猪角膜组织外植研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的功效

摘要

我们描述了使用猪角膜来测试实验药物的抗病毒功效。

摘要

病毒和细菌可通过角膜感染导致各种眼部表面缺陷和退化，如伤口和溃疡。由于血清超常范围为全球 60-90%，单纯疱疹病毒类型-1 （HSV-1） 通常会导致或非酸性区域的粘皮病变，这也表现为病变和感染相关失明。虽然目前的抗病毒药物是有效的，但耐药性和持久性毒副作用的出现需要开发针对这种无处不在的病原体的新型抗病毒药物。虽然体外评估提供了一些有关新兴抗病毒药物的功能数据，但它们并不显示体内眼组织具有复杂性。然而，在体内研究是昂贵的，需要训练有素的人员，尤其是当与病毒剂工作。因此，前体内模型是高效但廉价的抗病毒测试步骤。在这里，我们讨论一个协议，研究感染HSV-1使用猪角膜前体内和方法，以治疗他们使用现有的和新的抗病毒药物。我们还演示了使用 HSV-1 进行斑块检测的方法。详细的方法可用于进行类似的实验，以研究类似于HSV-1病原体的感染。

引言

患有眼部感染的人经常会出现视力丧失^1。由于全球血清高超常，HSV感染者患有复发性眼部感染，导致角膜疤痕、频闪角膜炎和新血管化^{2、3、4、5。}HSV感染也显示导致较少的频率，免疫功能低下，未经治疗的患者，如脑炎和系统性发病率^6，7，8的一系列严重情况。像Acyclovir（ACV）及其核苷类比这样的药物在抑制HSV-1感染甚至控制重新激活方面已经取得了一致的成功，然而这些药物的长期使用与肾衰竭、胎儿畸形和未能限制抗药性对进化的病毒株^{9、10、11、12、13}的产生有关。与HSV-1眼部感染相关的复杂性，以前曾使用人类角膜细胞的....

研究方案

这项研究中使用的所有猪组织都由第三方私人组织提供，伊利诺伊大学芝加哥分校的人员没有对动物进行处理。

1. 材料

1. 试剂
   1. 使用以下试剂进行普拉克检测：粉末甲基纤维素、杜尔贝科改良鹰的介质（DMEM）、胎儿牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（P/S）用于普拉克检测。
   2. 使用水晶紫罗兰片剂和乙醇（分子生物学等级）为斑块检测准备水晶紫罗兰溶液。
2. 维罗细胞生长介质 - DMEM 全媒体
   1. 打开组织培养罩内的 DMEM 介质瓶。使用血清移液器从瓶子中取出 55 mL 的介质并丢弃它。将 50 mL 的 P/S FBS 添加到 DMEM 中。在 4 °C 下冷藏。
3. 斑块检测介质 - 库存 5% 甲基纤维素介质
   1. 测量2.5克甲基纤维素粉末，在500毫升玻璃瓶内用搅拌磁铁将其高压灭菌。瓶子冷却到室温后，取500毫升含有50毫升FBS和5毫升P/S的DMEM全媒体，并将其添加到含有甲基纤维素的玻璃瓶中。
   2. 使用磁搅拌器在 4 °C 下搅拌 2 天。在 4 °C 下冷藏。
4. 切除猪角膜的媒体准备
   <....

结果

为了了解实验抗病毒药物的功效，在进行人体人体临床试验之前，需要对它们进行广泛的测试。在这方面，必须确定正控、阴性控制和测试组。三氟二甲胺（TFT）长期以来一直被用作治疗疱疹角膜^炎的首选治疗方法。作为阳性控制，TFT治疗的角膜组显示感染传播较低。作为负控制，我们使用 DMSO 或溶解在 PBS 中的车辆控制。BX795，实验性临床前药物是测试组。每组共分配了4个角?.......

讨论

先前的研究表明，BX795作为抗HSV-1感染的抗病毒药物具有很有前途的作用：通过抑制坦克绑定激酶1（TBK1）16。TBK1和自噬在帮助抑制HSV-1感染方面都起到了一定的作用，这表现在人类角膜上皮细胞上。BX795在浓度为10μM的抗病毒活性方面被证明是最大的有效，并且使用西方斑点分析和关键病毒蛋白的病毒斑块分析，BX795被证明可以抑制HSV-1感染，与TFT¹⁶的活动相当。?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	-	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL	0	Special order by request
Procedure bench covers - as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586