用于评估啮齿动物和人类脑组织中行为素聚合状态的基于时间的荧光光谱分析

摘要

我们报告了一种简单、省时和高通量荧光光谱分析，用于从啮齿动物和人类受试者脑组织 中对 活体细丝进行定量。

摘要

Actin 是细胞骨骼的主要成分，在维持神经元结构和功能方面起着至关重要的作用。在生理状态下，行为素以两种形式以平衡形式发生:单体球状（G-actin）和聚合丝（F-actin）。在突触终端，作用细胞细胞细胞形成关键突触前和突触后功能的基础。此外，作用素聚合状态的动态变化（球状和细丝形式的作用之间的转换）与突触结构和功能的可塑性相关变化密切相关。我们在这里报告一种基于荧光的修改方法，以评估 前体内 环境中作用素的聚合状态。该检测采用荧光标签的法洛丁，一种法洛托辛，专门结合到作用丝（F-actin），提供聚合丝活性蛋白的直接测量。作为原则的证明，我们为在啮齿动物和死后人类脑组织同质化中进行检测的适用性提供了证据。使用拉特伦库林A（一种使肌细丝脱聚的药物），我们确认该检测在监测F-actin水平变化方面的作用。此外，我们扩展检测到分离突触终端的生化部分，其中我们确认通过高细胞外 K⁺去极化刺激刺激时增加作用素聚合。

引言

细胞骨质蛋白作用素涉及多种细胞功能，包括结构支持、细胞传输、细胞动力和分裂。Actin 以两种形式以均衡形式发生:单体球状作用素 （G-actin） 和聚合丝作用素 （F-actin）。actin的聚合状态（其G-和F-形式之间的互通）的快速变化导致快速的丝组装和拆卸，并成为其细胞生理学调控作用的基础。Actin是神经元细胞骨结构的主要组成部分，影响广泛的神经元功能^1，2。值得注意的是，细胞球菌的作用是突触终端结构平台的组成部分。因此，它是突触形态形成和生理学的主要决定因素，在控制突触^3、4、5的大小、数量和形态方面起着基础性作用。特别是，动态作用聚合-去聚合是与记忆和学习过程背后的突触可塑性相关的突触重塑的关键决定因素。事实上，前突性（如神经递质释放^{6，7，8，9，10）}和后突体功能（可塑性相关的动态改造11，12，13，14）都严重依赖于在细胞细胞细胞顿的聚合状态的动态变化。

在生理条件下，F-actin水平通过多式联运途径进行动态和严格调节，包括后翻译修饰^4、15、16以及活性结合蛋白（ABPs）4、17。ABP 可以影响多个级别的活性动力学（如启动或抑制聚合、诱导丝分枝、将细丝分离到较小的碎片、促进去聚合和防止脱聚），并依次在对各种细胞外信号敏感的严格调制控制下^{18、19、20。}这种多层次的监管检查要求对突触细胞细胞细胞的活性动力学进行严格监管，在基础和活动诱发状态下对神经元生理学的前期和后突触方面进行微调。

鉴于行为素在神经元生理学中的重要作用，一些研究提供了证据，证明行为动力学的改变与各种神经系统疾病有关，包括神经退化、心理疾病以及神经发育疾病^{3、21、22、23、24、25、26、27}等。然而，尽管大量的研究数据表明作用在神经元生理学和病理生理学中的关键作用，但在对行为动力学的理解上，特别是在突触细胞细胞细胞学方面，仍然存在着重大差距。需要更多的研究来更好地了解神经元作用及其在病理条件下的改变。在这方面，一个主要的重点领域是评估作用物聚合状态。有西方印迹为基础的商业套件（G-Actin/F-Actin在体内测定生化套件;赛托斯凯尔顿SKO BK037^28，29）和自制的检测评估F-actin水平⁶。然而，由于这些需要F-actin和G-actin的生化分离，并且由于它们随后的定量基于免疫凝固协议，因此它们可能非常耗时。我们这里报告一个荧光光谱为基础的检测，改编自先前的研究³⁰与修改，可用于评估F-actin的基础水平，以及其组装拆解的动态变化。值得注意的是，我们已经有效地修改了原来的协议，要求样品适合1 mL的cuvette到目前的96井板格式。因此，修改后的方案显著减少了检测所需的组织/样本量。此外，我们提供证据表明，该协议不仅适用于脑组织同质化，还适用于细胞下部分，如分离突触终端（突触体和突触体）。最后，该检测可用于刚解剖的啮齿动物脑组织和长期储存的死后人类大脑样本。值得注意的是，虽然测定是在神经元环境中呈现的，但它可以适当地扩展到与之相关的其他细胞类型和生理过程。

研究方案

所有实验程序均按照奥塔哥大学保护和使用实验室动物道德委员会的规定进行（道德议定书第1号）AUP95/18 和 AUP80/17）和新西兰立法机构。人脑组织是从西班牙巴塞罗那的Clénic-IDIBAPS生物库的神经组织库获得的。所有组织收集协议均得到巴塞罗那克莱尼奇医院道德委员会的批准，并征得家属的知情同意。

1. 准备缓冲器和试剂

1. 为脑组织的同质化和合成终端的丰富部分的准备下列缓冲器:
   同质化缓冲:5米高，pH 7.4，辅以0.32米蔗糖
   悬念缓冲:5米三轮车，pH 7.4补充0.32米蔗糖
   洗涤缓冲区:5米三轮车，pH 8.1
   1.2 米蔗糖
   1.0 米蔗糖
   0.85 米蔗糖
2. 添加蛋白酶和磷酸盐抑制剂的自制或商业组合。
   注意:我们使用了EDTA免费版本的全蛋白酶抑制剂混合（每10毫升缓冲器1片）和磷酸盐抑制剂鸡尾酒IV（1:100;体积:体积）。
3. 准备以下缓冲器和试剂，用于修复、渗透和结合法洛丁:
   克雷布斯缓冲区: 118.5 m NaCl， 4.7 mM KCl， 1.2 mM MgCl_2，2 mM 卡Cl_2，0.1 mM KH₂PO_4，5 m 纳米纳赫科_3，10 mM 葡萄糖， 20 mM HEPES， pH 7.4
   1 M 千克
   25% 谷氨酸醛（库存溶液）
   包含 0.1% 特里顿 X-100 和 1 毫克/mL 纳布₄的克雷布斯缓冲区
   400x 亚历克萨氟 647 法洛丁在 DMSO
   含有 0.32 M 蔗糖的克雷布斯缓冲区
   DMSO 中的 50μM 拉特伦库林 A （库存解决方案）
   1 M KCl（库存解决方案）
   注意:法罗丁是有毒的（LD₅₀ = 2 毫克/千克），必须小心处理。吸入谷氨酸是有毒的，应该用烟灰罩处理。
4. 将缓冲区存储在 4 °C 和法勒丁和拉特伦库林 A 在 -20 °C 进行长期存储。
   注:不建议长期存储缓冲区。协议可在此处暂停。

2. 脑组织同质化

1. 在波特-埃尔韦杰姆 玻璃管中，将冷冻保存或刚解剖的老鼠脑组织同质化，在10卷同质化缓冲器中，并在冰上缠虫。
   注:最佳均质化是通过手动15-20次脑组织毛刺达到的。通过玻璃管悬架的平稳流动可以确认成功同质化。协议可在此处暂停。
2. 使用布拉德福德检测³¹确定同质体中的蛋白质浓度。
   注意:也可以使用替代自制或商业检测蛋白质估计。
3. 在 Krebs 缓冲区中稀释同质样品，浓度为 2-3 毫克蛋白质/mL，体积为 50 μL。
   注意:在我们的一些实验中，我们用2μM拉特伦库林A或DMSO（控制）在37°C的1小时孵育同质物。为此，在 48 μL 的 Krebs 缓冲器中恢复同质化，并添加 2 μL 的 50 μM 拉特伦库林 A 或 2 μL DMSO。此外，为了进行免疫凝血，在孵化后收集少量样本（10微克）。
4. 修复同质样本（第 5 节）。

3. 准备孤立的神经末梢

1. 合成体的准备
   注:也可以使用突触体的替代协议^32，33。
   1. 离心机大脑在 1，200 x g 中均质，在 4 °C 下 10 分钟。
   2. 丢弃颗粒，这是粗糙的核分数。
   3. 进一步离心超自然 （S1） 获得步骤 3.1.1 在 12，000 x g 15 分钟在 4 °C.
   4. 去除超自然（S2），这是可溶性细胞质分数。
   5. 重新悬念步骤 3.1.3 获得的颗粒 （P2），这是悬念缓冲中的粗突触体分数。
      注:悬念缓冲器的体积取决于启动组织的数量和获得的颗粒量。例如，当从150-300毫克脑组织开始时，获得的颗粒可以在200μL的悬念缓冲中恢复。
   6. 将再悬储的原油突触体装载到等量为 0.85-1.0-1.2 M 蔗糖的不连续蔗糖梯度上。
      注意:我们通常使用1mL每个蔗糖溶液（150-300毫克组织）。这可以根据较大的组织量进行更改。使用25G注射器压在超中量管内壁和蔗糖层的温和分层，可以进行不连续的梯度。
   7. 离心机在 85，000 x g 2 小时在 4 °C。
      注:由于离心速度高，需要一种能够制造真空以减少加热的超中心燃料。
   8. 使用 200 μL 管道尖端收集界面上 1.0 至 1.2 M 蔗糖的突触体分数。
   9. 用离心机在 18，000 x g 的冰冷洗涤缓冲器中清洗突触体部分，在 4 °C 下 10 分钟。
      注意:对于洗涤，在 1.0 和 1.2 M 蔗糖接口获得的突触体分数收集在一个新的 1.5 mL 管中，并添加等量的洗涤缓冲，确保从介质中去除高蔗糖。
   10. 再次用冰冷的同质化缓冲器在 12，000 克下清洗突触体颗粒，在 4 °C 下 10 分钟。
   11. 在冰上同质化缓冲器中补充突触体。
       注:协议可在此处短暂暂停。
   12. 使用布拉德福德检测确定蛋白质浓度。
   13. 在 Krebs 缓冲器中以 2-3 毫克蛋白质/mL 的浓度在 50 μL 的体积中补充突触体（如果突触体要被 KCl 去极化，则为 47.5 μL;见第 4 节）。
       注意:对于悬念，突触体分数在 4 °C 下以 12，000 x g 首次旋转 5 分钟，并去除超自然（缓冲区）。然后，通过使用 200 μL 管道尖端轻轻吹管，在 Krebs 缓冲器中重新填充突触体颗粒。
   14. 继续去极化（第4节）。
2. 合成子神经体的制备
   注:也可以使用突触体的替代协议^34，35。
   1. 使用 1 mL 注射器在滤芯支架中通过 100μm 孔径大小的预湿网过滤器将大脑均质化。
      注意:所有过滤器的预润湿对于避免样品丢失非常重要，应使用均质化缓冲区进行。为此，使用 1 mL 注射器通过滤镜支架中的滤镜，实现均质化缓冲，直到缓冲器流出。
   2. 在冰上预冷的 1.5 mL 管中收集滤滤片 （F1）。
   3. 重复流程（步骤 3.2.1 和 3.2.2）为 F1 分数获得第二个滤滤 （F2）。
   4. 通过 5μm 孔径大小的净滤镜传递 F2 过滤。
   5. 在冰上预冷的 1.5 mL 管中收集滤滤（F3）。
   6. 离心机过滤 F3 在 1，500 x g 10 分钟在 4 °C。
   7. 在冰上以浓度为2-3毫克蛋白质/mL的克雷布斯缓冲区中补充颗粒（突触体），体积为50微升（如果突触体被KCl去极化，为47.5微升;见第4节）。
      注:协议可在此处短暂暂停。
   8. 使用布拉德福德检测来估计蛋白质浓度。
   9. 继续去极化（第4节）。

4. KCl 调解的分离突触终端的去极化

1. 平衡突触体/突触体在37°C 5-10分钟。
2. 通过添加 KCl 将细胞外 K⁺ 增加到 50 mM，在 37 °C 时将 30 s 的突触体/突触体体位增加，并将等量的 Krebs 缓冲器添加到各自未刺激的控制集中。
   注意:例如，在 47.5 μL 的克雷布斯缓冲区中，将 2.5μL 的 1 M KCl 添加到突触体中:并将 2.5 μL 的 Krebs 缓冲区添加到各自未刺激的控制突触体中。对于涉及大量样品的实验，每次不超过2个样本，使去极化时间不超过30s。
3. 通过添加谷氨酸终止刺激（第5节）。

5. 样品的固定和法乐丁染色

1. 在室温下将谷氨酰醛添加到同质化/突触体/突触样本中，最终浓度为2.5%，为2-3分钟。
   注:我们添加了6微升25%的谷氨酸醛溶液，使50微L样品中谷胱甘肽的最终浓度（同源物/突触体/突触体）为2.5%。固定是至关重要的，应该快速，因此在添加谷胱甘肽后，样品应立即大力漩涡。
2. 沉积样品在20，000 x g 5分钟。
3. 去除超自然。
   注意:将超物质丢弃在烟灰罩中，因为谷胱甘肽是有毒的。
4. 在 100 μL 的 Krebs 缓冲器中通过悬念使颗粒渗透，其中含有 0.1% Triton X-100 和 1 毫克/mL NaHB_4， 在室温下为 2-3 分钟。
5. 沉积样品在20，000 x g 5分钟。
6. 取下渗透缓冲区。
7. 用200μL的克雷布斯缓冲器在离心机下用20，000 x 克清洗颗粒5分钟。
8. 在室温下，在 100 μL 的 Krebs 缓冲器中，用 1x Alexa 氟 647 法洛丁（对应 500 μU） 重新填充和弄脏颗粒，在黑暗中 10 分钟。
   注:其他品种的荧光法洛丁类比是商业上可用的，可以替代的检测。法乐蛋白的浓度和总的孵化量可能需要根据所测试的组织/样品的数量和类型进行修改，并相应地标准化最佳条件。
9. 将染色样品在20，000 x g中分化5分钟。
10. 去除未绑定的法勒丁（超自然）。
11. 通过离心处理200μL的克雷布斯缓冲器，在20，000 x 克下清洗样品5分钟。
12. 在含有0.32M蔗糖的克雷布斯缓冲液的200μL中重新喷出。
    注:协议可在此处短暂暂停。

6. 荧光分析和光散射

1. 在黑色 96 井板中分配亚历克萨氟 647 法洛丁染色样品。
2. 在室温下，在板读卡器中测量激发波长为 645 nm 和发射波长为 670 nm 的荧光强度。
3. 使用 200 μL 管道尖端将样品从黑色 96 井板转移到透明 96 井板。
4. 测量在 540 nm 下散射的光，以纠正在固定、渗透和染色前几步可能发生的任何损失。
   注意:对于少量起始材料，污渍样品中保留的生物材料的变化可能更为突出（参见讨论）。
5. 包括一套亚历克萨氟647法洛丁在克雷布斯缓冲区在不同浓度（0.05倍， 每批检测为标准曲线的 0.1 倍、0.25 倍、0.35 倍、0.75 倍、0.5 倍和 1 倍，相当于 25、50、125、175、250、375 和 500μU）。
   注意:这是一个可选的步骤，不会影响检测结果，特别是当 F-actin 水平以相对方式表示时（第 7 节）。协议可在此处暂停。

7. 数据分析

1. 样品中的F-actin量与绑定法洛丁的荧光强度成正比。用标记的法勒丁标准的线性曲线计算的法勒丁绑定单位的绝对值表示。
   注:例如，请参阅图 2A-B、3A、4A-B和补充图 2。
2. 将 F-actin 水平作为控制样本的一小部分。
   注:例如，请参阅图 5A-B。

结果

F-actin 水平评估的检测的线性
首先，确定了亚历克萨荧光647法洛丁荧光线性增加的标准曲线，并重复了每组实验（图1）。为了调查检测的线性范围，处理了不同数量的大脑同质性，从啮齿动物（图2A和2B）和死后人类受试者（图3A和3B）。检测结果发现，该检测在50-200微克蛋白质范围内是线性的，通?...

讨论

这里描述的检测，基本上改编自先前的研究³⁰与修改，采用了一种法洛托辛，法洛丁标签与荧光标签。荧光法洛丁类比被认为是固定组织^47、48、49染色蛋白丝的黄金标准。事实上，它们是专门识别行为细丝⁵⁰的最古老的工具，并且仍然是检测行为细丝的最广泛使用的工具，特别是用于随后的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation