Porcine القرنية النسيج Explant لدراسة فعالية الهربس البسيط فيروس -1 مضادات الفيروسات

Summary

نحن نصف استخدام قرنية البورسين لاختبار فعالية الأدوية التجريبية المضادة للفيروسات.

Abstract

يمكن أن تسبب الفيروسات والبكتيريا مجموعة متنوعة من عيوب سطح العين والانحطاط مثل الجروح والقرحة من خلال عدوى القرنية. مع وجود التآكل المصلي الذي يتراوح بين 60-90٪ في جميع أنحاء العالم، وفيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) يسبب عادة الآفات المخاطية في المنطقة الأورو-الوجهية التي تظهر أيضا كآفات والعمى المرتبطة بالعدوى. في حين أن الأدوية المضادة للفيروسات الحالية فعالة ، فإن ظهور مقاومة واستمرار الآثار الجانبية السامة يتطلب تطوير مضادات للفيروسات جديدة ضد هذا الممرض في كل مكان. على الرغم من أن التقييم في المختبر يوفر بعض البيانات الوظيفية المتعلقة بمضادات الفيروسات الناشئة ، إلا أنها لا تثبت تعقيد الأنسجة العينية في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراسات الجسم الحي مكلفة وتتطلب موظفين مدربين ، خاصة عند العمل مع العوامل الفيروسية. وبالتالي نماذج الجسم الحي السابق هي خطوات فعالة ولكنها غير مكلفة للاختبار المضاد للفيروسات. هنا نناقش بروتوكول لدراسة العدوى عن طريق HSV-1 باستخدام القرنيات البرسينية ex vivo وطريقة لعلاجها موضعيا باستخدام الأدوية المضادة للفيروسات الموجودة والجديدة. كما أننا نثبت طريقة إجراء فحص البلاك باستخدام HSV-1. ويمكن استخدام الأساليب المفصلة لإجراء تجارب مماثلة لدراسة العدوى التي تشبه مسببات الأمراض HSV-1.

Introduction

الناس الذين يعانون من التهابات العين غالبا ما تتكبد فقدان البصر¹. مع ارتفاع مستوى الانتشار المصلي في جميع أنحاء العالم، HSV المصابين الأفراد يعانون من التهابات العين المتكررة التي تؤدي إلى تندب القرنية، التهاب القرنية سترومال والأوعية الدموية الجديدة^2،3،4،5. وقد أظهرت العدوى HSV أيضا أن يسبب أقل تواترا, مجموعة من الحالات الخطيرة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة, غير المعالجة مثل التهاب الدماغ والمراضة الجهازية^6,7,8. وقد أظهرت أدوية مثل Acyclovir (ACV) ونظائرها النيوكليوسيد نجاحا ثابتا في الحد من عدوى HSV-1 وحتى إعادة تنشيط السيطرة بعد الاستخدام المطول لهذه الأدوية يرتبط بالفشل الكلوي وتشوهات الجنين وعدم تقييد ظهور مقاومة الأدوية للسلالات الفيروسية المتطورة^9و10و11و¹²و¹³. التعقيدات المرتبطة بالتهابات العين HSV-1، وقد درست سابقا في المختبر باستخدام monolayers والثقافات 3D من خلايا القرنية البشرية وفي الجسم الحي باستخدام عدوى عين مورين أو أرنب. في حين أن هذه النماذج في المختبر توفر بيانات هامة عن المكونات البيولوجية الخلوية للعدوى HSV-1، إلا أنها تفشل في محاكاة التعقيد المعقد للأنسجة القرنية ولا تفعل الكثير لإلقاء الضوء على الانتشار التشجري للفيروس¹⁴. في المقابل ، على الرغم من أن في أجهزة الجسم الحي هي أكثر الثاقبة في إظهار انتشار العدوى في القرنيات واستجابات التنشيط المناعي خلال عدوى HSV -1 ، فإنها تأتي مع التحذير من أنها تتطلب محققين مدربين ومرافق كبيرة لرعاية الحيوان للتغاضي عن التجارب.

هنا نستخدم القرنيات البورسينية كنموذج الجسم الحي السابق لفحص نظام الجرح الناجم عن العدوى HSV-1. يمكن دراسة كل من الصيدلة المحتملة لبعض الأدوية وكذلك الخلية والبيولوجيا الجزيئية لنظام الجروح الناجم عن العدوى من خلال ثقافات الأنسجة. ويمكن أيضا تعديل هذا النموذج لاستخدامها لالتهابات أخرى الفيروسية والبكتيرية كذلك. في هذه الدراسة، استخدمت القرنيات البورسينية لاختبار فعالية مضادة للفيروسات من جزيء صغير قبل السريرية، BX795. ويفضل استخدام القرنيات البورسينية بسبب سهولة الوصول وفعالية التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، نماذج القرنية porcine هي نماذج جيدة من عيون الإنسان مع القرنيات يجري من السهل عزل، الحجم الكافي للعدوى والتصور وقوية للتعامل مع¹⁵. القرنيات البورسينية هي أيضا مماثلة لتعقيد نماذج القرنية البشرية في كل من نفاذية القرنية عبر وامتصاص الجهازية¹⁵. باستخدام هذا النموذج للدراسة، تمكنا من توضيح كيف BX795 يستحق المزيد من التحقيق كمثبط المختصة من عدوى فيروس HSV-1 ويضيف إلى الأدب لتصنيفه كمركب مضاد للفيروسات جزيء صغير محتمل¹⁶.

Protocol

تم توفير جميع أنسجة البورسين المستخدمة في هذه الدراسة من قبل منظمة خاصة تابعة لطرف ثالث ولم يتم تنفيذ أي من التعامل مع الحيوانات من قبل موظفي جامعة إلينوي في شيكاغو.

1. المواد

1. الكواشف
   1. استخدام الكواشف التالية لالقياس البلاك: مسحوق ميثيلسليلوز، دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM)، مصل الأبقار الجنينية (FBS)، البنسلين والستريبتوميسين (P /S) لايقازيح البلاك.
   2. استخدام أقراص الكريستال البنفسجي والإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) لإعداد الكريستال البنفسجي حل لالتقايس البلاك.
2. Vero وسائل الإعلام نمو الخلية -- DMEM وسائل الإعلام كلها
   1. افتح زجاجة وسائط DMEM داخل غطاء محرك الأنسجة. إزالة 55 مل من وسائل الإعلام من زجاجة باستخدام ماصة المصلية والتخلص منه. إضافة 50 مل من FBS من P / S إلى DMEM. يبرد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. وسائط فحص البلاك - مخزون من وسائط ميثيلسليلوز بنسبة 5٪
   1. قياس 2.5 غرام من مسحوق ميثيلسليلوز مع مغناطيس اثارة داخل زجاجة 500 مل وautclave ذلك. بعد زجاجة يبرد لدرجة حرارة الغرفة، واتخاذ 500 مل من وسائط كاملة DMEM تحتوي على 50 مل من FBS و 5 مل من P / S وإضافته إلى زجاجة تحتوي على ميثيلسليلوز.
   2. حرك هذا عند 4 درجة مئوية لمدة يومين باستخدام ستيرر مغناطيسي. يبرد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. إعداد وسائل الإعلام للقرنية البورسينية المقتطعة
   1. افتح زجاجة الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. تجاهل 10 مل من MEM من الزجاجة باستخدام ماصة مصلية.
   2. إضافة 5 مل من الأنسولين نقل السيلينيوم (ITS) و 5 مل من المضادة لليميكوتيك المضادات الحيوية (AA) إلى وسائل الإعلام والتبريد في 4°C.
5. ماجستير والمخزون العامل من الكريستال البنفسجي:
   1. لجعل الكريستال البنفسجي الأسهم الحل، إضافة 1 غرام من مسحوق الكريستال البنفسجي إلى 100 مل من الإيثانول 20٪ في الماء. هذا المخزون (1٪ ث / الخامس الكريستال البنفسجي) يمكن تخزينها واستخدامها لمدة تصل إلى سنة عند تخزينها في مكان مظلم.
   2. لجعل مخزون العمل من هذا، إضافة 50 مل من الأسهم الأصلي الحل إلى 350 مل من الماء. إضافة 100mL من الإيثانول لهذا الحل لجعل 500 مل حل الكريستال البنفسجي العمل (0.1٪ ث / الخامس الكريستال البنفسجي).
      ملاحظة: كل هذه الحلول تحتاج إلى تخزين في الظلام.

2. الإجراء

1. عزل القرنيات Porcine من عيون كاملة¹⁷
   1. عند تلقي عيون porcine من بائع مناسب ، قم بتخزينه على الجليد إذا كان هناك تأخير في معالجة الأنسجة كما هو مصور في الشكل 1.
   2. تأكد من استخدام معدات الحماية الشخصية وارتداؤها أثناء هذا الإجراء لتجنب التلوث وكذلك الحوادث الناجمة عن انسكاب الفكاهة الزجاجية.
   3. رش منطقة العمل مع الإيثانول 70٪ لتنظيف وتطهير. لضمان مساحة العمل مستقرة، ونشر غطاء مقاعد البدلاء والشريط أسفل الجانبين بشكل آمن كما هو في الصورة في الشكل 2.
   4. ضع عيون الخنزير على الشاش (الشكل 3). باستخدام شاش 50 ملم، عقد المقطع الخلفي (الشكل 4A) من عيون porcine كما هو مبين في الشكل 4B بيد واحدة.
   5. مع إبرة 30 G، وجعل بلطف كزة واحدة في ما يقرب من مركز سطح الظهارية للعين بعناية وضمان عدم وجود ضرر لستروما (الشكل 5). يجب أن تقتصر الوخزة على الظهارة (~ 100-200 ميكرومتر) لتجنب المشاركة السترومية.
   6. باستخدام شفرة معقمة حادة، وجعل شق صغير على تصلب على مسافة 1 ملم من القرنية. قطع حافة القرنية ضمان أن الفكاهة الزجاجية لا تسرب باستخدام عمل سريع وسلس الدورية من جهة (الشكل 6A). عن طريق عقد القرنية على حافة القرنية الصلبة مع ملاقط مسطحة، وقطع الأغشية الربط المتبقية من العين باستخدام شفرة(الشكل 6B).
   7. تأخذ القرنية ووضعها في لوحة 12 جيدا مضافا مع 2 مل من القرنية المتوسطة. وينبغي وضع القرنية التي تواجه، أظهرت في سلسلة من الخطوات في الأرقام 7A-D، الشكل 8).
   8. إضافة 5 ميكرولتر من محلول الفيروس الذي يحتوي على 5 × 10⁵ وحدات تشكيل البلاك (PFU) من 17 GFP إلى الموقع الحطام على سطح القرنية. ضع اللوحة ذات ال 12 بئرا التي تحتوي على قرنيات بورسينية مصابة في حاضنة تحتوي_على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
   9. رش أي عيون إضافية لا تستخدم في التجربة مع 10٪ التبييض والتخلص منها بشكل آمن في أكياس المخاطر البيولوجية.
2. التصور
   ملاحظة: يجب تصور الفيروس كل يوم قبل إضافة الأدوية.
   1. قم بتشغيل مجهر الاستريو ومصدر ضوء LED واترك مصباح الجهاز يسخن قبل تصوير القرنيات. حمل بعناية لوحة القرنيات إلى الصك دون الإخلال الحل. تغيير مرشح بحيث GFP (380-460 نانومتر) يستخدم للنظر في العينات. تعيين وقت التعرض إلى 500 مللي ثانية لالتقاط الصور.
   2. أولا، ضع لوحة القرنية تحت المجسم والتقاط الصور بأقل تكبير 7.5x. اتبع هذا الأمر مع سلسلة من الصور التكبير المتزايد (على سبيل المثال، 15x، 25x، 35x) بحيث يتم تصور جميع انتشار الفيروسية وتشكيل dendrite بوضوح
   3. تأكد من إعادة القرنيات المصابة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة وحفظ جميع الصور التي تم التقاطها.
3. القياس الكمي للعدوى بالفيروس
   ملاحظة: يجب تقييم عوارض الفيروسات من القرنيات البورسينية كل يوم لتحليل تأثير العلاج الدوائي.
   1. لقياس الفيروس، خلايا فيرو البذور في كثافة 5 × 10⁵ من الخلايا لكل بئر إذا باستخدام لوحة 6-جيدا كما فعلت في هذه التجربة. القيام بذلك قبل يوم واحد من العدوى. احتضان الخلايا المطلية بين عشية وضحاها لضمان أنها التقاء لتحديد كمية الفيروس.
   2. Aliquot 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل في أنابيب الطرد الدقيق متعددة. إدراج القطن المعقم مسحة يميل مغموسة في أنابيب الوسائط الحرة المصل شغلها. مسحات القطن تحتاج إلى أن تكون مغموسة ورطبة لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الاستخدام.
   3. دون إزعاج وسائل الإعلام الأساسية، نقل لوحة القرنية porcine المصابة إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام مسحات القطن الرطب، وجعل 3 الثورات في اتجاه عقارب الساعة و 3 الثورات عكس اتجاه عقارب الساعة في قطر 5 ملم من وسط القرنية porcine المصابة دون تطبيق الضغط المفرط.
   4. إدراج مرة أخرى مسحة القطن في وسائل الإعلام الحرة مصل شغل أنبوب الطرد الدقيق وتدويرها في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة 5 مرات. يجب قطع الطرف المعدني لمسحة القطن بحيث يتناسب تماما مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ويمكن إغلاق الغطاء.
   5. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على طرف القطن المسحات على آلة دوامة ودوامة بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة.
   6. إجراء القياس الكمي للفيروس عن طريق فحص البلاك على هذه العينات.
      ملاحظة: يجب إجراء خطوة القياس الكمي هذه في الأيام 2 و4 واختياريا في 6 أيام بعد العدوى.
4. تحديد كمية الفيروسات بواسطة مقايسة البلاك
   ملاحظة: لإجراء فحص البلاك، تنمو ولوحة خلايا Vero في لوحة 6 جيدا وضمان التقاء 90٪ من الخلايا قبل بدء الفحص. استخدام قارورة^{التقاء 75} سم 2 من هذه الخلايا. جميع الخطوات أدناه تحتاج إلى القيام بها داخل خزانة السلامة البيولوجية.
   1. غسل أحادي الطبقة التقاء خلايا Vero في القارورة مع 10 مل من الفوسفات الطازج العازلة المالحة (PBS) بعد أسبيراتينغ الوسط الثقافة. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني بعد أسبيراتينغ المجموعة الأولى من محلول الغسيل.
   2. إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين إلى أحادي الخلية. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بالعين المجردة، تأكد من فصل الخلايا عن السطح الداخلي للقارورة. إذا لم يكن كذلك، انتظر لمدة 5 دقائق أخرى قبل فحص القارورة مرة أخرى. عندما تظهر الخلايا منفصلة، أضف 9 مل من الوسائط الكاملة إلى الطبقة الأحادية لضمان إزاحة الخلايا تماما من سطح القارورة.
   3. جمع جميع الخلايا من قارورة جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام بأكملها ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
   4. لكل بئر من 6 لوحات الآبار التي تستخدم في فحص البلاك، استخدم 300 ميكرولتر من أنبوب الطرد المركزي. أعلى كل بئر من لوحة بئر 6 مع 2 مل من وسائل الإعلام بأكملها. اترك اللوحات في الحاضنة بين عشية وضحاها للسماح لها بالنمو وتشكيل طبقة أحادية التقاء في كل بئر.
   5. من أجل إجراء فحص البلاك ، يجب إجراء تخفيف متسلسل للعينات قبل تحديد كمية الفيروس.
   6. إجراء سجل₁₀1 أضعاف تخفيف الفيروس في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة باستخدام وسائل الإعلام الحرة المصل حتى يتم التوصل إلى تخفيف من^10-8. عندما في تخفيف^10-3، نقل 1 مل من التخفيف إلى طبقة واحدة من الخلايا المطلية بعد التجسس وسائل الإعلام النمو على الخلايا من لوحة بئر 6، وهذا سيكون خطوة العدوى. احتضان اللوحة المصابة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   7. يستنشق وسائل الإعلام العدوى القائمة، وغسل مع برنامج تلفزيوني مرتين بلطف لمعطف الخلايا وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام المحملة ميثيلسليلوز لكل بئر لجميع الآبار 6. حضانة لمدة 72 ساعة أو حتى يمكن رؤية تشكيل لويحات. يمكن تحديد لويحات من خلال تشكيل فجوات صغيرة بين الخلايا في أحادية الخلية.
   8. أضف 1 مل من الميثانول ببطء إلى زاوية كل بئر، باستخدام الجدار كطرف توجيهي. احتضان لوحة 6 بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يستنشق ببطء محتويات كل بئر من لوحة دون إزعاج أو التحريض على أحادية الخلية.
   9. إضافة 1 مل من الكريستال البنفسجي حل العمل إلى كل بئر من 6 لوحة بئر، وضمان تغطية جميع الخلايا. احتضان لوحة بئر 6 في الظلام لمدة 30 دقيقة. تجاهل الحل البنفسجي الكريستال عن طريق قرصنة وتجفيف الآبار على ورقة ماصة.
   10. عد عدد لويحات في أعلى تخفيف جيدا لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في حل البداية. كرر العملية مرتين لتأكيد التيتر الفيروسي.

النتائج

لفهم فعالية مضادات الفيروسات التجريبية ، يجب اختبارها على نطاق واسع قبل إرسالها للتجارب السريرية البشرية الحية. وفي هذا الصدد، يتعين تحديد مجموعات المراقبة الإيجابية والسيطرة السلبية والاختبار. وقد استخدمت منذ فترة طويلة Trifluorothymidine (TFT) كعلاج المفضل لعلاج التهاب القرنية الهربس موضعيا

Discussion

وقد أظهرت الأبحاث السابقة BX795 أن يكون لها دور واعد كعامل مضاد للفيروسات ضد عدوى HSV-1; عن طريق تثبيط كيناز تانك ملزمة 1 (TBK1)¹⁶. وقد لعبت كل من TBK1 وautphagy دورا في المساعدة على منع العدوى HSV-1 كما هو موضح على الخلايا الظهارية القرنية البشرية. وقد تبين BX795 لتكون فعالة إلى أقصى حد مع النشاط ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	-	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Special order by request
Procedure bench covers - as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586