حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

Summary

هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).

Abstract

تم وصف بروتوكول مفصل لإعداد عينات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED). تم تطوير MicroED لحل هياكل البروتينات والجزيئات الصغيرة باستخدام معدات الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) القياسية. بهذه الطريقة ، تم مؤخرا تحديد الجزيئات الصغيرة والببتيدات والبروتينات القابلة للذوبان والبروتينات الغشائية بدقة عالية. يتم تقديم البروتوكولات هنا لإعداد شبكات من المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام عقار كاربامازيبين كمثال. يتم تقديم بروتوكولات لفحص وجمع البيانات. يتم تقديم خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل تكامل البيانات وتحديد الهيكل والتحسين في مكان آخر. يقدر الوقت اللازم لإعداد شبكات الجزيئات الصغيرة بأقل من 30 دقيقة.

Introduction

حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED) هو طريقة مجهرية إلكترونية بالتبريد (cryo-EM) لتحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم أقل من^{ميكرومتر 1,2}. يتم تطبيق البلورات على شبكات المجهر الإلكتروني القياسي (TEM) ويتم تجميدها إما عن طريق الغطس في الإيثان السائل أو النيتروجين السائل. ثم يتم تحميل الشبكات في TEM تعمل في درجات حرارة مبردة. توجد البلورات على الشبكة ويتم فحصها للتأكد من جودة الحيود الأولية. الدوران المستمر يتم جمع بيانات MicroED من مجموعة فرعية من البلورات التي تم فحصها ، حيث يتم حفظ البيانات باستخدام كاميرا سريعة كفيلم³. يتم تحويل هذه الأفلام إلى تنسيق بلوري قياسي ومعالجتها بشكل متطابق تقريبا كتجربة علم البلورات بالأشعة السينية⁴.

تم تطوير MicroED في الأصل للتحقيق في بلورات البروتين^{الدقيقة 1,2}. يؤدي عنق الزجاجة في علم بلورات البروتين إلى نمو بلورات كبيرة ومرتبة جيدا لتجارب حيود الأشعة السينية السنكروترونية التقليدية. نظرا لأن الإلكترونات تتفاعل مع أوامر المادة ذات الحجم الأقوى من الأشعة السينية ، فإن قيود حجم البلورة اللازمة لإنتاج حيود يمكن اكتشافه أصغر بكثير⁵. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نسبة أحداث التشتت المرنة إلى غير المرنة أكثر ملاءمة للإلكترونات ، مما يشير إلى أنه يمكن جمع المزيد من البيانات المفيدة مع تعرض إجمالي أصغر⁵. سمحت التطورات المستمرة بجمع بيانات MicroED من البلورات الدقيقة^{الأكثر تحديا 6}،^7،8،9.

في الآونة الأخيرة ، ثبت أن MicroED أداة قوية لتحديد هياكل المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة من المواد غير المتبلورة على ما يبدو¹⁰،¹¹،^12،13. يمكن أن تأتي هذه المساحيق مباشرة من زجاجة كاشف تم شراؤها ، أو عمود تنقية ، أو حتى من سحق حبوب منع الحمل إلى مسحوق ناعم¹⁰. تبدو هذه المساحيق غير متبلورة بالعين ، ولكنها قد تكون إما مكونة بالكامل من بلورات نانوية أو تحتوي فقط على كميات ضئيلة من الرواسب البلورية النانوية في جزء غير بلوري غير متبلور أكبر. يعد تطبيق المادة على الشبكة أمرا سهلا ، وقد تكون الخطوات اللاحقة لتحديد الكريستال والغربلة وجمع البيانات مؤتمتة في المستقبل^{القريب 14}. في حين أن البعض الآخر قد يستخدم طرقا مختلفة لإعداد العينات وجمع البيانات ، هنا يتم تفصيل البروتوكولات التي تم تطويرها واستخدامها في مختبر Gonen لإعداد عينات من الجزيئات الصغيرة ل MicroED ولجمع البيانات.

Protocol

1. تحضير عينات الجزيئات الصغيرة

1. انقل كمية صغيرة (0.01 - 1 مجم) من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.
2. بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. جفف العينات السائلة إلى مساحيق قبل محاولات الطريقة 1 (الخطوة 3) أو 2 (الخطوة 4).
   ملاحظة: قد تستخدم العينات المذابة في السائل الطريقة 3 (5.X) أدناه

2. إعداد شبكات TEM

ملاحظة: تتطلب بعض TEMs المزودة بأنظمة التحميل التلقائي قص الشبكات ووضعها في علبة قبل تحميلها في عمود TEM. يتضمن القص تأمين شبكة TEM مقاس 3 مم فعليا في حلقة معدنية يمكن للمحمل التلقائي معالجتها. يمكن تنفيذ هذه الخطوة والخطوات اللاحقة باستخدام شبكات TEM العادية أو شبكات TEM التي تم قصها. بالنسبة لهذه التجارب ، غالبا ما يكون من الأسهل التعامل مع الشبكات إذا تم قصها مسبقا.

1. لف الفيلم البلاستيكي حول أحد طرفي شريحة الغطاء الزجاجي.
2. ضع شبكات TEM على الفيلم أعلى شريحة الغطاء بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى. حدد جانبي الشبكة تحت الضوء. يضيء الجانب النحاسي ويبدو معدنيا ، بينما يظهر الجانب الكربوني بلون بني باهت (الشكل 1C ، D). بالنسبة للشبكات المقطوعة ، يجب أن يواجه جانب الكربون الوجه المسطح لحلقة المشبك.
3. ضع الشريحة مع شبكات في غرفة تفريغ التوهج. توهج تفريغ جانب الغطاء لمدة 30 ثانية تقريبا باستخدام الإعداد السلبي عند 15 pA. قم بتخزين الشبكات على شريحة الغطاء داخل طبق بتري زجاجي مبطن بورق ترشيح قبل إضافة عينة إلى الشبكات.

3. تطبيق العينة على الشبكات عن طريق إنشاء مسحوق ناعم متجانس (الطريقة 1)

1. قم بإزالة شبكة TEM المتوهجة المفرغة من طبق بتري المغطى باستخدام الملقط. ضع الشبكة على ورق ترشيح دائري بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى.
2. باستخدام ملعقة صغيرة ، قم بإزالة مغرفة صغيرة جدا من المسحوق (حوالي 0.1 مجم) وضعها على غطاء زجاجي صغير مربع بجوار شبكة TEM على ورق الترشيح. ضع شريحة زجاجية مربعة صغيرة أخرى أو غطاء فوق المسحوق.
3. بالأصابع ، افرك الشريحتين الزجاجيتين معا برفق لعمل مسحوق ناعم.
4. قم بزاوية شرائح الغطاء وضعها فوق شبكة TEM مباشرة على ورق الترشيح واستمر في فرك شرائح الغطاء معا ، على بعد بضعة سنتيمترات فقط فوق شبكة TEM التي تم تفريغها من التوهج (الشكل 1).
5. راقب لمعرفة ما إذا كان المسحوق يسقط باتجاه الشبكة. اكشف النقاب عن المسحوق المطحون ناعما عن طريق إزالة أحد الغطاءين الزجاجيين. قم بتنظيف المسحوق الناعم برفق من غطاء الغطاء باستخدام قطعة من ورق الترشيح على شبكة TEM (الشكل 1).

4. تطبيق العينة على الشبكات بتطبيق طريقة "الاهتزاز" (الطريقة 2)

1. أمسك بشبكة باستخدام زوج من الملقط وأسقطها في قارورة أو أنبوب عينة مسحوق. أغلق القارورة باستخدام الغطاء البلاستيكي لضمان عدم تسرب أي مادة عند اهتزازها.
2. أمسك القارورة في اليد ، هز القارورة بحيث يتحرك كل من المسحوق والشبكة لمدة 10 - 30 ثانية تقريبا.
3. أفرغ محتويات القارورة على ورق ترشيح دائري. عند الإمساك بالشبكة على الحافة ، انقر برفق على حافة الشبكة على ورق الترشيح لإزالة أي مواد زائدة من الشبكة.
   ملاحظة: اعتمادا على نوع القارورة وحجمها ، يمكن للمرء أيضا استخدام الملقط لإزالة شبكة TEM دون إفراغ المحتويات.

