مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

Summary

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

Abstract

أكتين, المكون الرئيسي للهيكل الخلوي, يلعب دورا حاسما في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية ووظيفة. في ظل الدول الفسيولوجية، actin يحدث في التوازن في شكليها: كروي أحادي (G-أكتين) وخيوط بلمرة (F- أكتين). في المحطات متشابك, actin الهيكل الخلوي يشكل الأساس لوظائف حاسمة قبل وبعد متشابك. وعلاوة على ذلك، ترتبط التغيرات الديناميكية في حالة البلمرة أكتين (الانعكاس بين الأشكال الكروية والخيوط من أكتين) ارتباطا وثيقا التعديلات المتعلقة اللدونة في هيكل متشابك ووظيفة. نحن نبلغ هنا عن منهجية معدلة قائمة على الفلورسينس لتقييم حالة البلمرة من أكتين في ظروف الجسم الحي السابق. يستخدم المقايسة phalloidin المسمى فلوريا ، وهو فهولوتوكين يرتبط على وجه التحديد بخيوط أكتين (F-actin) ، مما يوفر مقياسا مباشرا للactin الخيطي البلمرة. كدليل على المبدأ ، نقدم أدلة على ملاءمة المقايسة في كل من القوارض وتجانس أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. باستخدام latrunculin A (دواء أن depolymerizes خيوط أكتين)، ونحن نؤكد فائدة من المقايسة في رصد التعديلات في مستويات F-actin. علاوة على ذلك، فإننا نوسع المقايسة إلى الكسور الكيميائية الحيوية من المحطات المتشابكة المعزولة حيث نؤكد زيادة البلمرة أكتين على التحفيز عن طريق إزالة الاستقطاب مع K خارج الخلية عالية⁺.

Introduction

وتشارك أكتين البروتين الهيكل الخلوي في وظائف الخلوية متعددة, بما في ذلك الدعم الهيكلي, النقل الخلوي, حركية الخلية والانقسام. Actin يحدث في توازن في شكلين: أكتين كروي أحادي (G-أكتين) والاكتين الخيطي البلمرة (F-actin). التغيرات السريعة في حالة البلمرة من أكتين (بين أشكال G- و F- يؤدي إلى تجميع خيوط سريعة وتفكيكها و تكمن وراء أدوارها التنظيمية في علم وظائف الأعضاء الخلوية. Actin يشكل العنصر الرئيسي للهيكل الخلوي العصبي ويؤثر على مجموعة واسعة من وظائف الخلايا العصبية^1,2. وتجدر الإشارة إلى أن الهيكل الخلوي actin يشكل جزءا لا يتجزأ من المنصة الهيكلية للمحطات متشابك. على هذا النحو، هو محدد رئيسي للمورفوجينيسيس متشابك وعلم وظائف الأعضاء ويلعب دورا أساسيا في السيطرة على حجم وعدد ومورفولوجيا نقاط الاشتباك العصبي^3،4،5. على وجه الخصوص ، فإن التكبر الديناميكي للبوليمرات - إزالة البوليمرات هو محدد رئيسي لإعادة عرض متشابك المرتبطة اللدونة متشابك الكامنة وراء الذاكرة وعمليات التعلم. في الواقع، كل من presynaptic (مثل إطلاق الناقل العصبي^{6،7،8،9،10)}وظائف postsynaptic (اللدونة ذات الصلة إعادة عرض^{ديناميكية 11،12،13،14)}تعتمد بشكل حاسم على التغيرات الديناميكية في حالة البلمرة من الهيكل الخلوي actin.

في ظل الظروف الفسيولوجية، يتم تنظيم مستويات F-actin بشكل ديناميكي وبإحكام من خلال مسار متعدد الوسائط يتضمن تعديل ما بعد النقل^4،15،16 وكذلك البروتينات الملزمة للactin (ABPs)^4،17. ABPs يمكن أن تؤثر على ديناميات أكتين على مستويات متعددة (مثل بدء أو تثبيط البلمرة، مما يؤدي إلى تفريع خيوط، وقطع خيوط إلى قطع أصغر، وتعزيز إزالة البلمرة، وحماية ضد إزالة البلمرة)، وبدورها تحت رقابة تحوير صارمة حساسة لمختلف الإشارات خارج وداخل الخلايا^18،19،20. مثل هذه الشيكات التنظيمية على مستويات متعددة تملي تنظيما صارما لديناميات أكتين في الهيكل الخلوي متشابك، صقل الجوانب قبل وما بعد متشابك من فسيولوجيا الخلايا العصبية على حد سواء في الدول القاعدية والنشاط الناجمة.

