、 ブレオマイシン、γ照射、UV]は、非予測的なゲノム位置で多数のランダムDNA切断を誘発し、他の(AsiSI、I-PpoIまたはI-SceI、ならびにレーザーストライピングなどのエンドヌクレアーゼ)は、既知のゲノム座^{17、18、19、20、21}でDNA切断を誘発することができる。ここでは、哺乳類および酵母細胞におけるDDRの研究に現在用いられているエンドヌクレアーゼベースの技術に焦点を当てる。これらの技術の原理を強調する以外に、我々は彼らの長所と短所の両方を強調する。

プロトコル

1. 特定タンパク質の免疫検出

1. 細胞培養の調製と実験のセットアップ
   1. 10%の胎児の子牛血清、2 mMグルタミンおよび1%の抗生物質抗抗薬溶液を添加したDMEM培地中の単層のU2OS細胞を維持する。
      注: エンドヌクレアーゼベースのDNA損傷誘導の場合は、システムの漏れを避けるために、炭処理またはステロイドフリーの媒体を使用してください。
   2. 加湿した_5%CO2 環境で、37°Cで80%の合流まで成長させ、2〜3日ごとに培地を再生します。
   3. 培地を吸引し、1x PBSで細胞を洗浄します。トリプシン-EDTA溶液で細胞を取り外します。細胞が剥離すると、細胞に培地を添加してトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を生じる。
   4. 細胞計数チャンバーを使用してセルをカウントします。24ウェルプレートに2 x 10^個の4 セル/mL/wellをプレートし、各ウェルに無菌12mmの丸いカバーリップを付けます。
   5. 加湿した5%CO2雰囲気中の37°Cで24時間細胞をインキュベートし、カバーリップに付着させます。
   6. 細胞を10ng/mLのネオカルジノスタチン(NCS)で、有害物質を培養培地に直接ピペット化して治療する。NCS含有培地で細胞を15分間インキュベートし、1x PBSで洗浄し、新鮮な補充された培養培地を細胞に加えます。それ以外の場合は、適切なエージェント(すなわち、4-OHT)を使用して、培地²²をリフレッシュすることなく、エンドヌクレアーゼベースのシステムを介してDBを誘導する。
      注:あるいは、2-20 Gy²³の間で中性子フラックスを使用して、30分から8時間の回復時間までの範囲のDNA損傷を誘発するために照射を使用します。
   7. 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cで1〜8時間細胞をインキュベートし、DNA修復の動態に従う。
2. 細胞の固定
   注:300-500 μLの溶液/ウェルは、すべての細胞を適切にカバーするために、次の手順(ステップ1.2-1.5)で使用する必要があります。各インキュベーションと洗浄ステップ(抗体インキュベーションを除く)は、穏やかな攪拌を伴う軌道シェーカー上で行われるべきである。
   1. DSB誘導および細胞のインキュベーションに続いて、取り付けられた細胞から培地を取り除き、1倍PBSで細胞を1回洗浄する。
   2. 25°Cで20分間4%ホルムアルデヒド-PBS溶液で細胞を固定します。
3. 細胞の透過性
   1. 固定液を取り出し、1x PBSで細胞を3回洗浄し、それぞれ5分間洗浄します。
   2. PBSを取り出し、PBSに溶解した0.2%トリトンX-100を加えます。サンプルを20分間インキュベートします。
4. 非特異的なバインド サイトのブロック
   1. 1倍PBSで細胞を3回洗います。
   2. PBST(1x PBSは0.1%Tween-20を補充)で希釈した5%BSA(ウシ血清フラクションVアルブミン)を有する非特異的結合部位をブロックし、少なくとも20分間透過サンプルをインキュベートする。
5. 免疫蛍光染色
   1. 1%BSA-PBST溶液に希釈した一次抗体(すなわち、抗γH2AX、抗DNA-PKcs)の適切な量を加える。各カバースリップを、希釈した抗γH2AX抗体の10 μL液滴の上にパラフィンフィルムの上に逆さまに置きます。
      注:同一1%BSA-PBST溶液中の両抗体を適宜希釈して共免疫染色した場合。
   2. 4°Cで1.5時間湿度チャンバーにサンプルをインキュベートします。
      注:インキュベーションは、一晩4°Cで行うこともできます。
   3. カバースリップを24ウェルプレートに横に戻し、1x PBSで5分間3回洗います。
   4. 1%BSA-PBSTで希釈した二次抗体の適切な量を加えます。各カバースリップを、希釈した抗体の10 μL液滴の上にパラフィンフィルムの上に逆さまに置きます。
   5. 4 °Cの湿度チャンバーにサンプルを1時間インキュベートします。
   6. カバースリップを24ウェルプレートに横に戻し、1x PBSで5分間3回洗います。
   7. 最後のPBS洗浄液を取り外す前に、ピンシーザーと針を使用してカバースリップをそっと取り出し、取り付け媒体の液滴(DAPIを補った)でガラススライドに逆さまに置きます。
      注意:気泡の形成を避けてください。取り付け媒体が乾燥するとき、サンプルの縮れを防ぐためにマニキュアでカバーリップの端を密封することを推奨します。

2. クロマチン免疫沈降

1. 細胞の収集、架橋、細胞および核のリシス、およびDNAの断片化
   1. 各サンプルに対して約5 x 10⁶ 細胞/mLを150mm皿に培養する。
   2. 培養液を取り出し、氷冷1x PBSで細胞を2回洗浄する。
   3. 1%ホルムアルデヒド-PBS溶液で細胞を固定し、プレートを軌道シェーカーの上に置き、20分間静かに攪拌します。
      注意:ホルムアルデヒドは揮発性です。常に新しい作業ソリューションを準備します。ホルムアルデヒド溶液にはメタノールが含まれて安定する場合もありますが、下流反応との干渉を避けるためにメタノールフリー溶液を使用することをお客様が適しています。
   4. 125 mMグリシンで固定を停止し、25°Cで5分間穏やかな攪拌で軌道シェーカーにインキュベートします。
   5. プレートを氷の上に置き、氷冷1x PBSで2回洗います。
   6. 氷冷1x PBSで細胞をこすり、15 mL円錐形のチューブに移します。
   7. 4°Cで5分間2,500xgで細胞を遠心分離する。
   8. 上清を慎重に吸引し、ペレットを2mLの細胞ライシスバッファーに再懸濁し[5 mM PIPES pH 8.0,85 mM KCl,0.5%NP-40,1x PIC(プロテアーゼ阻害剤カクテル)]を氷上で10分間インキュベートします。
   9. 4°Cで5分間2,500xgで細胞懸濁液を遠心分離する。
   10. 慎重に上清を捨て、核リシスバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0、0.8%SDS、1x PIC)でペレットを500-1,500 μLに再懸濁し、氷上で30〜60分間インキュベートします。超音波処理に適したポリスチレンの円錐管にリゼートを移します。
       注:核溶解バッファーにはSDSが含まれているため、氷上で沈殿し、溶液が白くなります。ソリューションは、超音波処理に続いて透明に変える必要があります。
   11. 平均フラグメントサイズ300-1,000bpにDNAを剪断するために、ライセートを超音波処理する。
       注:適切な超音波サイクルと条件は、セルの種類と超音波処理装置に応じて設定する必要があります。200bpより小さい断片は、ヌクレオソームとDNA相互作用が破壊され得るので、ChIPには適さない。
2. 架橋の反転、超音波処理されたフラグメントサイズの決定
   1. 超音波処理されたサンプルの100 μLを取り出して、超音波クロマチンのフラグメントサイズを確認します。残りのクロマチンは−80°Cで保存する必要があります。
   2. サンプルの各100 μLに0.5 mg/mL RNase Aを加え、37°Cで20分間インキュベートしてRNaseを活性化します。
   3. サンプルを一晩65°Cでインキュベートします。
   4. 翌日、500 μg/mL のプロテアーゼ K と 0.5% SDS を加え、50 °C で 3 時間インキュベートします。
   5. 各サンプルに0.5容量のフェノールと0.5ボリュームクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を加えます。
   6. ボルテックス 1分間
   7. 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
   8. 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
   9. 各サンプルにクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を1巻加えます。
   10. ボルテックス 1分間
   11. 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
   12. 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
   13. 2.5容量の96%エタノールと0.1容量の3 M Na-Acetate pH 5.2を加えます。
   14. −80 °Cで20分以上インキュベートしてください。
   15. サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
   16. エタノールを取り除き、ペレットを400μLの70%エタノールで洗います。
   17. サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
   18. エタノールを取り出し、ペレットを乾燥させます。
   19. TEの10 μLでペレットを再懸濁します。
   20. 0.8%アガロースゲルでサンプルを実行します。超音波クロマチンのサイズは、約500 bpでなければなりません。
       注:この色素のサイズはクロマチンフラグメントの適切な検出を妨げることができる約500 bpであるため、ブロモフェノールブルーフリーローディングバッファを使用してください。代わりに、約3,000 bpであるキシレン-シアノールと相補するローディングバッファを使用することをお勧めします。
   21. クロマチンサイズが許容可能な場合は、ステップ2.1から冷凍クロマチンサンプルを希釈します。希釈バッファー(10 mMトリス-HCl pH 8.0、0.5 mM EGTA pH 8.0、1%トリトンX-100、140 mM NaCl、1x PIC)の3巻で、4°Cで10分間回転してサンプルを混合します。
       注:このステップは、クロマチン濃度の測定を含む下流反応との干渉を避けるために、核溶解バッファー内に存在するSDSを希釈するために必要です。
   22. 分光光度計を用いて260/280nmのクロマチン試料のDNA濃度を測定します。
3. ビーズの調製、事前清算、免疫沈降
   1. ビーズ(羊の抗ウサギまたはマウスIgG)を事前クリアおよび免疫沈降ステップ用に準備します。リパバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%Na-DOC、0.1%SDS、150 mM NaCl、1X PIC)でビーズを4°Cで10分間2回洗浄します。
   2. ステップ 2.3.1 と同じボリュームの RIPA バッファ内のビーズを再中断します。
   3. 各サンプルの25~30μgクロマチンを4μLの前に、4°Cで1〜2時間回転させる。
      注:各クロマチンサンプルに、最大500 μLの最終ボリュームにRIPAバッファを追加し、回転の下でサンプルを適切に混合します。NAC(抗体コントロールなし)とTIC(トータルインプットコントロール)のクロマチンを各サンプルセットの場合に取り出すことを忘れないでください。TICは最大200μLの最終ボリュームしか必要としません。
   4. ビーズを磁石で沈殿させ、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
   5. 適切な量の抗体を各クロマチン試料(NACおよびTICを除く)に加え、4°Cで一晩回転させます。
   6. 翌日、洗浄ビーズ40μLを各サンプル(TICを除く)に加え、4°Cで回転して一晩インキュベートします。
4. 洗浄
   1. 低塩バッファーの300 μL(20 mMトリス-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%SDS、1x PIC)で10分間、4°Cで回転して10分間洗浄します。
   2. 高塩バッファーの300 μL(20 mMトリス-HCl pH 8.0、300 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%SDS、1x PIC)で10分間、4°Cで回転して10分間洗浄します。
   3. LiClバッファーの300 μL(250 mM LiCl、1%NP-40、1%Na-DOC、1 mM EDTA pH 8.0、10 mM Tris-HCl pH 8.0、1x PIC)で1回、4°Cで10分間回転します。
   4. 300 μL の TE(10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0)を回転で 10 分間、4 °C で最初の洗浄、2 回目の洗浄を 2 回 2 回行います。
5. 溶出
   1. 溶出バッファー (1% SDS および 100 mM NaHCO₃₎の 200 μL をビーズに加え、サーモシェーカーで 65 °C で連続振動(約 400 RPM)で 15 分間インキュベートします。上清を新しいチューブに移し、溶出バッファーの200 μLで再びビーズを溶出します。溶出液(400 μL最終容積)を組み合わせます。
   2. NaClを各サンプルに200 mMの最終濃度に加えます。200 μL の溶出バッファーで TIC サンプルを補い、NaCl を加えます。
      注: このステップから、TIC は他のサンプルと同じ条件で処理する必要があります。
   3. サンプルを65°C(振盪せずに)で6時間以上インキュベートする。
   4. 各サンプルに1mLの冷たい100%エタノールを加え、チューブを2回回転させて混合し、−80°CでDNAを一晩沈殿させます。
   5. 翌日、遠心分離機は4°Cで13,000×gで30分間。
   6. 上清を捨て、ペレットを70%EtOHで洗います。
   7. サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
   8. 上清を捨て、ペレットを乾燥させます。
   9. TEの100 μLでペレットを再懸濁し、各サンプルにRNase Aの0.5 mg/mLを加えます。37°Cで20分間インキュベートし、RNaseを活性化します。
6. 架橋の反転
   1. 500 μg/mL のプロテアーゼ K と 0.5% SDS を加え、50 °C でサンプルを 2 時間インキュベートします。
      注意:ChIP-seqに進む場合は、下流NGSプロセスを阻害するため、フェノール-クロロホルム抽出は避けてください。代わりに、市販のキットを使用することをお勧めします( 資料一覧を参照)。
   2. 各サンプルに0.5容量のフェノールと0.5ボリュームのクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を加えます。
   3. ボルテックス 1分間
   4. 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
   5. 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
   6. 各サンプルにクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を1巻加えます。
   7. ボルテックス 1分間
   8. 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
   9. 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
7. DNA抽出
   1. 2.5容量の96%エタノールと0.1容量の3 M Na-Acetate pH 5.2を加えます。
   2. −80 °Cで20分以上インキュベートしてください。
   3. サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
   4. エタノールを取り除き、ペレットを400μLの70%エタノールで洗います。
   5. サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
   6. エタノールを取り出し、ペレットを乾燥させます。
   7. TEの50 μLにペレットを再懸濁します。

結果

細胞内の部位に誘導されたDSBによる修復プロセスの研究は、安定または一時的なトランスフェクションを介して達成することができる。しかし、安定したトランスフェクションは均質な細胞集団を保証し、統一され、より信頼性の高い細胞応答を与える。一過性トランスフェクションの場合、細胞集団のごく一部のみがプラスミドを占め、実験に多様性を導入します。ER-I-PpoIまたはER-AsiSIエ?...

ディスカッション

DNA修復は比較的最近の研究分野ですが、様々な生化学的・顕微鏡的手法を用いて、私たちの知見は急速に広がっています。遺伝子の修復過程に関与する遺伝子に起こる変異は、腫瘍形成の主要な原因の一つであり、したがってDNA修復経路の重要なステップを解明することが不可欠であるため、遺伝情報の保存は細胞にとって極めて重要である。

生化学的手法(すなわち、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody	Abcam	ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved	Gibco	ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054