5. تطبيق العينة على الشبكات باستخدام طريقة التبخر (الطريقة 3)

1. ضع شبكة (مقطوعة أم لا) على وسط قطعة دائرية من ورق الترشيح بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى والجانب النحاسي متجها لأسفل.
2. باستخدام حقنة مانعة لتسرب الغاز سعة 10 ميكرولتر ، ضع قطرة صغيرة (حوالي 1-3 ميكرولتر) من المركب المذاب على جانب الكربون من الشبكة.
3. حرك ورق الترشيح برفق باستخدام الشبكات إلى غرفة تجفيف مفرغة من الهواء. تغطية الغرفة وتشغيل الفراغ. اترك الشبكات تحت التفريغ حتى تجف لمدة تصل إلى يوم واحد.
4. أطفئ المكنسة الكهربائية واترك الغرفة تنفيس لمدة 5 دقائق. يؤدي تنفيس الغرفة إلى تجنب تحرك الشبكات أو الطيران بعيدا عند كشفها.

6. تجميد وتحميل الشبكات في TEM

1. أمسك بحافة شبكة TEM باستخدام مجموعة من الملقط ، مع التأكد من أن الأطراف لا تثقب أيا من مربعات الشبكة. ارفع الشبكة 1-2 سم فوق ورق الترشيح وقم بزاوية الشبكة بزاوية 90 درجة إلى الورق أدناه. اضغط برفق على الملقط مع الحفاظ على الشبكة منتفخة بإحكام لإزالة أي مسحوق سائب.
2. قم بتجميد الشبكة عن طريق تحريك طرف الملقط بالشبكة مباشرة في حاوية النيتروجين السائل يدويا. عادة ما تكون هذه الحاوية هي محطة تحميل الشبكة ل TEM ، ولكن يمكن أن تكون أي حاوية آمنة ، مثل الترمس الآمن للنيتروجين السائل ، مقبولة للنقل أو التخزين. النيتروجين السائل هو -196 درجة مئوية.
3. انتظر حتى تتوقف الشبكة والملاقط عن الغليان قبل المزيد من التلاعب.
4. تحت النيتروجين السائل أو في أبخرة النيتروجين ، ضع الشبكة في حامل العينة مع توجيه جانب الكربون بحيث تصطدم العينة بالشعاع قبل فيلم دعم الكربون.
5. قم بتحميل حامل العينة في TEM للتأكد من أن الشبكة محفوظة في درجات حرارة النيتروجين السائل في جميع الأوقات.
   1. بالنسبة لأنظمة التحميل التلقائي ، ضع الشبكات المقطوعة في كاسيت في حاوية مبردة بالنيتروجين السائل. يتم نقل هذا الكاسيت إلى حاوية نقل مكوكية مما يسمح لروبوتات التحميل التلقائي بقبول الكاسيت مع الحفاظ على العينات آمنة للتنقل بين أداة التحميل التلقائي والعمود.
   2. بالنسبة لإعدادات TEM للدخول الجانبي، قم بتأمين الشبكة لحامل TEM للدخول الجانبي التجاري. تحتوي هذه الحوامل على حاوية تحضير عينة مملوءة بالنيتروجين السائل للسماح بنقل الشبكة إلى الحامل دون تسخين العينة. يتم إدخال حامل المدخل الجانبي في TEM مباشرة مع تأمين العينة في النهاية.

7. جمع بيانات MicroED

1. تحديد موقع وفحص البلورات النانوية
   1. افتح صمامات العمود TEM. اضبط التكبير باستخدام لوحات اليد إلى أقل تكبير ممكن. ابحث عن الشعاع عن طريق ضبط مقبض الشدة على الألواح اليدوية بحيث تكون منطقة مستديرة ومشرقة مرئية على شاشة الفلورسنت.
   2. خذ أطلس الشبكة بالكامل بتكبير منخفض (50 - 300x) باستخدام البرنامج المناسب 14،^15،16 (الشكل 2). تأكد من محاذاة المجهر جيدا لكل من التصوير بالتكبير المنخفض والعالي قبل جمع بيانات MicroED عالية الدقة.
   3. حدد مربعات الشبكة بدون كربون مكسور ولديك مادة / حبيبات سوداء أو داكنة مرئية على الفيلم (الشكل 2). تنقل حول الشبكة ، إما فعليا باستخدام عصا التحكم الموجودة على لوحات اليد ، أو فعليا على الأطلس الذي تم جمعه ، من أجل البحث عن مربعات الشبكة غير المكسورة والتي تحتوي على بلورات دقيقة.
   4. أضف مركز كل مربع من هذه المربعات إلى قائمة مواقع الشبكة للتحقيق. يمكن إضافة هذه المواقع إلى دفتر ملاحظات أو في واجهة مستخدم المجهر أو في برنامج أتمتة المجهر.
   5. قم بزيادة التكبير إلى 500-1300x واضبط الارتفاع المركزي في كل موقع شبكة مخزن وقم بتحديث قيمة Z المحفوظة إلى المواضع المذكورة في 7.1.4.
   6. ابحث إما على شاشة الفلورسنت أو على كاميرا سريعة عند هذا التكبير العالي عن البقع السوداء / الحبوب الصغيرة على الشبكة. غالبا ما تحتوي العينة الجيدة على حواف حادة عند التكبير العالي ، مما يشير إلى ترتيب بلوري.
   7. انقل بلورة محتملة موجودة إلى وسط الشاشة وقم بزيادة التكبير بحيث يدخل TEM في وضع التكبير العالي.
      ملاحظة: يشار إلى هذا إما باسم وضع التكبير العالي أو Zoom2 أو SA على أدوات مختلفة ويتوافق عادة مع التكبير بمقدار 3000 ضعف أو أعلى.
   8. أدخل فتحة منطقة محددة. قم بتغيير الفتحة إلى حجم أكبر أو أصغر للتأكد من أن المنطقة المحددة أكبر بقليل من البلورة (الشكل 3).
   9. قم بالتبديل إلى وضع الحيود عن طريق الضغط على زر الحيود الموجود على لوحات يد TEM ، مما يضمن إدخال شاشة الفلورسنت. اضبط طول الكاميرا باستخدام مقبض التكبير بحيث تكون دقة الحافة 1 Å على الأقل.
      ملاحظة: يجب إجراء معايرة أطوال الحيود بواسطة مهندس خدمة باستخدام شبكة وافل ذهبية أو عينة معروفة قبل محاولة تجارب MicroED.
   10. اضبط تركيز الحيود بحيث تكون البقعة المركزية حادة وصغيرة قدر الإمكان. باستخدام مقابض إزاحة الحيود ، انقل الشعاع المركزي إلى مركز شاشة الفلورسنت
   11. أدخل توقف الشعاع وتأكد من وجود الشعاع خلفه. ارفع شاشة الفلورسنت. التقط تعريضا ضوئيا قصيرا (حوالي 1 ثانية) على الكاميرا (الشكل 4).
   12. افحص نمط الحيود المقابل. سيكون للمرشح الجيد لجمع مجموعة بيانات كاملة بقع حادة يتم ترتيبها بانتظام في أعمدة وصفوف ، وسيمتد الحيود إلى ما بعد 2 Å ، ويفضل أن يكون ذلك على الأقل إلى 1 Å (الشكل 4). احفظ الإحداثيات البلورية إما في واجهة مستخدم TEM أو عن طريق تدوينها.
   13. كرر فحص الحيود لجميع البلورات المحتملة ذات الأهمية في مربع الشبكة الحالي.
2. جمع البيانات
   1. قم بتوسيط بلورة غربلة على الشاشة بتكبير عال (> 1000x). اضبط الارتفاع المركزي للبلورة باستخدام روتين تلقائي أو يدويا.
   2. أدخل فتحة المنطقة المحددة التي تناسب حجم البلورة وشكلها على النحو المحدد في 7.1.8 (الشكل 3). قم بإمالة المسرح في الاتجاهين السلبي والموجب حتى يتم حجب الصورة بواسطة أشرطة الشبكة (الشكل 3). لاحظ هذه الزوايا لأغراض جمع البيانات.
   3. حدد عدد الإطارات التي ستكون مطلوبة لامتداد الوتد الزاوي الكلي لمجموعة البيانات. من المعتاد استخدام أسافين 0.5 - 1.0 درجة لكل إطار ، مع قراءة الإطارات كل 1 إلى 5 ثوان اعتمادا على حساسية الكاميرا. على سبيل المثال ، يتطلب إسفين يمتد من -30 درجة إلى +30 درجة ، يدور بمعدل ثابت قدره 1 درجة ^s-1 مع إطار يقرأ كل 1 ثانية ، إجمالي 60 إطارا.
   4. بالنظر إلى الحد الأقصى لنطاق الإمالة الإجمالي من -72 درجة إلى +72 درجة ، ابدأ في تدوير المسرح بمعدل ثابت يبلغ 1 درجة ثانية -1 ثم ابدأ في قراءة البيانات كل ثانية واحدة على كاميرا حديثة مع وضع قراءة الغالق المتداول (الفيلم 1). يمكن تنفيذ هذه العملية يدويا أو باستخدام برنامج TEM محدد.
      1. اضبط معدل الدوران عن طريق تحديد النسبة المئوية لسرعة الإمالة القصوى ومتى تتوقف في واجهة مستخدم المجهر أو البرنامج المخصص. في هذا التحقيق ، تم قياس هذا ليكون 0.3 درجة ^s-1 لكل ٪ من السرعة القصوى ولكن يجب التحقق منه بشكل مستقل لكل مجهر.
         ملاحظة: يتم إعداد الإمالة وجمع بيانات الكاميرا بشكل مستقل هنا ، ولكن يمكن للبرامج¹⁴ تنسيق ذلك لتبسيط العملية.
      2. تخلص من حوالي 1 درجة على كل جانب من جوانب الإسفين المحدد في معظم الحالات كوقت ميت ، حيث تكون المرحلة إما تتصاعد أو تتباطأ إلى سرعة الدوران المطلوبة.
   5. احفظ البيانات في مجموعة متنوعة من التنسيقات إما كإطارات فردية أو كمجموعة من الصور (الفيلم 1).
   6. قم بتحويل إطارات الحيود هذه إلى تنسيق بلوري نموذجي باستخدام أدوات MicroED - متوفرة هنا (https://cryoem.ucla.edu). تتم معالجة صور الحيود المحفوظة بتنسيق SMV بسهولة باستخدام برنامج بلوري موثق^17,18.

النتائج

MicroED هي طريقة cryoEM تستفيد من التفاعلات القوية بين الإلكترونات والمادة ، والتي تسمح بالتحقيق في البلورات الصغيرة المتلاشية^12,13. بعد هذه الخطوات ، من المتوقع أن يكون هناك فيلم حيود بتنسيق بلوري تم جمعه من البلورات الدقيقة (الفيلم 1). هنا ، يتم عرض التقني...

Discussion

عادة ما يكون إعداد العينة عملية تكرارية ، حيث يتم إجراء التحسينات بعد جلسات الفحص وجمع البيانات. بالنسبة لعينات الجزيئات الصغيرة ، غالبا ما يكون من الحكمة أولا محاولة تحضير الشبكة دون تفريغ الشبكات المتوهجة ، نظرا لأن العديد من المستحضرات الصيدلانية تميل إلى أن تكون كارهة للماء^...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300	Any vial or tube will do.
Autogrid clips	Thermo-Fisher	1036173	Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector	Thermo-Fisher	CetaD 16M	We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.
Delphi software	Thermo-Fisher	N/A	Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software	Thermo-Fisher	N/A	Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides	Hampton	HR3-231
Glow discharger	Pelco	easiGlow
High PrecisionTweezers	EMS	78325-AC	Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel	Spear Lab	FD-800	A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software	UC Boulder	N/A	Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.
transmission electron microscope (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman circular filter paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm or larger