רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

Summary

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

Abstract

וירוסים וחיידקים יכולים לגרום למגוון פגמים בקרצוף העין והתנוונות כגון פצעים וכיבים באמצעות זיהום בקרנית. עם seroprevalence הנע בין 60-90% ברחבי העולם, וירוס הרפס סימפלקס סוג-1 (HSV-1) בדרך כלל גורם נגעים ריר של האזור orofacial אשר באים לידי ביטוי גם כמו נגעים ועיוורון הקשורים לזיהום. בעוד התרופות האנטי ויראליות הנוכחיות יעילות, הופעת ההתנגדות וההתמדה של תופעות לוואי רעילות מחייבת פיתוח של תרופות אנטי ויראליות חדשניות נגד פתוגן זה בכל מקום. למרות בהערכת במבחנה מספק כמה נתונים פונקציונליים לגבי אנטי ויראלי המתעורר, הם אינם מדגימים את המורכבות של רקמת העין ב vivo. עם זאת, במחקרים vivo הם יקרים דורשים כוח אדם מאומן, במיוחד כאשר עובדים עם סוכנים ויראליים. לפיכך דגמי ex vivo הם צעדים יעילים אך זולים לבדיקות אנטי ויראליות. כאן אנו דנים בפרוטוקול לחקר זיהום על ידי HSV-1 באמצעות קרניות חזיר ex vivo ושיטה לטיפול בהם באופן מקומי באמצעות תרופות קיימות וחדשניות. אנו גם מדגימים את השיטה לביצוע ביצוע פלאק באמצעות HSV-1. השיטות המפורטות עשויות לשמש לעריכת ניסויים דומים לחקר זיהומים הדומים לפתוגן HSV-1.

Introduction

אנשים הסובלים מזיהומים בעיניים לעתים קרובות נגרמים אובדן ראייה¹. עם seroprevalence גבוה ברחבי העולם, אנשים נגועים HSV סובלים דלקות עיניים חוזרות אשר מובילים הצטלקות קרנית, קרטיטיס סטרומה וניאווסקולריזציה^2,3,4,5. זיהומים HSV הראו גם לגרום בתדירות נמוכה יותר, מגוון של מצבים חמורים בקרב immunocompromised, חולים לא מטופלים כמו דלקת המוח ותחלואה מערכתית^6,7,8. תרופות כמו Acyclovir (ACV) ואנלוגי הנוקלאוזיד שלה הראו הצלחה עקבית בריסון זיהום HSV-1 ואפילו לשלוט בהפעלה מחדש, אך השימוש הממושך בתרופות אלה קשור לאי ספיקת כליות, חריגות עובריות ואי הגבלת הופעת עמידות לסמים לזנים ויראליים מתפתחים^{9,10,11,12,13}. מורכבויות הקשורות לזיהומים עיניים HSV-1, נחקרו בעבר במבחנה באמצעות monolayers ו תרביות 3D של תאי הקרנית האנושיים in vivo באמצעות זיהומים מורין או עיני ארנב. בעוד מודלים במבחנה אלה מספקים נתונים משמעותיים על הרכיבים הביולוגיים התאיים של זיהומים HSV-1, הם, עם זאת, אינם מצליחים לחקות את המורכבות המורכבת של רקמת הקרנית ולא עושים הרבה כדי להאיר את ההתפשטות הדנדריטית של הנגיף¹⁴. לעומת זאת, למרות שבמערכות vivo תובנות יותר בהצגת התפשטות זיהום בקרנית ותגובות הפעלה חיסוניות במהלך זיהום HSV-1, הם מגיעים עם האזהרה כי הם דורשים חוקרים מיומנים ומתקנים גדולים לטיפול בבעלי חיים להתעלם מהניסויים.

כאן אנו משתמשים בקרנית חזירים כמודל ex vivo כדי לבחון את מערכת הפצע המושרה זיהום HSV-1. הן את הפרמקולוגיה הפוטנציאלית של תרופות מסוימות, כמו גם את התא ואת הביולוגיה המולקולרית של מערכת הפצע הנגרמת על ידי הזיהום ניתן ללמוד באמצעות תרביות explant רקמות. מודל זה עשוי להיות מתוקן גם לשימוש עבור זיהומים ויראליים וחיידקיים אחרים גם כן. במחקר זה, קרניות חזיר שימשו כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של מולקולה קטנה פרה-קלינית, BX795. השימוש בקרניות חזירים היה מועדף בשל קלות הגישה וחסכונות העלות. בנוסף, מודלים קרנית חזיר הם מודלים טובים של עיניים אנושיות עם קרניות להיות קל לבודד, בגודל נאות עבור זיהום ויזואליזציה וחזק להתמודד עם¹⁵. קרניות חזירים דומות גם למורכבות של מודלים קרניים אנושיים הן בחדירה לקרנית טרנס והן בספיגה מערכתית¹⁵. באמצעות מודל זה למחקר, הצלחנו להבהיר כיצד BX795 ראוי לחקירה נוספת כמעכב מוסמך של זיהום וירוס HSV-1 ומוסיף לספרות של סיווגו כתרכובת אנטי ויראלית פוטנציאלית של מולקולה קטנה¹⁶.

Protocol

כל רקמת החזיר המשמשת במחקר זה סופקה על ידי ארגון פרטי של צד שלישי ואף אחד מהטיפול בבעלי חיים לא בוצע על ידי אוניברסיטת אילינוי באנשי שיקגו.

1. חומרים

1. ריאגנטים
   1. השתמש ריאגנטים הבאים לבדיקת פלאק: אבקת methylcellulose, מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין וסטרפטומיצין (P /S) לבדיקת פלאק.
   2. השתמש טבליות סגול קריסטל ואתנול (כיתה ביולוגיה מולקולרית) להכנת פתרון סגול קריסטל לבדיקת פלאק.
2. מדיה צמיחה תא Vero - מדיה שלמה DMEM
   1. פתח את בקבוק המדיה DMEM בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. הסר 55 מ"ל של מדיה מהבקבוק באמצעות pipette סרולוגי להשליך אותו. הוסף 50 מ"ל של FBS של P/S ל- DMEM. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.
3. פלאק אסאי מדיה - מניה של 5% מתילקולוז מדיה
   1. מדוד 2.5 גרם של אבקת מתילצלולוז עם מגנט ערבוב בתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל וסגור אותו אוטומטית. לאחר הבקבוק מתקרר לטמפרטורת החדר, לקחת 500 מ"ל של מדיה שלמה DMEM המכיל 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של P / S ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית המכיל methylcellulose.
   2. מערבבים את זה ב 4 °C במשך 2 ימים באמצעות stirrer מגנטי. יש לשמור בקירור ב-4 מעלות צלזיוס.
4. הכנה תקשורתית לקרנית חזירית מובאת
   1. פתח בקבוק מדיה חיונית מינימלית (MEM) בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות. יש להשליך 10 מ"ל של MEM מהבקבוק באמצעות פיפטה סרולוגית.
   2. הוסיפו 5 מ"ל של אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) ו-5 מ"ל של אנטי-מיקוטית-אנטיביוטיקה (AA) לתקשורת והכניסו למקרר ל-4 מעלות צלזיוס.
5. מאסטר ומלאי עובד של סגול קריסטל:
   1. כדי להפוך את פתרון מלאי סגול קריסטל, להוסיף 1 גרם של אבקת סגול קריסטל ל 100 מ"ל של 20% אתנול במים. מניה זו (1% w / v קריסטל סגול) ניתן לאחסן ולהשתמש עד שנה כאשר מאוחסן במקום חשוך.
   2. כדי להפוך מלאי עובד מזה, להוסיף 50 מ"ל של פתרון מלאי מקורי 350 מ"ל של מים. הוסף 100mL של אתנול לפתרון זה כדי להפוך 500 mL עובד קריסטל סגול פתרון (0.1% w / v קריסטל סגול).
      הערה: שני פתרונות אלה צריכים להיות מאוחסנים בחושך.

2. הליך

1. בידוד של קרניות חזירים מעיניים שלמות¹⁷
   1. עם קבלת עיני החזיר ממוכר מתאים, יש לאחסן בקרח אם יש עיכוב בעיבוד רקמות כפי שמצולמים באיור 1.
   2. ודא כי ציוד הגנה אישי משמש ושחוק במהלך הליך זה כדי למנוע זיהום, כמו גם תאונות משפוך של הומור הזגום.
   3. לרסס את אזור העבודה עם 70% אתנול כדי לנקות ולחטא. כדי להבטיח שמרחב העבודה יציב, פזורו כיסוי ספסל והדביקו את הצדדים בצורה מאובטחת כפי שהם בתמונה באיור 2.
   4. הניחו עיני חזיר על גזה(איור 3). בעזרת גזה בקוטר 50 מ"מ, יש להחזיק את החלק האחורי (איור 4A)של עיני חזיר כפי שמוצג באיור 4B ביד אחת.
   5. בעזרת מחט של 30 גרם, הכינו בעדינות דקירה בודדת במרכז המשטח האפיתל של העין בזהירות וודאו שאין נזק לסטרומה(איור 5). הדקירה צריכה להיות מוגבלת לאפיתל (~ 100-200 מיקרומטר) כדי למנוע מעורבות סטרומה.
   6. באמצעות להב מעוקר חד, לעשות עיגול קטן על sclera במרחק 1 מ"מ מן הקרנית. חותכים את קצה הקרנית ומבטיחים שההומור הזגג לא ידלוף באמצעות פעולה מסתובבת מהירה וחלקה של היד(איור 6A). על ידי החזקת הקרנית בקצה הקרנית-סקלרה עם פינצטה שטוחה, חתוך את שאר ממברנות קשירה של העין באמצעות הלהב(איור 6B).
   7. קח את הקרנית ומניחים אותו בצלחת 12-well מכוסה עם 2 מ"ל של קרנית בינונית. הקרנית צריכה להיות ממוקמת עם הפנים כלפי מעלה, המודגמת בסדרת שלבים באיור 7A-D, איור 8).
   8. הוסף 5 μL של פתרון הווירוס המכיל 5 x 10⁵ יחידות יצירת פלאק (PFU) של 17 GFP לאתר מושמץ על פני הקרנית. מניחים את הצלחת 12-well המכיל קרני חזיר נגועות באינקובטור עם 5% CO₂ עבור 72 שעות.
   9. יש לרסס לעיניים נוספות שלא נעשה בהן שימוש בניסוי עם 10% אקונומיקה ולהשליך בבטחה בשקיות ביולוגיות.
2. ויזואליזציה
   הערה: יש לדמיין את הנגיף כל יום לפני הוספת תרופות.
   1. הפעל את מיקרוסקופ הסטריאו ואת מקור אור ה- LED ואפשר למנורת המכונה להתחמם לפני הדמיית הקרניות. בזהירות לשאת את צלחת הקרנית למכשיר מבלי להפריע לפתרון. שנה את המסנן כך ש- GFP (380-460 ננומטר) ישמש להסתכל על דגימות. הגדר את זמן החשיפה ל- 500 ms כדי ללכוד תמונות.
   2. ראשית, מניחים את צלחת הקרנית מתחת לסטריאוסקופ ולוכדים את התמונות בהגדלה הנמוכה ביותר של 7.5x. עקוב אחר זה עם סדרה של תמונות הגדלה הולכות וגדלות (למשל, 15x, 25x, 35x) כך שכל ההתפשטות הנגיפית ויצירת דנדריט דמיינו בבירור
   3. הקפד להחזיר את הקרניות הנגועות בחזרה לאינקובטור תרבית הרקמות ולשמור את כל התמונות שצולמו.
3. כימות זיהום וירוס
   הערה: טיטרים וירוס מן קרניות חזיר יש להעריך כל יום כדי לנתח את ההשפעה של טיפול תרופתי.
   1. כדי לכמת וירוס, זרע תאי Vero בצפיפות של 5 x 10⁵ של תאים לבאר אם באמצעות צלחת 6-טוב כפי שנעשה בניסוי זה. עשה זאת יום לפני ההדבקה. לדגור על התאים מצופים לילה כדי להבטיח שהם ממפגש לכימות וירוסים.
   2. Aliquot 500 μL של מדיה חופשית בסרום לתוך צינורות microcentrifuge מרובים. הכנס ספוגית כותנה סטרילית טבולה לתוך צינורות מלאים מדיה חינם סרום. דגימות הכותנה צריכות להיות טבולות ומרטיבות לפחות 5 דקות לפני השימוש.
   3. מבלי להפריע לתקשורת הבסיסית, העבירו את צלחת הקרנית החזירית הנגועה לארון בטיחות ביולוגית. באמצעות צמר גפן רטוב, לעשות 3 מהפכות בכיוון השעון ו 3 מהפכות נגד כיוון השעון בקוטר של 5 מ"מ ממרכז הקרנית החזירית הנגועה מבלי להפעיל לחץ מוגזם.
   4. הכנס בחזרה את ספוגית הכותנה לתוך צינור microcentrifuge מלא מדיה סרום ולסובב אותו בכיוון השעון ואנטי בכיוון השעון 5 פעמים. קצה המתכת של ספוגית הכותנה צריך להיחתך כך שהוא מתאים לחלוטין לצינור microcentrifuge ואת המכסה ניתן לסגור.
   5. מניחים את צינור microcentrifuge המכיל את קצה הכותנה הספוג על מכונת מערבולת ומערבולת במהירות גבוהה במשך 1 דקות.
   6. בצע כימות וירוס באמצעות מנסרה פלאק על דגימות אלה.
      הערה: שלב כימות זה צריך להתבצע בימים 2, 4 ובאופן אופציונלי על 6 ימים לאחר ההדבקה.
4. כימות וירוסים על ידי פלאק אסייד
   הערה: כדי לבצע פלאק אסייד, לגדול צלחת תאי Vero לתוך צלחת 6 היטב ולהבטיח 90% השפעה של תאים לפני תחילת מבחנה. השתמש בבקבוק 75 ס"מ² של תאים אלה. כל השלבים שלהלן צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
   1. לשטוף את monolayer confluent של תאי Vero בבקבוקון עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט טרי (PBS) לאחר שאיפה מדיום התרבות. חזור על שלב הכביסה שוב עם PBS לאחר שאיפה את הסט הראשון של פתרון לשטוף.
   2. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין למונו-שכבתית של התא. לדגור על הבקבוקון ב 37 °C (5 דקות). בעין בלתי, ודא שהתאים מנותקים מפני השטח הפנימיים של הבקבוקון. אם לא, המתן עוד 5 דקות לפני שתבחן שוב את הבקבוקון. כאשר נראה שהתאים מנותקים, הוסף 9 מ"ל של מדיה שלמה למונו-שכבתית כדי להבטיח שהתאים יתנתקו לחלוטין ממשטח הבקבוק.
   3. לאסוף את כל התאים מן הבקבוק יחד עם התקשורת כולה ומניחים אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   4. עבור כל באר של 6 צלחות היטב המשמשים לבדיקת פלאק, להשתמש 300 μL מן צינור צנטריפוגה. למעלה כל באר של צלחת 6 היטב עם 2 מ"ל של מדיה שלמה. השאירו את הצלחות באינקובטור למשך הלילה כדי לאפשר להם לגדול וליצור מונולייר משוחח בכל באר.
   5. על מנת לבצע בדיקת פלאק, לבצע דילול סדרתי של דגימות צריך להתבצע לפני כימות הנגיף.
   6. בצע_{דילול פי 10}1 של הנגיף בצינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות מדיה חופשית בסרום עד לדילול של 10^-8 הוא הגיע. כאשר ב 10^-3 דילול, להעביר 1 מ"ל של דילול למונולייר של תאים מצופים לאחר שאיפה את מדיה הצמיחה על התאים מן צלחת 6 באר, זה יהיה שלב הזיהום. לדגור את הצלחת הנגועה ב 37 °C אינקובטור במשך 2 שעות.
   7. שאפו את אמצעי ההדבקה הקיימים, שטפו עם PBS פעמיים בעדינות כדי לצפות תאים והוסיפו 2 מ"ל של מדיה עמוסה במתיל צלולוז לכל באר לכל 6 בארות. דגירה במשך 72 שעות או עד היווצרות של לוחות ניתן לראות. לוחות ניתן לזהות על ידי היווצרות של פערים קטנים בין תאים ב monolayer התא.
   8. הוסף 1 מ"ל של מתנול לאט לפינה של כל באר, באמצעות הקיר כקצה מנחה. לדגור על צלחת 6 באר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאט לאט לשאוף את התוכן של כל באר מהצלחת מבלי להפריע או להסעיר את monolayer התא.
   9. הוסף 1 מ"ל של קריסטל סגול עובד פתרון לכל באר של 6 צלחת היטב, הבטחת כל התאים מכוסים. לדגור על צלחת 6 היטב בחושך במשך 30 דקות. יש להשליך את תמיסת הגביש הסגול על ידי שאיפתה ולייבש את בארות על גיליון נייר סופג.
   10. ספירת מספר הלוחות בבאר הדילול הגבוהה ביותר כדי לכמת את תוכן הווירוס הכולל בפתרון ההתחלתי. חזור על התהליך פעמיים כדי לאשר את טיטר הנגיף.

תוצאות

כדי להבין את היעילות של האנטי-ויראליים הניסיוניים, הם צריכים להיבדק בהרחבה לפני שהם נשלחים לניסויים קליניים בבני אדם של vivo. בהקשר זה, יש לזהות שליטה חיובית, שליטה שלילית וקבוצות בדיקה. Trifluorothymidine (TFT) שימש זמן רב כטיפול המועדף לטיפול הרפס קרטיטיס topically¹⁶. משמש כשליטה חיובית, קבוצו...

Discussion

מחקרים קודמים הראו BX795 יש תפקיד מבטיח כסוכן אנטי ויראלי נגד זיהום HSV-1; על ידי עיכוב קינאז מחייב טנק 1 (TBK1)¹⁶. הן TBK1 והן autophagy שיחקו תפקיד בסיוע לעכב זיהום HSV-1 כפי שהוכח על תאי אפיתל הקרנית האנושית. BX795 הוכח כיעיל ביותר עם פעילות אנטי ויראלית בריכוז של 10μM ושימוש הן ניתוח כתם מערבי וני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	-	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Special order by request
Procedure bench covers - as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586