ونظرا للأدوار الهامة من أكتين في فسيولوجيا الخلايا العصبية, ليس من المستغرب أن العديد من الدراسات قدمت أدلة على التعديلات في ديناميات أكتين والأحداث المسببة للأمراض الحرجة المرتبطة مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية بما في ذلك التنكس العصبي, الأمراض النفسية وكذلك الأمراض العصبية النمائية^{3,21,22,23,24,25,26,27}. على الرغم من ثروة من البيانات البحثية التي تشير إلى الأدوار الرئيسية للactin في فسيولوجيا الخلايا العصبية والفيزيولوجيا المرضية، ومع ذلك، لا تزال هناك فجوات كبيرة في فهم ديناميات أكتين، لا سيما في الهيكل الخلوي متشابك. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات البحثية للحصول على فهم أفضل للactin العصبية وتعديلاتها في ظل الظروف المرضية. ومن مجالات التركيز الرئيسية في هذا السياق تقييم حالة البلمرة في أكتين. وهناك مجموعات تجارية غربية قائمة على النشاف (G-Actin/F-Actin في مجموعة البيوكيميائية المقايسة الحية؛ الهيكل الخلوي SKU BK037^28،29) والمقاايسات المصنوعة منزليا لتقييم مستويات F-actin⁶. ومع ذلك ، لأن هذه تتطلب العزل الكيميائي الحيوي من F -actin و G-actin ولأن القياس الكمي اللاحق يستند إلى بروتوكولات الانتفاخ المناعي ، فإنها يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. نحن هنا تقرير مطياف مضان القائم على المقايسة مقتبسة من دراسة سابقة³⁰ مع التعديلات التي يمكن استخدامها لتقييم كل من المستويات القاعدية من F-actin، فضلا عن التغيرات الديناميكية في تجميعها تفكيكها. وتجدر الإشارة إلى أننا قمنا بتعديل البروتوكول الأصلي بكفاءة يتطلب عينات مناسبة ل cuvette 1 مل إلى الشكل الحالي لوحة 96 جيدا. وبالتالي فإن البروتوكول المعدل قد قلل بشكل كبير من كمية الأنسجة /العينة المطلوبة للمقص. علاوة على ذلك، نقدم أدلة على أن البروتوكول مناسب ليس فقط لتجانسات أنسجة الدماغ، ولكن أيضا الكسور دون الخلوية مثل المحطات المتشابكة المعزولة (السنابتوسومات والسنابتونوروسومات). وأخيرا، يمكن استخدام المقايسة لأنسجة دماغ القوارض التي تم تشريحها حديثا وعينات الدماغ البشري المخزنة على المدى الطويل بعد الوفاة. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين يتم تقديم المقايسة في سياق الخلايا العصبية ، يمكن تمديدها بشكل مناسب إلى أنواع الخلايا الأخرى والعمليات الفسيولوجية المرتبطة بها.

Protocol

وقد نفذت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات في جامعة أوتاغو في رعاية واستخدام المختبر (البروتوكول الأخلاقي رقم 1000/1999). AUP95/18 و AUP80/17) والهيئة التشريعية في نيوزيلندا. تم الحصول على أنسجة الدماغ البشري من بنك الأنسجة العصبية في مستشفى كلينيك-IDIBAPS BioBank في برشلونة، إسبانيا. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى كلينيتش، برشلونة، على جميع بروتوكولات جمع الأنسجة، وحصلت الأسر على موافقة مستنيرة.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

1. إعداد المخازن المؤقتة التالية لتجانس أنسجة الدماغ وإعداد جزء المخصب من المحطات متشابك:
   العازلة التجانس: 5 MM HEPES، حمى الحموضة 7.4 تكملها مع السكروز 0.32 M
   احتياطي إعادة الإنفاق: 5 mM Tris, pH 7.4 مكمل ب 0.32 M سكروز
   العازلة الغسيل: 5 متر تريس، رقم الحموضة 8.1
   1.2 م السكروز
   1.0 م السكروز
   0.85 م السكروز
2. إضافة مزيج محلية الصنع أو تجارية من مثبطات البروتيز والفوسفاتاز.
   ملاحظة: لقد استخدمنا نسخة خالية من EDTA من مزيج مثبطات Protease الكامل (قرص واحد لكل 10 مل عازل) وكوكتيل مثبط فوسفاتاز IV (1:100؛ الحجم: الحجم).
3. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف التالية لتثبيت و permeabilization و الربط phalloidin:
   كريبس العازلة: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0.1 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃, 10 mM الجلوكوز, 20 mM HEPES, pH 7.4
   1 م كلكل
   25٪ غلوتارارالدهيد (حل المخزون)
   كريبس العازلة التي تحتوي على 0.1 ٪ تريتون X - 100 و 1 ملغ / مل NaBH₄
   400x اليكسا فلور 647 فالويدين في DMSO
   كريبس العازلة التي تحتوي على 0.32 M السكروز
   50 ميكرومتر لاتورونكولين A في DMSO (حل المخزون)
   1 M KCl (حل المخزون)
   تنبيه: فالويدين سام (LD₅₀ = 2 ملغم/كغ) ويجب التعامل معه بعناية. استنشاق الجلوتارارالدهيد سام ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.
4. تخزين المخازن المؤقتة في 4 درجة مئوية وphalloidin وlatrunculin A في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: لا ينصح تخزين المخازن المؤقتة على المدى الطويل. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. تجانس أنسجة الدماغ

1. تجانس أنسجة دماغ الفئران المبردة أو التي تم تشريحها حديثا في 10 مجلدات من عازل التجانس في أنبوب زجاجيبوتر- إلفيهم والحشرات على الجليد.
   ملاحظة: يتم تحقيق التجانس الأمثل عن طريق 15-20 السكتات الدماغية من الحشرات باليد لأنسجة الدماغ. يمكن تأكيد التجانس الناجح من خلال التدفق السلس للتعليق من خلال الأنبوب الزجاجي. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. تحديد تركيز البروتين في المتجانسة باستخدام برادفورد المقايسة³¹.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المقايسات محلية الصنع أو التجارية البديلة لتقدير البروتين.
3. تمييع عينات متجانسة في العازلة كريبس بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر.
   ملاحظة: في بعض تجاربنا، نحتضن متجانسات مع 2 ميكرومتر لاتورونكولين A أو DMSO (عناصر التحكم) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لهذا، يتم إعادة إنفاق التجانسات في 48 ميكرولتر من العازلة كريبس، ويتم إضافة 2 ميكرولتر من 50 ميكرومتر لاتورونكولين A أو 2 ميكرولتر من DMSO. كذلك بالنسبة للمناعة ، يتم جمع كمية صغيرة من العينة (10 ميكروغرام) بعد الحضانة.
4. إصلاح عينات متجانسة (المقطع 5).

