Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

Резюме

Мы сообщаем о простом, эффективном по времени и высокопроизводительном флуоресцентном спектроскопии анализе для количественной оценки актиновых нитей в биологических образцах ex vivo из тканей мозга грызунов и людей.

Аннотация

Актин, основной компонент цитоскелета, играет решающую роль в поддержании структуры и функции нейронов. При физиологических состояниях актин возникает в равновесии в двух его формах: мономерной глобулярной (G-актин) и полимеризованной нитевидной (F-актин). На синаптических терминалях актиновый цитоскелет образует основу для критических пре- и постсинаптических функций. Кроме того, динамические изменения в статусе полимеризации актина (взаимопревращение между глобулярной и нитевидной формами актина) тесно связаны с пластичными изменениями в синаптической структуре и функции. Здесь мы сообщаем о модифицированной методологии на основе флуоресценции для оценки статуса полимеризации актина в условиях ex vivo. В анализе используется флуоресцентно меченый фаллоидин, фаллотоксин, который специфически связывается с актиновыми нитями (F-актин), обеспечивая прямую меру полимеризованного нитевидного актина. В качестве принципиального доказательства мы предоставляем доказательства пригодности анализа как у грызунов, так и у гомогенатов ткани мозга человека. Используя латрункулин А (препарат, который деполимеризует актиновые нити), мы подтверждаем полезность анализа для мониторинга изменений уровня F-актина. Далее мы распространяем анализ на биохимические фракции изолированных синаптических терминалей, в которых мы подтверждаем повышенную полимеризацию актина при стимуляции деполяризацией с высоким внеклеточным^K+.

Введение

Актин цитоскелетного белка участвует в нескольких клеточных функциях, включая структурную поддержку, клеточный транспорт, подвижность и деление клеток. Актин встречается в равновесии в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-актин) и полимеризованный нитевидный актин (F-актин). Быстрые изменения в статусе полимеризации актина (взаимоконверсия между его G- и F-формами) приводят к быстрой сборке и разборке нитей и лежат в основе его регуляторных ролей в клеточной физиологии. Актин образует основной компонент нейрональной цитоскелетной структуры и влияет на широкий спектр нейронных функций^1,2. Следует отмети....

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с регламентом Комитета по этике в уходе за лабораторными животными и их использовании Университетом Отаго (Ethics Protocol No. AUP95/18 и AUP80/17) и законодательный орган Новой Зеландии. Ткани головного мозга человека были получены из Банка неврологических тканей больницы Clínic-IDIBAPS BioBank в Барселоне, Испания. Все протоколы сбора тканей были одобрены Комитетом по этике больницы Клиник, Барселона, и было получено информированное согласие от семей.

1. Подготовка буферов и реагентов

1. Подготовьте следующие буферы для гомогенизации мозговой ткани и получения обогащенной ф....

Результаты

Линейность анализа для оценки уровней F-актина
Сначала была установлена стандартная кривая линейного увеличения флуоресценции фаллоидина Alexa Fluor 647, которая повторялась для каждой области экспериментов(рисунок 1). Для исследования линейного диапазона анализ?.......

Обсуждение

Анализ, описанный здесь, по существу адаптированный из предыдущего исследования³⁰ с модификациями, использует фаллотоксин, фаллоидин, помеченный флуоресцентной меткой. Флуоресцентные аналоги фаллоидина считаются золотым стандартом окрашивания актиновых нитей в фиксиро?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation