Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

Resumen

Describimos el uso de una córnea porcina para probar la eficacia antiviral de los fármacos experimentales.

Resumen

Los virus y las bacterias pueden causar una variedad de defectos de la superficie ocular y degeneración, como heridas y úlceras a través de la infección corneal. Con una seroprevalencia que oscila entre el 60-90% en todo el mundo, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) comúnmente causa lesiones mucocutáneas de la región orofacial que también se manifiestan como lesiones y ceguera asociada a la infección. Si bien los medicamentos antivirales actuales son efectivos, la aparición de resistencia y la persistencia de efectos secundarios tóxicos requiere el desarrollo de nuevos antivirales contra este patógeno ubicuo. Aunque la evaluación in vitro proporciona algunos datos funcionales con respecto a un antiviral emergente, no demuestran la complejidad del tejido ocular in vivo. Sin embargo, los estudios in vivo son costosos y requieren personal capacitado, especialmente cuando se trabaja con agentes virales. Por lo tanto, los modelos ex vivo son pasos eficientes pero económicos para las pruebas antivirales. Aquí discutimos un protocolo para estudiar la infección por HSV-1 utilizando córneas porcinas ex vivo y un método para tratarlas tópicamente utilizando medicamentos antivirales existentes y nuevos. También demostramos el método para realizar un ensayo de placa utilizando HSV-1. Los métodos detallados se pueden utilizar para realizar experimentos similares para estudiar infecciones que se asemejan al patógeno HSV-1.

Introducción

Las personas que sufren de infecciones oculares a menudo incurren en pérdida de la visión¹. Con una alta seroprevalencia en todo el mundo, los individuos infectados por el VHS sufren infecciones oculares recurrentes que conducen a cicatrices corneales, queratitis estromal y neovascularización^2,3,4,5. Las infecciones por VHS también han demostrado causar con menos frecuencia, una variedad de afecciones graves entre pacientes inmunocomprometidos y no tratados, como encefalitis y morbilidad sistémica^6,7,8. Medicamentos como el aciclovir (ACV) y sus análogos de nucleósidos han demostrado un éxito constante en la reducción de la infección por HSV-1 e incluso la reactivación de control, sin embargo, el uso prolongado de estos medicamentos se asocia con insuficiencia renal, anomalías fetales y la incapacidad de restringir la aparición de resistencia a los medicamentos a las cepas virales en evolución^{9,10,11,12,13}. Las complejidades asociadas a las infecciones oculares por HSV-1, han sido previamente estudiadas in vitro utilizando monocapas y cultivos 3D de células corneales humanas e in vivo utilizando infecciones oculares murinas o de conejo. Si bien estos modelos in vitro proporcionan datos significativos sobre los componentes biológicos celulares de las infecciones por HSV-1, sin embargo, no logran imitar la intrincada complejidad del tejido corneal y hacen poco para iluminar la propagación dendrítica del virus¹⁴. En contraste, aunque los sistemas in vivo son más perspicaces al mostrar la propagación de la infección en las córneas y las respuestas de activación inmune durante la infección por HSV-1, vienen con la advertencia de que requieren investigadores capacitados y grandes instalaciones para el cuidado de animales para pasar por alto los experimentos.

Aquí utilizamos córneas porcinas como modelo ex vivo para examinar el sistema de heridas inducidas por infección por HSV-1. Tanto la farmacología potencial de ciertos fármacos como la biología celular y molecular del sistema de heridas causado por la infección se pueden estudiar a través de cultivos de explantes de tejidos. Este modelo también puede ser modificado para el uso de otras infecciones virales y bacterianas también. En este estudio, se utilizaron córneas porcinas para probar la eficacia antiviral de una molécula pequeña preclínica, BX795. Se prefirió el uso de córneas porcinas debido a la facilidad de acceso y la rentabilidad. Además, los modelos de córnea porcina son buenos modelos de ojos humanos con las córneas siendo fáciles de aislar, de tamaño adecuado para la infección y visualización y robustas para manejar¹⁵. Las córneas porcinas también son comparables a la complejidad de los modelos corneales humanos tanto en permeabilidad trans corneal como en absorción sistémica¹⁵. Al usar este modelo para el estudio, pudimos dilucidar cómo BX795 es digno de una mayor investigación como un inhibidor competente de la infección por el virus HSV-1 y se suma a la literatura de clasificarlo como un posible compuesto antiviral de molécula pequeña¹⁶.

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Protocolo

Todo el tejido porcino utilizado en este estudio fue proporcionado por una organización privada de terceros y ninguno de los manejos de animales fue realizado por personal de la Universidad de Illinois en Chicago.

1. Materiales

1. Reactivos
   1. Use los siguientes reactivos para el ensayo de placa: metilcelulosa en polvo, medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina (P / S) para el ensayo de placa.
   2. Use tabletas de violeta cristalina y etanol (grado de biología molecular) para preparar la solución de violeta cristalina para el ensayo de placa.
2. Medios de crecimiento de células Vero - DMEM whole media
   1. Abra el frasco de medios DMEM dentro de la campana de cultivo de tejidos. Retire 55 ml de medios de la botella con una pipeta serológica y deséchelo. Agregue 50 ml de FBS de P / S a DMEM. Refrigerar a 4 °C.
3. Medios de ensayo de placa - Stock de medios de metilcelulosa al 5%
   1. Mida 2,5 g de polvo de metilcelulosa con un imán de agitación dentro de una botella de vidrio de 500 ml y autoclave. Después de que la botella se enfríe a temperatura ambiente, tome 500 ml de medios enteros DMEM que contengan 50 ml de FBS y 5 ml de P / S y agréguelo a la botella de vidrio que contiene metilcelulosa.
   2. Revuelva esto a 4 ° C durante 2 días con un agitador magnético. Refrigerar a 4 °C.
4. Preparación de medios para la córnea porcina extirpada
   1. Abra un frasco de medios esenciales mínimos (MEM) dentro de la campana de cultivo de tejidos. Deseche 10 ml de MEM de la botella con una pipeta serológica.
   2. Añadir 5 ml de insulina-transferrina-selenio (ITS) y 5 ml de antimicótico-antibiótico (AA) al medio y refrigerar a 4°C.
5. Maestro y stock de trabajo de cristal violeta:
   1. Para hacer la solución de stock de violeta cristalina, agregue 1 g de polvo de violeta de cristal a 100 ml de etanol al 20% en agua. Este stock (1% p/v de cristal violeta) se puede almacenar y utilizar hasta un año cuando se almacena en un lugar oscuro.
   2. Para hacer un stock de trabajo a partir de esto, agregue 50 ml de solución de stock original a 350 ml de agua. Agregue 100 ml de etanol a esta solución para hacer una solución violeta de cristal de trabajo de 500 ml (0.1% p / v de cristal violeta).
      NOTA: Ambas soluciones deben almacenarse en la oscuridad.

2. Procedimiento

1. Aislamiento de córneas porcinas de ojos enteros¹⁷
   1. Al recibir los ojos porcinos de un vendedor adecuado, almacene en hielo si hay un retraso con el procesamiento de tejidos como se muestra en la Figura 1.
   2. Asegúrese de que el equipo de protección personal se use y use durante este procedimiento para evitar la contaminación, así como los accidentes por derrame de humor vítreo.
   3. Rocíe el área de trabajo con etanol al 70% para limpiar y desinfectar. Para asegurarse de que el espacio de trabajo sea estable, extienda una cubierta de banco y pegue con cinta adhesiva los lados de forma segura como se muestra en la Figura 2.
   4. Coloque los ojos porcinos en la gasa (Figura 3). Usando una gasa de 50 mm, sostenga la sección posterior(Figura 4A)de los ojos porcinos como se muestra en la Figura 4B con una mano.
   5. Con una aguja de 30 G, haga suavemente un solo golpe en aproximadamente el centro de la superficie epitelial del ojo con cuidado y asegúrese de que no haya daños en el estroma(Figura 5). El poke debe limitarse al epitelio (~100-200 μm) para evitar la afectación del estroma.
   6. Usando una cuchilla esterilizada afilada, haga una pequeña incisión en la esclerótica a 1 mm de distancia de la córnea. Cortar el borde de la córnea asegurando que el humor vítreo no se filtre utilizando una acción giratoria rápida y suave de la mano (Figura 6A). Al sostener la córnea en el borde de la córnea-esclerótica con una pinza plana, corte las membranas de anclaje restantes del ojo con la cuchilla (Figura 6B).
   7. Tome la córnea y colóquela en una placa de 12 pozos superpuesta con 2 ml de córnea media. La córnea debe colocarse hacia arriba, demostrada en una serie de pasos en las Figuras 7A-D, Figura 8).
   8. Añadir 5 μL de la solución del virus que contiene 5 x 10⁵ unidades formadoras de placa (PFU) de 17 GFP al sitio desbridado en la superficie corneal. Coloque la placa de 12 pozos que contiene córneas porcinas infectadas en una incubadora con 5% de CO₂ durante 72 h.
   9. Rocíe cualquier ojo adicional que no se haya utilizado en el experimento con lejía al 10% y se elimine de forma segura en bolsas de riesgo biológico.
2. Visualización
   NOTA: El virus debe visualizarse todos los días antes de la adición de medicamentos.
   1. Encienda el microscopio estéreo y la fuente de luz LED y permita que la lámpara de la máquina se caliente antes de obtener imágenes de las córneas. Lleve cuidadosamente la placa de córneas al instrumento sin perturbar la solución. Cambie el filtro para que se use GFP (380-460 nm) para observar las muestras. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms para capturar imágenes.
   2. Primero, coloque la placa de la córnea debajo del estereoscopio y capture las imágenes con el aumento más bajo de 7.5x. Siga esto con una serie de imágenes de aumento creciente (por ejemplo, 15x, 25x, 35x) de modo que toda la propagación viral y la formación de dendritas se visualicen claramente.
   3. Asegúrese de devolver las córneas infectadas a la incubadora de cultivo de tejidos y guarde todas las imágenes que se tomaron.
3. Cuantificación de la infección por virus
   NOTA: Los títulos de virus de las córneas porcinas deben evaluarse todos los días para analizar el efecto del tratamiento farmacológico.
   1. Para cuantificar el virus, sembrar células Vero a una densidad de 5 x 10⁵ de células por pozo si se utiliza una placa de 6 pozos como se hizo en este experimento. Haga esto un día antes de la infección. Incubar las células chapadas durante la noche para asegurarse de que sean confluentes para la cuantificación del virus.
   2. Alícuota 500 μL de medios libres séricos en múltiples tubos de microcentrífuga. Inserte un hisopo estéril con punta de algodón sumergido en los tubos llenos de medios libres de suero. Los hisopos de algodón deben sumergirse y humedecerse durante al menos 5 minutos antes del uso.
   3. Sin perturbar los medios subyacentes, transporte la placa de córnea porcina infectada a un gabinete de bioseguridad. Usando los hisopos húmedos de algodón, haga 3 revoluciones en el sentido de las agujas del reloj y 3 revoluciones en sentido contrario a las agujas del reloj a un diámetro de 5 mm desde el centro de la córnea porcina infectada sin aplicar una presión excesiva.
   4. Inserte de nuevo el hisopo de algodón en el tubo de microcentrífuga lleno de medios libres de suero y gírelo en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj 5 veces. La punta metálica del hisopo de algodón debe cortarse para que quepa completamente en el tubo de la microcentrífuga y la tapa se pueda cerrar.
   5. Coloque el tubo de la microcentrífuga que contiene la punta de algodón hisopado en una máquina de vórtice y el vórtice a alta velocidad durante 1 minuto.
   6. Realizar la cuantificación del virus a través de un ensayo de placa en estas muestras.
      NOTA: Este paso de cuantificación debe realizarse en los días 2, 4 y, opcionalmente, en 6 días después de la infección.
4. Cuantificación del virus mediante ensayo de placa
   NOTA: Para realizar un ensayo de placa, crezca y platee las células Vero en una placa de 6 pozos y asegure una confluencia del 90% de las células antes del inicio del ensayo. Utilice un matraz confluente de 75 cm² de estas células. Todos los pasos a continuación deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad.
   1. Lave la monocapa confluente de células Vero en el matraz con 10 ml de solución salina tampón de fosfato fresco (PBS) después de aspirar el medio de cultivo. Repita el paso de lavado una vez más con PBS después de aspirar el primer juego de solución de lavado.
   2. Añadir 1 ml de tripsina al 0,05% a la monocapa celular. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min. A simple vista, asegúrese de que las células estén separadas de la superficie interior del matraz. De lo contrario, espere otros 5 minutos antes de volver a examinar el matraz. Cuando las células parezcan estar separadas, agregue 9 ml de medios enteros a la monocapa para asegurarse de que las células se desalojen completamente de la superficie del matraz.
   3. Recoge todas las células del matraz junto con todo el medio y colócalas en un tubo centrífugo de 15 ml.
   4. Para cada pozo de las 6 placas de pozo que se utilizan para el ensayo de placa, use 300 μL del tubo de la centrífuga. Rellene cada pozo de la placa de 6 pozos con 2 ml de medios enteros. Deje las placas en la incubadora durante la noche para permitir que crezcan y formen una monocapa confluente en cada pozo.
   5. Para realizar un ensayo de placa, se debe realizar una dilución en serie de las muestras antes de la cuantificación del virus.
   6. Realizar una dilución log₁₀1 veces del virus en tubos de microcentrífuga utilizando medios libres de suero hasta alcanzar una dilución de^{10 -8.} Cuando en una dilución de 10^-3, transfiera 1 ml de la dilución a la monocapa de células chapadas después de aspirar los medios de crecimiento en las células de la placa de 6 pozos, este será el paso de infección. Incubar la placa infectada a 37 °C incubadora durante 2 h.
   7. Aspire los medios de infección existentes, lave con PBS dos veces suavemente para recubrir las células y agregue 2 ml de medios cargados de metilcelulosa por pozo a los 6 pozos. Incubar durante 72 h o hasta que se pueda ver la formación de placas. Las placas se pueden identificar por la formación de pequeños espacios entre las células en la monocapa celular.
   8. Agregue 1 ml de metanol lentamente a la esquina de cada pozo, utilizando la pared como punta guía. Incubar la placa de 6 pozos a temperatura ambiente durante 15 min. Aspire lentamente el contenido de cada pozo de la placa sin perturbar o agitar la monocapa celular.
   9. Agregue 1 ml de solución de trabajo violeta cristalina a cada pozo de placa de 6 pozos, asegurando que todas las células estén cubiertas. Incubar la placa de 6 pozos en la oscuridad durante 30 min. Deseche la solución violeta cristalina acrispándola y seque los pozos en una hoja de papel absorbente.
   10. Cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total del virus en la solución inicial. Repita el proceso dos veces para confirmar el título viral.

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Resultados

Para comprender la eficacia de los antivirales experimentales, deben probarse ampliamente antes de enviarlos a ensayos clínicos in vivo en humanos. En este sentido, se deben identificar los grupos de control positivo, control negativo y prueba. La trifluorotimidina (TFT) se ha utilizado durante mucho tiempo como el tratamiento preferido para tratar la queratitis por herpes por vía tópica¹⁶. Utilizados como un control positivo, los grupos corneales tratados con TFT muestran una menor propagació...

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Discusión

Investigaciones anteriores han demostrado que BX795 tiene un papel prometedor como agente antiviral contra la infección por HSV-1; inhibiendo la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1)¹⁶. Tanto TBK1 como la autofagia han desempeñado un papel en ayudar a inhibir la infección por HSV-1, como se ha demostrado en las células epiteliales corneales humanas. BX795 demostró ser máximamente efectivo con actividad antiviral a una concentración de 10μM y utilizando tanto el análisis de western blot como e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	-	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Special order by request
Procedure bench covers - as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586