3. إعداد محطات الأعصاب المعزولة

1. إعداد السنابتوسومات
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البروتوكولات البديلة^32،33 للسينابتوسومات.
   1. تجانس دماغ الطرد المركزي عند 1200 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   2. تجاهل بيليه، وهو كسر النووية الخام.
   3. مزيد من الطرد المركزي الفائق (S1) التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.1 في 12000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
   4. إزالة supernatant (S2) ، وهو كسر السيتوسوليك القابلة للذوبان.
   5. إعادة إنفاق بيليه (P2) التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.3، وهو كسر السيبتوسوم الخام في احتياطي إعادة الإنفاق.
      ملاحظة: يعتمد حجم احتياطي إعادة الإنفاق على كمية الأنسجة التي تبدأ وكمية الكريات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، عند البدء مع 150-300 ملغ من أنسجة الدماغ، يمكن إعادة إنفاق بيليه التي تم الحصول عليها في 200 ميكرولتر من العازلة إعادة الإنفاق.
   6. تحميل synaptosomes الخام إعادة الإنفاق على تدرج السكروز متقطعة مصنوعة من أحجام متساوية من 0.85-1.0-1.2 M السكروز.
      ملاحظة: نحن عادة ما تستخدم 1 مل كل من محلول السكروز (ل150-300 ملغ الأنسجة). ويمكن تغيير هذا وفقا لكميات أكبر من الأنسجة. يمكن إجراء تدرجات متقطعة باستخدام حقنة 25G مضغوطة على الجدار الداخلي للأنبوب الطرد الفائق والطبقات اللطيفة من طبقات السكروز.
   7. جهاز طرد مركزي عند 85,000 x g لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بسبب السرعة العالية للطرد المركزي، هناك حاجة إلى جهاز طرد مركزي فائق قادر على خلق فراغ للحد من التدفئة.
   8. جمع كسر synaptosomal في واجهة بين 1.0 و 1.2 M السكروز باستخدام تلميح ماصة 200 ميكرولتر.
   9. اغسل الكسر السينابتوسومي بحاجز الغسيل البارد بالثلج عن طريق الطرد المركزي عند 18000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: للغسيل، يتم جمع كسر السينابوسومات التي تم الحصول عليها في واجهة 1.0 و 1.2 M السكروز في أنبوب 1.5 مل الطازجة، ويتم إضافة حجم متساو من العازلة الغسيل، وضمان إزالة السكروز عالية من المتوسط.
   10. غسل بيليه synaptosomal مرة أخرى مع الجليد الباردة تجانس العازلة في 12،000 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
   11. إعادة إنفاق السنابتوسومات في عازل التجانس على الجليد.
       ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.
   12. تحديد تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد.
   13. إعادة إنفاق السنابتوسومات في العازلة كريبس بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر (47.5 ميكرولتر إذا كان synaptosomes هي أن تكون إزالة الاستقطاب من قبل KCl; انظر القسم 4).
       ملاحظة: لإعادة الإنفاق، يتم نسج الكسر السينابتوسومي أولا عند 12,000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ويتم إزالة الناموست الفائق (العازل). ثم يتم إعادة إنفاق بيليه synaptosomal في العازلة كريبس عن طريق pipetting لطيف باستخدام تلميح أنبوب 200 ميكرولتر.
   14. 10 - المضي قدما في إزالة الاستقطاب (الباب 4).
2. إعداد السينابتونوسومات
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البروتوكولات البديلة^34،35 للسينابتونوروسومات.
   1. تمرير الدماغ المتجانسة من خلال مرشح صافي مبللة مسبقا من حجم المسام 100 ميكرومتر في حامل مرشح باستخدام حقنة 1 مل.
      ملاحظة: قبل التبول من كافة عوامل التصفية المهم لتجنب فقدان العينة وينبغي القيام به باستخدام المخزن المؤقت التجانس. لهذا، يتم تمرير المخزن المؤقت التجانس من خلال المرشحات في حامل التصفية باستخدام حقنة 1 مل حتى تدفق المخزن المؤقت.
   2. جمع filtrate (F1) في أنبوب 1.5 مل المبردة مسبقا على الجليد.
   3. كرر العملية (الخطوتين 3.2.1 و 3.2.2) للكسر F1 للحصول على الشعيرات الثانية (F2).
   4. تمرير F2 filtrate من خلال مرشح صافي من حجم المسام 5 ميكرومتر.
   5. جمع filtrate (F3) في أنبوب 1.5 مل المبردة مسبقا على الجليد.
   6. جهاز الطرد المركزي filtrate F3 في 1500 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
   7. Resuspend بيليه (synaptoneurosomes) في كريبس العازلة على الجليد بتركيز 2-3 ملغ البروتين / مل في حجم 50 ميكرولتر (47.5 ميكرولتر إذا كان synaptosomes هي أن تكون إزالة القطب من قبل KCl؛ انظر القسم 4).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.
   8. تقدير تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد.
   9. 10 - المضي قدما في إزالة الاستقطاب (الباب 4).

4. KCl بوساطة إزالة الاستقطاب من المحطات متشابك معزولة

1. السنابتوسومات/السينابتونوسومات متساوية المستويات عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
2. تحفيز synaptosomes / synaptoneurosomes بإضافة KCl لزيادة K خارج الخلية⁺ إلى 50 mM لمدة 30 ثانية في 37 درجة مئوية وإضافة حجم متساو من العازلة كريبس إلى مجموعة التحكم غير المحفزة المعنية.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 2.5 ميكرولتر من 1 M KCl إلى synaptosomes resuspended في 47.5 ميكرولتر من العازلة كريبس; وإضافة 2.5 ميكرولتر من العازلة كريبس إلى كل منهما غير المحفزة التحكم synaptosome. بالنسبة للتجارب التي يتضمنها عدد كبير من العينات، قم بإجراء ما لا يزيد عن عينتين في كل مرة بحيث لا يتجاوز وقت إزالة الاستقطاب 30 ثانية.
3. إنهاء التحفيز بإضافة الغلوتارارالدهيدي (القسم 5).

5. تثبيت وphalloidin تلطيخ العينات

1. إضافة الجلوتارالدهيد إلى عينات متجانسة / synaptosomal / synaptoneurosomal إلى تركيز نهائي من 2.5٪ لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: أضفنا 6 ميكرولتر من محلول الغلوتارالدهيد بنسبة 25٪ بحيث كان التركيز النهائي للجلوتارانديهيد في عينات 50 ميكرولتر (متجانسات / سينابتوسومات / synaptoneurosomes) هو 2.5٪. التثبيت أمر بالغ الأهمية ، وينبغي أن يكون سريعا ، وبالتالي مباشرة بعد إضافة الجلوتارالدهيد ، يجب أن تكون العينة دوامة بقوة.
2. ترسيب العينات في 20،000 × غرام لمدة 5 دقائق.
3. أزل الناتنات الفائق.
   ملاحظة: تجاهل supernatant في غطاء محرك السيارة الدخان كما glutaraldehyde سامة.
4. Permeabilize بيليه عن طريق إعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر من العازلة كريبس تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 1 ملغ / مل NaHB₄ لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. ترسيب العينات في 20،000 × غرام لمدة 5 دقائق.
6. إزالة المخزن المؤقت permeabilization.
7. غسل بيليه مع 200 ميكرولتر من العازلة كريبس عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق.
8. Resuspend وصمة عار بيليه مع 1x اليكسا فلور 647 Phalloidin (المقابلة ل500 ميكرون) في 100 ميكرولتر من العازلة كريبس لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: أنواع أخرى من النظير phalloidin الفلورسنت متاحة تجاريا ويمكن استبدالها للمقاايسة. قد يكون تركيز phalloidin وحجم العينة الكلية من الحضانة إلى تعديل وفقا لكمية ونوع الأنسجة / عينة يجري اختبارها وينبغي توحيد الظروف المثلى وفقا لذلك.
9. الطرد المركزي عينات ملطخة في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق.
10. إزالة phalloidin غير منضم (فائقة).
11. اغسل العينة ب 200 ميكرولتر من عازل كريبس عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × غرام لمدة 5 دقائق.
12. Resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة كريبس التي تحتوي على 0.32 M السكروز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لفترة وجيزة.

6. تحليل الفلورومترية وتشتت الضوء

1. الاستغناء عن اليكسا فلور 647 عينات ملطخة Phalloidin في لوحة سوداء 96 جيدا.
2. قياس كثافة الفلورسينس في الطول الموجي للإثارة من 645 نانومتر وطول موجي انبعاث 670 نانومتر في قارئ لوحة في درجة حرارة الغرفة.
3. نقل العينات من لوحة 96-جيدا الأسود إلى لوحة شفافة 96 جيدا باستخدام نصائح 200 ميكرولتر pipet.
4. قياس تشتت الضوء عند 540 نانومتر لتصحيح أي خسائر قد تكون حدثت خلال الخطوات السابقة من التثبيت والبيرمابيلينج والتلوين.
   ملاحظة: قد تكون الاختلافات في المواد البيولوجية المحتفظ بها في العينات الملطخة أكثر بروزا بالنسبة لكميات أصغر من مواد البدء (انظر المناقشة).
5. وتشمل مجموعة من اليكسا فلور 647 Phalloidin في كريبس العازلة بتركيزات مختلفة (0.05x، 0.1x و0.25x و0.35x و0.75x و0.5x و1x المقابلة ل25 و 50 و 125 و 175 و 250 و 375 و 500 وحدة ميكرونيون) لكل دفعة من المقايسة كمنحنى قياسي.
   ملاحظة: هذه خطوة اختيارية ولا يؤثر على نتائج الفحص خاصة عند التعبير عن مستويات F-actin بطريقة نسبية (القسم 7). يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

7. تحليل البيانات

1. كمية F-actin في العينات يتناسب مباشرة مع كثافة الفلورية من phalloidin ملزمة. التعبير بالقيمة المطلقة لوحدات phalloidin منضم محسوبة من منحنى خطي من معيار phalloidin الموسومة.
   ملاحظة: كمثال، راجع الأرقام 2A-B، 3A، 4A-B والشكل التكميلي 2.
2. التعبير عن مستويات F-actin كسر من عينات التحكم.
   ملاحظة: كمثال، راجع الشكل 5A-B.

النتائج

خطية المقايسة لتقييم مستويات F-actin
أولا، تم التأكد من منحنى قياسي للزيادة الخطية في الفلور من اليكسا فلور 647 Phalloidin وتكررت لكل مجموعة من التجارب(الشكل 1). للتحقيق في النطاق الخطي للمقاسة ، تم معالجة كميات مختلفة من تجانسات الدماغ من القوارض(الشكلان 2A و

Discussion

المقايسة الموصوفة هنا ، مقتبسة أساسا من دراسة سابقة³⁰ مع تعديلات ، ويستخدم phallotoxin ، phalloidin الموسومة مع تسمية الفلورسنت. تعتبر النظير phalloidin الفلورسنت لتكون المعيار الذهبي لتلطيخ خيوط أكتين في الأنسجة الثابتة^47,48,49. في الواقع، فه...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation