L’explantation de tissu cornéen porcin étudiera l’efficacité des antiviraux du virus de l’herpès simplex-1

Résumé

Nous décrivons l’utilisation d’une cornée porcine pour tester l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux.

Résumé

Les virus et les bactéries peuvent causer une variété de défauts de la surface oculaire et de dégénérescence tels que des plaies et des ulcères par infection cornéenne. Avec une séroprévalence qui varie de 60 à 90% dans le monde, le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1) provoque généralement des lésions muco-cutanées de la région orofaciale qui se manifestent également par des lésions et une cécité associée à l’infection. Bien que les médicaments antiviraux actuels soient efficaces, l’émergence d’une résistance et la persistance d’effets secondaires toxiques nécessitent le développement de nouveaux antiviraux contre cet agent pathogène omniprésent. Bien que l’évaluation in vitro fournisse certaines données fonctionnelles concernant un antiviral émergent, elles ne démontrent pas la complexité du tissu oculaire in vivo. Cependant, les études in vivo sont coûteuses et nécessitent un personnel qualifié, en particulier lorsqu’il s’est employé avec des agents viraux. Par conséquent, les modèles ex vivo sont des étapes efficaces mais peu coûteuses pour les tests antiviraux. Nous discutons ici d’un protocole pour étudier l’infection par le HSV-1 en utilisant des cornées porcines ex vivo et d’une méthode pour les traiter par voie topique en utilisant des médicaments antiviraux existants et nouveaux. Nous démontrons également la méthode pour effectuer un dosage de plaque en utilisant HSV-1. Les méthodes détaillées peuvent être utilisées pour mener des expériences similaires afin d’étudier les infections qui ressemblent à l’agent pathogène HSV-1.

Introduction

Les personnes souffrant d’infections oculaires subissent souvent une perte de vision¹. Avec une séroprévalence élevée dans le monde entier, les personnes infectées par le HSV souffrent d’infections oculaires récurrentes qui entraînent des cicatrices cornéennes, une kératite stromale et une néovascularisation^2,3,4,5. Les infections à HSV ont également montré qu’ils causaient moins fréquemment, une gamme de conditions graves chez les patients immunodéprimés et non traités comme l’encéphalite et la morbidité systémique^6,7,8. Des médicaments comme l’acyclovir (VINAIGRE de cidre de pomme) et ses analogues nucléosidiques ont montré un succès constant dans la réduction de l’infection par le HSV-1 et même dans le contrôle de la réactivation, mais l’utilisation prolongée de ces médicaments est associée à une insuffisance rénale, à des anomalies fœtales et à l’incapacité de limiter l’émergence d’une résistance aux médicaments aux souches virales en évolution^{9,10 , 11,12,13}. Les complexités associées aux infections oculaires à HSV-1 ont déjà été étudiées in vitro à l’aide de monocouches et de cultures 3D de cellules cornéennes humaines et in vivo à l’aide d’infections oculaires murines ou de lapin. Bien que ces modèles in vitro fournissent des données significatives sur les composants biologiques cellulaires des infections à HSV-1, ils ne parviennent toutefois pas à imiter la complexité complexe du tissu cornéen et ne font pas grand-chose pour éclairer la propagation dendritique du virus¹⁴. En revanche, bien que les systèmes in vivo soient plus perspicaces en montrant la propagation de l’infection dans les cornées et les réponses d’activation immunitaire pendant l’infection par le HSV-1, ils viennent avec la mise en garde qu’ils ont besoin d’enquêteurs formés et de grandes installations pour les soins aux animaux pour ignorer les expériences.

Ici, nous utilisons des cornées porcines comme modèle ex vivo pour examiner le système de plaie induit par l’infection par le HSV-1. La pharmacologie potentielle de certains médicaments ainsi que la biologie cellulaire et moléculaire du système de la plaie causée par l’infection peuvent être étudiées à travers des cultures d’explants tissulaires. Ce modèle peut également être modifié pour l’utilisation d’autres infections virales et bactériennes. Dans cette étude, des cornées porcines ont été utilisées pour tester l’efficacité antivirale d’une petite molécule préclinique, BX795. L’utilisation de cornées porcines a été préférée en raison de la facilité d’accès et de la rentabilité. De plus, les modèles cornéens porcins sont de bons modèles d’yeux humains, les cornées étant faciles à isoler, adéquatement dimensionnées pour l’infection et la visualisation et robustes à manipuler¹⁵. Les cornées porcines sont également comparables à la complexité des modèles cornéens humains à la fois dans la perméabilité trans cornéenne et l’absorption systémique^15. En utilisant ce modèle pour l’étude, nous avons pu élucider comment BX795 mérite une étude plus approfondie en tant qu’inhibiteur compétent de l’infection par le virus HSV-1 et ajoute à la littérature de le classer comme un composé antiviral potentiel à petites^{molécules 16}.

Protocole

Tous les tissus porcins utilisés dans cette étude ont été fournis par une organisation privée tierce et aucune manipulation des animaux n’a été effectuée par le personnel de l’Université de l’Illinois à Chicago.

1. Matériaux

1. Réactifs
   1. Utilisez les réactifs suivants pour le dosage de la plaque : méthylcellulose en poudre, milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), sérum bovin fœtal (FBS), pénicilline et streptomycine (P/S) pour le dosage de la plaque.
   2. Utilisez des comprimés de violette cristalline et de l’éthanol (grade de biologie moléculaire) pour préparer une solution de violette cristalline pour le dosage de la plaque.
2. Milieu de croissance cellulaire Vero - Milieu entier DMEM
   1. Ouvrez le flacon de média DMEM à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire. Retirer 55 mL de média de la bouteille à l’aide d’une pipette sérologique et jeter. Ajoutez 50 mL de FBS de P/S à DMEM. Réfrigérer à 4 °C.
3. Milieu d’essai de la plaque - Stock de milieux de méthylcellulose à 5 %
   1. Mesurer 2,5 g de poudre de méthylcellulose avec un aimant remuant à l’intérieur d’une bouteille en verre de 500 mL et l’autoclaver. Une fois la bouteille refroidie à température ambiante, prendre 500 mL de milieu entier DMEM contenant 50 mL de FBS et 5 mL de P/S et l’ajouter à une bouteille en verre contenant de la méthylcellulose.
   2. Remuez à 4 °C pendant 2 jours à l’aide d’un agitateur magnétique. Réfrigérer à 4 °C.
4. Préparation des milieux pour la cornée porcine excisée
   1. Ouvrez un flacon de milieu essentiel minimum (MEM) à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire. Jeter 10 mL de MEM de la bouteille à l’aide d’une pipette sérologique.
   2. Ajouter 5 mL d’insuline-transferrine-sélénium (ITS) et 5 mL d’antibiotique antimycotique (AA) au milieu et réfrigérer à 4 °C.
5. Maître et stock de travail de violet cristallin:
   1. Pour faire la solution de cristal violet, ajouter 1 g de poudre de violet cristallin à 100 mL d’éthanol à 20% dans l’eau. Ce stock (1% p / v de violet cristallin) peut être stocké et utilisé jusqu’à un an lorsqu’il est stocké dans un endroit sombre.
   2. Pour en faire un stock de travail, ajoutez 50 mL de solution d’origine à 350 mL d’eau. Ajouter 100 mL d’éthanol à cette solution pour faire une solution de violet cristallin de travail de 500 mL (0,1% p/v de violet cristallin).
      REMARQUE: Ces deux solutions doivent être stockées dans l’obscurité.

2. Procédure

1. Isolement des cornées porcines des yeux entiers¹⁷
   1. Après avoir reçu les yeux porcins d’un vendeur approprié, entreposer sur de la glace s’il y a un retard dans le traitement des tissus, comme illustré à la figure 1.
   2. Assurez-vous que l’équipement de protection individuelle est utilisé et porté pendant cette procédure pour éviter la contamination ainsi que les accidents dus à un déversement d’humeur vitrée.
   3. Vaporisez la zone de travail avec 70% d’éthanol pour nettoyer et désinfecter. Pour vous assurer que l’espace de travail est stable, étalez un couvercle de banc et collez du ruban adhésif sur les côtés en toute sécurité, comme illustré à la figure 2.
   4. Placer les yeux porcins sur de la gaze (Figure 3). À l’aide de gaze de 50 mm, tenir d’une seule main la section postérieure(figure 4A)des yeux de porc, comme le montre la figure 4B.
   5. À l’avec une aiguille de 30 G, faites doucement une seule piqûre au centre de la surface épithéliale de l’œil avec précaution et assurez-vous qu’il n’y a pas de dommages au stroma (Figure 5). Le poke doit être limité à l’épithélium (~100-200 μm) pour éviter une atteinte stromale.
   6. À l’aide d’une lame stérilisée tranchante, faites une petite incision sur la sclérotique à 1 mm de distance de la cornée. Couper le bord de la cornée en veillant à ce que l’humeur vitrée ne fuie pas en utilisant une action de rotation rapide et lisse de la main (Figure 6A). En maintenant la cornée au bord de la cornée-sclérotique à l’aide d’une pince à épiler plate, coupez les membranes d’attache restantes de l’œil à l’aide de la lame (Figure 6B).
   7. Prenez la cornée et placez-la dans une plaque de 12 puits recouverte de 2 mL de milieu cornéen. La cornée doit être placée vers le haut, comme le montre une série d’étapes dans les figures 7A-D, figure 8).
   8. Ajouter 5 μL de la solution virale contenant 5 x 10⁵ unités formant de la plaque (PFU) de 17 GFP au site débridé sur la surface cornéenne. Placer la plaque de 12 puits contenant des cornées porcines infectées dans un incubateur contenant 5% de CO₂ pendant 72 h.
   9. Vaporisez tous les yeux supplémentaires non utilisés à l’expérience avec de l’eau de Javel à 10% et jetez-les solidement dans des sacs à risque biologique.
2. Visualisation
   REMARQUE: Le virus doit être visualisé tous les jours avant l’ajout de médicaments.
   1. Allumez le stéréomicroscope et la source de lumière LED et laissez la lampe de la machine se réchauffer avant d’imager les cornées. Portez soigneusement la plaque de cornées à l’instrument sans perturber la solution. Modifiez le filtre pour que GFP (380-460 nm) soit utilisé pour examiner les spécimens. Réglez le temps d’exposition sur 500 ms pour capturer des images.
   2. Tout d’abord, placez la plaque cornéenne sous le stéréoscope et capturez les images au grossissement le plus bas de 7,5x. Poursuivez avec une série d’images de grossissement croissant (par exemple, 15x, 25x, 35x) de sorte que toute la propagation virale et la formation de dendrites sont visualisées clairement
   3. Assurez-vous de remettre les cornées infectées dans l’incubateur de culture tissulaire et de sauvegarder toutes les images qui ont été prises.
3. Quantification de l’infection virale
   REMARQUE: Les titres de virus des cornées porcines doivent être évalués tous les jours pour analyser l’effet du traitement médicamenteux.
   1. Pour quantifier le virus, ensemencez des cellules Vero à une densité de 5 x 10⁵ cellules par puits si vous utilisez une plaque de 6 puits comme cela a été fait dans cette expérience. Faites-le un jour avant l’infection. Incuber les cellules plaquées pendant la nuit pour s’assurer qu’elles sont confluentes pour la quantification du virus.
   2. Aliquote 500 μL de milieux libres de sérum dans plusieurs tubes de microcentrifugation. Insérez un coton-tige stérile trempé dans les tubes remplis de milieu libre de sérum. Les cotons-tiges doivent être trempés et mouillés pendant au moins 5 minutes avant l’utilisation.
   3. Sans perturber le milieu sous-jacent, transportez la plaque cornéenne porcine infectée dans une armoire de biosécurité. En utilisant les cotons-tiges humides, effectuez 3 tours dans le sens des aiguilles d’une montre et 3 tours dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à un diamètre de 5 mm du centre de la cornée porcine infectée sans appliquer de pression excessive.
   4. Réinsérez le coton-tige dans le tube de microcentrifugation rempli de milieu libre de sérum et faites-le pivoter 5 fois dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. L’extrémité métallique du coton-tige doit être coupée court afin qu’elle s’insère entièrement dans un tube de microcentrifugation et que le couvercle puisse être fermé.
   5. Placez le tube de microcentrifugation contenant la pointe de coton tamponnée sur une machine vortex et vortex à grande vitesse pendant 1 min.
   6. Effectuer la quantification du virus via un test de plaque sur ces échantillons.
      REMARQUE: Cette étape de quantification doit être effectuée les jours 2, 4 et éventuellement les 6 jours suivant l’infection.
4. Quantification du virus par dosage de la plaque
   REMARQUE: Pour effectuer un test de plaque, développez et plaquez les cellules Vero dans une plaque de 6 puits et assurez-vous de la confluence de 90% des cellules avant le début du test. Utilisez une fiole confluente de 75 cm² de ces cellules. Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire de biosécurité.
   1. Laver la monocouche confluente des cellules Vero dans la fiole avec 10 mL de solution saline tampon phosphate frais (PBS) après avoir aspiré le milieu de culture. Répétez l’étape de lavage une fois de plus avec PBS après avoir aspiré le premier ensemble de solution de lavage.
   2. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % à la monocouche cellulaire. Incuber la fiole à 37 °C pendant 5 min. À l’œil nu, assurez-vous que les cellules sont détachées de la surface intérieure de la fiole. Sinon, attendez encore 5 minutes avant d’examiner à nouveau la fiole. Lorsque les cellules semblent détachées, ajoutez 9 mL de milieu entier à la monocouche pour vous assurer que les cellules se délogent complètement de la surface de la fiole.
   3. Recueillir toutes les cellules de la fiole ainsi que l’ensemble du milieu et les placer dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
   4. Pour chaque puits des 6 plaques de puits utilisées pour le dosage de la plaque, utilisez 300 μL du tube de centrifugeuse. Complétez chaque puits de la plaque de 6 puits avec 2 mL de média entier. Laissez les plaques dans l’incubateur pendant la nuit pour leur permettre de se développer et de former une monocouche confluente dans chaque puits.
   5. Afin d’effectuer un test de plaque, effectuer une dilution en série des échantillons doit être effectuée avant la quantification du virus.
   6. Effectuer une dilution log₁₀1 fois du virus dans des tubes de microcentrifugation à l’aide de milieux sans sérum jusqu’à ce qu’une dilution de 10^{à 8} soit atteinte. Lorsqu’à une dilution de 10^{à 3,} transférer 1 mL de la dilution à la monocouche de cellules plaquées après avoir aspiré le milieu de croissance sur les cellules à partir de la plaque de 6 puits, ce sera l’étape de l’infection. Incuber la plaque infectée à 37 °C de l’incubateur pendant 2 h.
   7. Aspirer les milieux infect infectiers existants, laver doucement avec du PBS pour enrober les cellules et ajouter 2 mL de milieux chargés de méthylcellulose par puits aux 6 puits. Incuber pendant 72 h ou jusqu’à ce que l’on puisse voir la formation de plaques. Les plaques peuvent être identifiées par la formation de petits espaces entre les cellules de la monocouche cellulaire.
   8. Ajouter lentement 1 mL de méthanol au coin de chaque puits, en utilisant le mur comme pointe de guidage. Incuber la plaque de 6 puits à température ambiante pendant 15 min. Aspirer lentement le contenu de chaque puits de la plaque sans perturber ou agiter la monocouche cellulaire.
   9. Ajouter 1 mL de solution de travail de violet cristallin à chaque puits de 6 plaques de puits, en veillant à ce que toutes les cellules soient couvertes. Incuber la plaque de 6 puits dans l’obscurité pendant 30 min. Jetez la solution de violet cristallin en l’aspirant et séchez les puits sur une feuille de papier absorbant.
   10. Compter le nombre de plaques au puits de dilution le plus élevé pour quantifier la teneur totale en virus dans la solution de départ. Répétez le processus deux fois pour confirmer le titre viral.

Résultats

Pour comprendre l’efficacité des antiviraux expérimentaux, ils doivent être testés de manière approfondie avant d’être envoyés pour des essais cliniques humains in vivo. À cet égard, les groupes témoins positifs, les groupes témoins négatifs et les groupes de test doivent être identifiés. La trifluorothymidine (TFT) a longtemps été utilisée comme traitement préféré pour traiter la kératite herpès par voie topique¹⁶. Utilisés comme témoin positif, les groupes cornéens t...

Discussion

Des recherches antérieures ont montré que le BX795 joue un rôle prometteur en tant qu’agent antiviral contre l’infection par le HSV-1; en inhibant la kinase 1 (TBK1)¹⁶liant TANK. Le TBK1 et l’autophagie ont tous deux joué un rôle dans l’inhibition de l’infection par le HSV-1, comme l’ont démontré les cellules épithéliales cornéennes humaines. BX795 s’est avéré être le plus efficace possible avec une activité antivirale à une concentration de 10 μM et en utilisant à l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	-	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Special order by request
Procedure bench covers - as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586