JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Özet

Sitoskeletonun ana bileşeni olan Actin, nöronal yapı ve fonksiyonun korunmasında kritik bir rol oynar. Fizyolojik durumlar altında, aktin dengede iki şekilde meydana gelir: monomerik globüler (G-actin) ve polimerize filamentli (F- aktin). Sinaptik terminallerde, aktin sitoskeleton kritik pre-ve post-sinaptik fonksiyonların temelini oluşturur. Ayrıca, aktiin polimerizasyon durumundaki dinamik değişiklikler (globüler ve filamentli aktiin formları arasındaki interkonversiyon) sinaptik yapı ve işlevdeki plastisite ile ilgili değişikliklerle yakından bağlantılıdır. Burada, ex vivo koşullarda akinin polimerizasyon durumunu değerlendirmek için modifiye edilmiş floresan bazlı bir metodoloji rapor ediyoruz. Tahlil, özellikle aktüen filamentlere (F-actin) bağlanan ve polimerize filamentli aktinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayan bir phallotoxin olan floresan etiketli phalloidin'i kullanmaktadır. İlke kanıtı olarak, tahlillerin hem kemirgen hem de ölüm sonrası insan beyin dokusu homojenliklerinde uygunluğuna dair kanıt sunuyoruz. Latrunculin A (actin filamentlerini depolymerize eden bir ilaç) kullanarak, F-actin seviyelerindeki değişiklikleri izlemede tahlilin yararını onaylıyoruz. Ayrıca, tahlilleri izole sinaptik terminallerin biyokimyasal fraksiyonlarına genişletiyoruz, burada yüksek hücre dışı K+ile depolarizasyon ile uyarılma üzerine artan aktin polimerizasyonunu onaylıyoruz.

Giriş

Sitoskeletal protein aktin, yapısal destek, hücresel taşıma, hücre hareketliliği ve bölünme dahil olmak üzere birden fazla hücresel işlevde yer alır. Aktin dengede iki şekilde ortaya çıkar: monomerik globüler aktin (G-actin) ve polimerize filamentli aktin (F-actin). Akinin polimerizasyon durumundaki hızlı değişiklikler (G ve F formları arasındaki interkonversiyon) hızlı filament montajına ve sökülmesine neden olur ve hücresel fizyolojideki düzenleyici rollerinin altında yatmaktadır. Actin nöronal sitoskeletal yapının ana bileşenini oluşturur ve çok çeşitli nöronal fonksiyonları etkiler1,2. Not olarak, aktin sitoskeleton sinaptik terminallerin yapısal platformunun ayrılmaz bir parçasını oluşturur. Bu nedenle, sinaptik morfogenez ve fizyolojinin önemli bir belirleyicisidir ve sinapsların boyutunun, sayısının ve morfolojisinin kontrolünde temel bir rol oynar3,4,5. Özellikle, dinamik aksin polimerizasyon-depolimerizasyon, hafıza ve öğrenme süreçlerinin altında sinaptik plastisite ile ilişkili sinaptik yeniden şekillendirmenin önemli bir belirleyicisidir. Gerçekten de, hem presynaptik (nörotransmittersalınımı 6,7,8,9,10gibi) hem de postsinaptik fonksiyonlar (plastisite ile ilgili dinamik yeniden şekillendirme11,12,13,14)kritik olarak aktin sitoskeletonunun polimerizasyon durumundaki dinamik değişikliklere dayanır.

Fizyolojik koşullar altında, F-actin seviyeleri, posttranslational modifikasyon 4 ,15 , 16ve aksin bağlayıcı proteinler (ABP' ler)4,17 içeren multimodal bir yol ile dinamik ve sıkı bir şekilde düzenlenir. ABP'ler birden fazla düzeyde (polimerizasyonun başlatılması veya inhibe edilmesi, filament dallanmasının teşvik edilmesi, filamentlerin daha küçük parçalara kesilmesi, depolimerizasyonun teşvik edilmesi ve depolimerizasyona karşı koruma gibi) aksin dinamiklerini etkileyebilir ve sırayla çeşitli hücre dışı ve hücre içi sinyallere duyarlı sıkı bir modüler kontrol altındadır18, 19,20. Birden fazla düzeydeki bu tür düzenleyici kontroller, sinaptik sitoskeletondaki aktin dinamiklerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini, nöronal fizyolojinin hem bazal hem de aktivite kaynaklı durumlarda ince ayarlı ön ve postynaptik yönlerini belirler.

Aktinin nöronal fizyolojideki önemli rolleri göz önüne alındığında, çeşitli çalışmaların nörodejenerasyon, psikolojik hastalıklar ve nörogelişimsel rahatsızlıklar 3 , 21 , 22 ,23,24,25 , 26,27 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozukluklarla bağlantılı kritik patojenik olaylar olarak aksin dinamiklerindeki değişiklikler için kanıt sağlaması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aktin'in kilit rollerine işaret eden araştırma verilerinin zenginliğine rağmen, özellikle sinaptik sitoskeletonda aktin dinamikleri anlayışında hala önemli boşluklar devam etmektedir. Nöronal akinin ve patolojik koşullar altındaki değişimlerinin daha iyi anlaşılması için daha fazla araştırma çalışmasına ihtiyaç vardır. Bu bağlamda ana odak alanlarından biri aksin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesidir. Batı blotting tabanlı ticari kitler vardır (G-Actin/F-Actin in vivo tahlil biyokimyasal kiti; Cytoskeleton SKU BK03728,29) ve F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için ev yapımı tahliller6. Bununla birlikte, bunlar F-actin ve G-actin'in biyokimyasal izolasyonu gerektirdiğinden ve sonraki nicelemeleri immünblotting protokollerine dayandığından, zaman alıcı olabilirler. Burada, önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil, hem F-actin bazal seviyelerini hem de montaj sökümsünü dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilecek değişikliklerle rapor ediyoruz. Özellikle, 1 mL cuvette için uygun numuneleri mevcut 96 kuyu plakası formatına uygun numuneler gerektiren orijinal protokolü verimli bir şekilde değiştirdik. Bu nedenle modifiye edilen protokol, test için gerekli olan doku/numune miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Ayrıca, protokolün sadece beyin dokusu homojenatları için değil, aynı zamanda izole sinaptik terminaller (sinaptozomlar ve sinaptoneurozomlar) gibi hücre altı fraksiyonlar için de uygun olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Son olarak, test taze parçalanmış kemirgen beyin dokuları ve uzun süreli saklanan ölüm sonrası insan beyin örnekleri için kullanılabilir. Not olarak, test nöronal bağlamda sunulurken, onlarla ilişkili diğer hücre tiplerine ve fizyolojik süreçlere uygun şekilde genişletilebilir.

Protokol

Tüm deneysel işlemler Otago Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Etik Kurulu'nun yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Etik Protokol No. AUP95/18 ve AUP80/17) ve Yeni Zelanda yasama organı. İnsan beyin dokuları, İspanya'nın Barselona kentindeki Clínic-IDIBAPS BioBank Hastanesi Nörolojik Doku Bankası'ndan elde edildi. Tüm doku toplama protokolleri Barselona'daki Clínic Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve ailelerden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Beyin dokusunun homojenizasyonu ve sinaptik terminallerin zenginleştirilmiş fraksiyonunun hazırlanması için aşağıdaki tamponları hazırlayın:
    Homojenizasyon tamponu: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M sakkaroz ile desteklenmiş
    Resüspenzyon tamponu: 5 mM Tris, 0,32 M sakkaroz ile desteklenmiş pH 7,4
    Yıkama tamponu: 5 mM Tris, pH 8.1
    1.2 M sakaroz
    1.0 M sakaroz
    0.85 M sakaroz
  2. Proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin ev yapımı veya ticari karışımını ekleyin.
    NOT: Komple Proteaz inhibitör karışımının (10 mL tampon başına 1 tablet) ve Fosfataz inhibitörü kokteyl IV'ün (1:100; hacim: hacim) EDTA içermeyen sürümünü kullandık.
  3. Phalloidinin sabitlenmesi, permeabilizasyonu ve bağlanması için aşağıdaki tamponları ve reaktifleri hazırlayın:
    Krebs tampon: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7.4
    1 M KCl
    %25 glutaraldehit (stok çözeltisi)
    % 0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaBH4 içeren Krebs tamponu
    DMSO'da 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin
    0.32 M sakkaroz içeren Krebs tamponu
    DMSO'da 50 μM latrunculin A (stok çözümü)
    1 M KCl (stok çözümü)
    DİkKAT: Phalloidin toksiktir (LD50 = 2 mg/kg) ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Glutaraldehitin solunması toksiktir ve bir duman kaputunda ele alınmalıdır.
  4. Tamponları 4 °C'de, phalloidin ve latrunculin A'yı ise -20 °C'de uzun süreli depolama için saklayın.
    NOT: Arabelleklerin uzun süreli depolanmasının önerilmez. Protokol burada duraklatılabilir.

2. Beyin dokusu homojenizasyonu

  1. Bir Potter-Elvehjem cam tüpünde ve buzda pestle içinde 10 cilt homojenizasyon tamponunda kriyoprezer korunmuş veya taze parçalanmış sıçan beyin dokusunu homojenize edin.
    NOT: Optimal homojenizasyon, beyin dokuları için elle 15-20 inme ile elde edilir. Başarılı homojenizasyon, süspansiyonun cam tüpten sorunsuz akışı ile doğrulanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
  2. Bradford tahlil31kullanarak homojenattaki protein konsantrasyonu belirleniyor.
    NOT: Protein tahmini için alternatif ev yapımı veya ticari tahliller de kullanılabilir.
  3. Krebs tamponunda homojenat örnekleri 50 μL hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda seyreltin.
    NOT: Bazı deneylerimizde, homojenleri 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A veya DMSO (kontroller) ile kuluçkaya yatırıyoruz. Bunun için homojenatlar 48 μL Krebs tamponunda yeniden sulanır ve 50 μM latrunculin A veya 2 μL DMSO'nun 2 μL'si eklenir. İmmünblotting için ayrıca, inkübasyondan sonra az miktarda örnek (10 μg) toplanır.
  4. Homojen örnekleri düzeltin (bölüm 5).

3. İzole sinir terminallerinin hazırlanması

  1. Sinaptozomların hazırlanması
    NOT: Sinaptozomlar için alternatif protokoller32,33 de kullanılabilir.
    1. Santrifüj beyin 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da homojendir.
    2. Ham nükleer fraksiyon olan peleni atın.
    3. 3.1.1 adımda elde edilen süpernatantı (S1) 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca daha fazla santrifüj edin.
    4. Çözünür sitozolitik fraksiyon olan süpernatantı (S2) çıkarın.
    5. Resüspensyon tamponunda ham sinaptozomal fraksiyon olan 3.1.3 adımında elde edilen peletin (P2) yeniden dürttü.
      NOT: Resüspenzyon tamponunun hacmi başlangıç dokusunun miktarına ve elde edilen pelet miktarına bağlıdır. Örneğin, 150-300 mg beyin dokusu ile başlarken, elde edilen pelet 200 μL resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılabilir.
    6. Yeniden canlanan ham sinaptozomları 0,85-1,0-1,2 M sakkaroz eşit hacimlerde yapılmış süreksiz bir sakkaroz gradyanı üzerine yükleyin.
      NOT: Tipik olarak sakkaroz çözeltisinin her biri için 1 mL kullanırız (150-300 mg doku için). Bu daha büyük doku miktarlarına göre değiştirilebilir. Süreksiz gradyanlar, ultracentrifuge tüpünün iç duvarına bastırılmış 25G şırıng ve sakkaroz katmanlarının yumuşak katmanları kullanılarak yapılabilir.
    7. 4 °C'de 2 saat için 85.000 x g'da santrifüj.
      NOT: Santrifüjlemenin yüksek hızı nedeniyle, ısıtmayı azaltmak için vakum oluşturabilen bir ultra merkezigül gereklidir.
    8. 200 μL pipet ucu kullanarak 1.0 ile 1.2 M sakkaroz arasındaki arayüzde sinaptozmal fraksiyonu toplayın.
    9. Sinaptozomal fraksiyonu 18.000 x g'da santrifüjleme ile buz gibi yıkama tamponu ile 4 °C'de 10 dakika yıkayın.
      NOT: Yıkama için, 1.0 ve 1.2 M sakkaroz arayüzünde elde edilen sinaptozmal fraksiyon taze bir 1.5 mL tüpte toplanır ve yüksek sakkarozun ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan eşit hacimde bir yıkama tamponu eklenir.
    10. Sinaptozomal peletı 12.000 g'da buz gibi homojenizasyon tamponu ile 4 °C'de 10 dakika tekrar yıkayın.
    11. Sinaptozomları buzdaki homojenizasyon tamponunda yeniden dirsintir.
      NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
    12. Bradford tahlilini kullanarak protein konsantrasyonu belirlen.
    13. Krebs tamponundaki sinaptozomları 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
      NOT: Resüspensiyon için, sinaptozomal fraksiyon ilk olarak 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürülür ve üst düğme (tampon) çıkarılır. Sinaptozomal pelet daha sonra 200 μL pipet ucu kullanılarak hafif pipetleme ile Krebs tamponunda yeniden sınıflandırılmıştır.
    14. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).
  2. Sinaptonürozomların hazırlanması
    NOT: Sinaptoneurozomlar için alternatif protokoller34,35 de kullanılabilir.
    1. Beyni homojenatı, 1 mL şırıngan kullanarak bir filtre tutucusunda 100 μm gözenek boyutunda önceden ıslanmış bir ağ filtresinden geçirin.
      NOT: Numune kaybını önlemek için tüm filtrelerin önceden ıslatılması önemlidir ve homojenizasyon tamponu kullanılarak yapılmalıdır. Bunun için homojenizasyon tamponu, tampon dışarı akana kadar filtre tutucusunda bulunan filtrelerden 1 mL şırıng kullanılarak geçirilir.
    2. Filtratı (F1) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
    3. İkinci filtrat (F2) elde etmek için F1 kesir için işlemi (adım 3.2.1 ve 3.2.2) tekrarlayın.
    4. F2 filtratı 5 μm gözenek boyutunda bir ağ filtresinden geçirin.
    5. Filtratı (F3) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte toplayın.
    6. Santrifüj filtrat F3 1,500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca.
    7. Krebs tamponundaki peleti (sinaptoneurozomlar) 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda buz üzerinde yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
      NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
    8. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu tahmin edin.
    9. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).

4. İzole sinaptik terminallerin KCl aracılı depolarizasyonu

  1. 5-10 dakika boyunca 37 °C'de eşkenel lipatokomlar/sinaptoneurozomlar.
  2. Hücre dışı K+ 'yı 37 °C'de 30 sn için 50 mM'ye çıkarmak ve ilgili uyarılmamış kontrol kümesine eşit hacimde Krebs tamponu eklemek için KCl ekleyerek sinaptozomları /sinaptoneurozomları uyarın.
    NOT: Örneğin, 47,5 μL Krebs arabelleğine yeniden harcanan sinaptozomlara 2,5 μL 1 M KCl ekleyin; ve ilgili uyarılmamış kontrol sinaptozomlarına 2,5 μL Krebs tamponu ekleyin. Çok sayıda örneğin yer aldığı deneyler için, depolarizasyon süresinin 30 s'yi geçmemesi için aynı anda en fazla 2 örnekle devam edin.
  3. Glutaraldehit ekleyerek stimülasyonu sonlandırın (bölüm 5).

5. Örneklerin fiksasyonu ve phalloidin lekelenmesi

  1. Homojenat/sinaptozomal/sinaptoneurosomal örneklere glutaraldehit ekleyin, oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca% 2,5'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: 50 μL numunede (homojenatlar/sinaptozomlar/sinaptoneurozomlar) glutaraldehitin son konsantrasyonunun %2,5 olması için 6 μL%25 glutaraldehit çözeltisi ekledik. Fiksasyon kritiktir ve hızlı olmalı ve bu nedenle glutaraldehit ekledikten hemen sonra, örnek güçlü bir şekilde girdaplanmalıdır.
  2. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
  3. Üsttekini çıkarın.
    NOT: Glutaraldehit toksik olduğu için süpernatantı duman kaputuna atın.
  4. Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaHB4 içeren 100 μL Krebs tamponunda resüspenzyon ile peleti dengele.
  5. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
  6. Geçirgenleştirme arabelleği kaldırılın.
  7. Peletin 200 μL Krebs tamponu ile 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.
  8. Peletin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 100 μL Krebs tamponunda 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (500 μU'ya karşılık gelir) ile yeniden depolayın ve lekeleyin.
    NOT: Floresan phalloidin analoglarının diğer çeşitleri ticari olarak mevcuttur ve test için değiştirilebilir. Phalloidin konsantrasyonu ve toplam inkübasyon örnek hacmi, test edilen doku/numune miktarına ve türüne göre değiştirilmek ve buna göre optimal koşullar standartlaştırılmalıdır.
  9. Lekeli numuneleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.
  10. İlişkisiz phalloidin 'i (süpernatant) çıkarın.
  11. Numuneyi 200 μL Krebs tamponu ile 20.000 x g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın.
  12. 0,32 M sakkaroz içeren 200 μL Krebs tamponunda yeniden diriltme.
    NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.

6. Florometrik analiz ve ışık saçılım

  1. Alexa Fluor 647 Phalloidin lekeli örnekleri siyah 96 kuyu plakasında dağıtin.
  2. Floresan yoğunluğunu 645 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve oda sıcaklığında bir plaka okuyucuda 670 nm emisyon dalga boyunda ölçün.
  3. 200 μL pipet uçları kullanarak numuneleri siyah 96 kuyu plakasından şeffaf 96 kuyu plakasına aktarın.
  4. Önceki sabitleme, permeabilizasyon ve boyama adımları sırasında meydana gelmiş olabilecek kayıpları düzeltmek için ışığın saçılmasını 540 nm olarak ölçün.
    NOT: Lekeli numunelerde tutulan biyolojik malzemedeki varyasyonlar, daha az miktarda başlangıç malzemesi için daha belirgin olabilir (bkz. Tartışma).
  5. Krebs tamponuna farklı konsantrasyonlarda bir dizi Alexa Fluor 647 Phalloidin ekleyin (0.05x, Standart eğri olarak testlerin her bir partisi için 25, 50, 125, 175, 250, 375 ve 500 μU'ya karşılık gelen 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x ve 1x.
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve özellikle F-actin düzeyleri göreceli olarak ifade edilirken tahlil sonuçlarını etkilemez (Bölüm 7). Protokol burada duraklatılabilir.

7. Veri analizi

  1. Numunelerdeki F-aktinin miktarı, bağlı phalloidin floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Etiketli phalloidin standardının doğrusal eğrisinden hesaplanan phalloidin bağlı birimlerinin mutlak cinsinden ifade.
    NOT: Örnek olarak, bkz.
  2. Kontrol örneklerinin bir kısmı olarak F-actin seviyelerini ifade edin.
    NOT: Örnek olarak, bkz.

Sonuçlar

F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için test doğrusallığı
İlk olarak, Alexa Fluor 647 Phalloidin floresanında doğrusal artış için standart bir eğri tespit edildi ve her deney seti için tekrarlandı (Şekil 1). Tahlilin doğrusal aralığını araştırmak için kemirgenlerden (Şekil 2A ve 2B)ve ölüm sonrası insan deneklerden(Şekil 3A ve 3B)farklı miktarlarda beyin hom...

Tartışmalar

Burada açıklanan test, esasen değişikliklerle önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış, floresan etiketle etiketlenmiş bir phallotoxin, phalloidin kullanmaktadır. Floresan phalloidin analogları sabit dokularda akrin filamentlerinin boyanmasının altın standardı olarak kabul edilir47,48,49. Aslında, özellikle actin filamentleri50'yi tanımlamak için en eski araçlardı...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Yeni Zelanda Nörolojik Vakfı (1835-PG), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi (#16-597) ve Yeni Zelanda Otago Üniversitesi Anatomi Bölümü tarafından desteklendi. İnsan beyin dokuları için HCB-IDIBAPS BioBank (İspanya) Nörolojik Doku Bankası'na borçluyuz. Jiaxian Zhang'a videonun kaydedilip düzenlenmesindeki yardımı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tubeBeckman Coulter349622For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287F-actin specific ligand
Antibody against  b-actinSanta Cruz BiotechnologySc-47778For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDHAbcamAb181602For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolystyreneCorning3596For light-scattering measurements
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD5879Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)Li-Cor BiosciencesFor detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade IISigma-AldrichG6257Fixative
HEPESSigma-AldrichH3375Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin ASigma-AldrichL5163Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)Sigma-AldrichM2670Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mmMilliporeLSWP01300Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mmMilliporeNY1H02500Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IVAbcamab201115For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Krebs buffer component
SpectraMax i3xMolecular DevicesFor fluorometric measurements
SucroseFisher ChemicalS/8600/60Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter HolderMilliporeSx0001300Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034For tissue homogenization
Triton X-100Sigma-AldrichX100Component of Permeabilization buffer
Trizma baseSigma-AldrichT6066Buffer ingredient for sample preparation

Referanslar

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, 14869-14871 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 172sinaptozomlarsinaptoneurozomlarF aktinsitoskeletondepolarizasyonlatrunculin Aphalloidinfloresan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır