小分子的微晶电子衍射

摘要

在这里，我们描述了我们实验室开发的用于制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子晶体粉末的程序。

摘要

描述了制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子样品的详细方案。MicroED已被开发用于使用标准电子冷冻显微镜（cryo-EM）设备解决蛋白质和小分子的结构。通过这种方式，小分子、肽、可溶性蛋白和膜蛋白最近被测定到高分辨率。这里介绍了以药物卡马西平为例制备小分子药物网格的方案。提出了筛选和收集数据的协议。整个过程中的其他步骤（如数据集成、结构确定和优化）将在别处介绍。准备小分子网格所需的时间估计不到30分钟。

引言

微晶电子衍射（MicroED）是一种电子冷冻显微镜（cryo-EM）方法，用于从亚微米尺寸的晶体^1，2中确定原子分辨率结构。将晶体应用于标准透射电子显微镜（TEM）网格，并通过投入液态乙烷或液氮进行冷冻。然后将网格加载到在低温下运行的TEM中。晶体位于网格上并筛选初始衍射质量。连续旋转 MicroED数据是从筛选晶体的子集中收集的，其中数据使用快速相机保存为电影³。这些电影被转换为标准的晶体学格式，并且处理方式几乎与X射线晶体学实验⁴相同。

MicroED最初是为了研究蛋白质微晶^1，2而开发的。蛋白质晶体学的一个瓶颈是为传统的同步加速器X射线衍射实验生长出大而有序的晶体。由于电子与比X射线强几个数量级的物质相互作用，产生可检测衍射所需的晶体尺寸的限制^要小得多5。此外，弹性与非弹性散射事件的比例对电子更有利，这表明可以在较小的^{整体暴露5}下收集更多有用的数据。不断发展使得MicroED数据可以从最具挑战性的微晶⁶，^7，8，9中收集。

最近，MicroED已被证明是从明显无定形的材料^10，11，^12，13确定小分子药物结构的有力工具。这些粉末可以直接来自一瓶购买的试剂、纯化柱，甚至可以来自将药丸粉碎成细粉¹⁰。这些粉末肉眼看起来是无定形的，但可以完全由纳米晶体组成，或者仅以更大的非结晶、无定形部分含有微量的纳米晶体沉积物。将材料应用于网格是容易的，晶体鉴定、筛选和数据收集的后续步骤甚至可能在不久的将来实现自动化¹⁴。虽然其他人可能使用不同的方法来制备样品和数据收集，但这里详细介绍了 Gonen 实验室开发和使用的用于制备 MicroED 的小分子样品和数据收集的协议。

研究方案

1. 制备小分子样品

1. 将少量（0.01 - 1 mg）粉末、液体或固体转移到小瓶或管中。
2. 对于已经呈粉末形式的样品，使用盖子密封试管，直到需要样品为止。在尝试方法1（步骤3）或步骤2（步骤4）之前，将液体样品干燥成粉末。
   注意:溶解在液体中的样品可以使用下面的方法3（5.X）

2. 准备透射电镜网格

注意:一些带有自动加载系统的TEM要求在加载到TEM柱之前将网格夹住并放入盒中。削波涉及将 3 mm TEM 网格物理固定到自动加载机可以操作的金属环中。此步骤和后续步骤可以使用普通 TEM 网格或已裁剪的 TEM 网格执行。对于这些实验，如果提前剪裁网格，则通常更容易操作网格。

1. 将塑料薄膜缠绕在玻璃盖玻片的一端。
2. 将TEM网格放在盖玻片顶部的薄膜上，碳面朝上。在灯光下识别网格的两侧。铜面发光并呈现金属色，而碳面呈现单调的棕色（图 1C，D）。对于夹紧的网格，碳面应面向夹环的平面。
3. 将带有网格的载玻片放入辉光放电室。使用15 pA的负设置对盖侧进行辉光放电约30秒。在将样品添加到网格之前，将网格存储在衬有滤纸的玻璃培养皿内的盖玻片上。

3. 通过创建均匀的细粉将样品施加到网格上（方法 1）

1. 使用镊子从覆盖的培养皿中取出发光放电的TEM网格。将网格放在圆形滤纸上，碳面朝上。
2. 使用小刮刀取出一小勺粉末（约0.1毫克），然后将其放在滤纸上TEM网格旁边的小方形玻璃盖玻片上。将另一个小的方形载玻片或盖玻片放在粉末的顶部。
3. 用手指轻轻地将两个载玻片摩擦在一起，制成细粉。
4. 将盖玻片倾斜并将它们放置在滤纸上的TEM网格上方，然后继续将盖玻片摩擦在一起，仅比发光放电TEM网格上方几厘米（图1）。
5. 观察粉末是否朝网格下落。通过去除两个玻璃盖玻片中的一个来揭开细磨粉末。使用一张滤纸轻轻地将盖玻片上的细粉刷到TEM网格上（图1）。

4.通过应用"振荡"方法将样品施加到网格上（方法2）

1. 用一把镊子抓住一个网格，然后将其放入粉末样品的小瓶或管中。使用塑料盖关闭小瓶，以确保摇晃时没有材料会逸出。
2. 抓住手中的小瓶，摇动小瓶，使粉末和网格都移动约10-30秒。
3. 将小瓶内容物倒在圆形滤纸上。抓住网格的边缘，轻轻敲击滤纸上的网格边缘，以去除网格上的任何多余材料。
   注意:根据小瓶的类型和大小，也可以使用镊子在不清空内容物的情况下移除TEM网格。

5. 使用蒸发法将样品施加到网格上（方法3）

1. 将网格（剪裁与否）放在圆形滤纸的中心，碳面朝上，铜面朝下。
2. 使用 10 μL 气密注射器，将一小滴（约 1 - 3 μL）溶解化合物涂在网格的碳侧。
3. 轻轻地将带有网格的滤纸移动到真空干燥室中。盖上腔室并打开真空。将网格置于真空下干燥长达一天。
4. 关闭真空，让腔室通风5分钟。通风室可避免网格在未被覆盖时移动或飞走。

6. 将网格冷冻并加载到TEM中

1. 使用一组镊子抓住TEM网格的边缘，确保尖端不会刺穿任何网格方块。将网格抬高到滤纸上方 1 - 2 厘米处，并将网格与下面的纸张成 90° 的角度。轻轻敲击镊子，同时保持网格牢固地镊子以去除任何松散的粉末。
2. 用手将镊子的尖端与网格直接移动到液氮容器中来冻结网格。该容器通常是TEM的网格装载站，但可以是任何可以转移或储存的安全容器，例如液氮安全热水瓶。液氮为-196°C。
3. 等到网格和镊子停止沸腾，然后再进行进一步的操作。
4. 在液氮或氮气蒸汽下，将网格放置在碳侧定向的样品架中，以使样品在碳支撑膜之前被光束击中。
5. 将样品架装入TEM中，确保网格始终保持在液氮温度。
   1. 对于自动加载器系统，将夹住的网格放入液氮冷却容器中的盒中。该盒转移到穿梭容器中，允许自动加载器机器人接受盒，同时保持样品安全，以便在自动加载器和色谱柱之间穿梭。
   2. 对于侧入式 TEM 设置，请将电网固定到商用侧入式 TEM 支架上。这些支架有一个装满液氮的样品制备容器，允许在不加热样品的情况下将网格转移到支架上。侧入式支架直接插入TEM，样品固定在末端。

7. 收集微ED数据

1. 定位和筛选纳米晶体
   1. 打开透射电镜柱阀。使用手面板将放大倍率调整到尽可能低的放大倍率。通过调整手板上的强度旋钮来找到光束，以便在荧光屏上看到圆形的明亮区域。
   2. 使用适当的软件^14、15、16 以低放大倍率 （50 - 300x） 拍摄全网格图集（图 2）。在收集高分辨率MicroED数据之前，请确保显微镜在低倍和高倍率成像时都对准良好。
   3. 识别没有破碎碳的网格正方形，并在薄膜上具有可见的黑色或深色材料/颗粒（图2）。在网格周围导航，无论是使用手持面板上的操纵杆，还是在收集的图谱上虚拟，以搜索未损坏且包含微晶的网格方块。
   4. 将每个方块的中心添加到网格位置列表中以供调查。这些位置可以添加到笔记本、显微镜用户界面或显微镜自动化软件中。
   5. 将放大倍率增加到 500-1，300 倍，并调整每个存储网格位置的共心高度，并将保存的 Z 值更新到 7.1.4 中记录的位置。
   6. 在荧光屏或快速相机上以这种更高的放大倍率搜索网格上的小黑点/颗粒。一个好的样品在高放大倍率下通常具有锋利的边缘，表明结晶有序。
   7. 将定位的电位晶体移动到屏幕中心并增加放大倍率，使TEM进入高放大倍率模式。
      注意:在不同的仪器上，这被称为高放大倍率、变焦2或SA模式，通常对应于3，000倍或更高的放大倍率。
   8. 插入选定的区域光圈。将孔径更改为更大或更小的尺寸，以确保所选区域刚好大于晶体（图3）。
   9. 通过按下TEM手板上的衍射按钮切换到衍射模式，确保插入荧光屏。使用放大旋钮调整相机长度，使边缘至少为 1 Å 分辨率。
      注意:在尝试MicroED实验之前，应由服务工程师使用金华夫格栅或已知样品进行衍射长度的校准。
   10. 调整衍射焦点，使中心光斑尽可能清晰和小。使用衍射移位旋钮，将中心光束移动到荧光屏的中心
   11. 插入光束挡块并确保光束在其后面。提起荧光屏。在相机上短暂（约1秒）曝光（图4）。
   12. 检查相应的衍射图案。收集完整数据集的良好候选者将具有规则排列在列和行中的尖锐斑点，并且衍射范围将超过2 Å，最好至少达到1 Å（图4）。将晶体坐标保存在TEM用户界面中或通过写下来。
   13. 对当前网格正方形上所有感兴趣的潜在晶体重复衍射筛选。
2. 数据采集
   1. 将屏蔽的晶体以高放大倍率（> 1，000倍）在屏幕上居中。使用自动程序或手动调整晶体的真心高度。
   2. 插入最适合7.1.8中确定的晶体尺寸和形状的选定区域孔径（图3）。向负方向和正方向倾斜载物台，直到图像被网格条遮挡（图3）。请注意这些角度以进行数据收集。
   3. 确定跨越数据集的总角度楔形所需的帧数。通常每帧使用0.5 - 1.0°楔形，根据相机的灵敏度，每1到5秒读出一次帧。例如，一个从 -30° 到 +30° 的楔块，以 1° ^s-1 的恒定速率旋转，每 1 秒读出一个帧，总共需要 60 帧。
   4. 考虑到-72°至+72°的最大总倾斜范围，开始以1° ^s-1 的恒定速率旋转载物台，然后在具有卷帘快门读出模式的现代相机上开始每1秒读取一次数据（视频1）。此过程可以手动执行，也可以使用TEM专用软件执行。
      1. 通过在显微镜用户界面或专用软件中指定最大倾斜速度的百分比和停止时间来设置旋转速率。在这项调查中，最大速度的每百分比测量为0.3°^s-1 ，但需要对每个显微镜进行独立验证。
         注意:倾斜和相机数据收集在这里是独立设置的，但软件程序¹⁴ 可以对此进行协调以简化该过程。
      2. 在大多数情况下，在指定楔块的每一侧丢弃大约1°作为死区时间，此时载物台正在上升或减速到所需的旋转速度。
   5. 以各种格式将数据存储为单个帧或图像堆栈（影片 1）。
   6. 使用MicroED工具将这些衍射框架转换为典型的晶体学格式 - 可在此处获得（https://cryoem.ucla.edu）。以SMV格式保存的衍射图像很容易使用记录的晶体学软件^17，18进行处理。

结果

MicroED是一种冷冻电镜方法，它利用电子和物质之间的强相互作用，可以研究消失的小晶体^12，13。在这些步骤之后，有望从微晶中收集晶体学格式的衍射电影（视频1）。在这里，使用卡马西平¹²演示该技术。结果显示了来自在TEM网格上鉴定的卡马西平微晶的连续旋转MicroED数据集（视频1）。一个好的数据集具有...

讨论

样品制备通常是一个迭代过程，在筛选和数据收集后进行优化。对于小分子样品，通常谨慎的做法是首先尝试网格制备而不对网格进行辉光放电，因为许多药物往往是疏水性的^10，11。如果网格的纳米晶沉积物太少，最好在第一次对网格进行辉光放电后重试。可能是冻干粉末的晶体太大太厚，无法收集良好的数据。在这些情况下，可以从较大晶体的边缘?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300	Any vial or tube will do.
Autogrid clips	Thermo-Fisher	1036173	Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector	Thermo-Fisher	CetaD 16M	We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.
Delphi software	Thermo-Fisher	N/A	Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software	Thermo-Fisher	N/A	Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides	Hampton	HR3-231
Glow discharger	Pelco	easiGlow
High PrecisionTweezers	EMS	78325-AC	Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel	Spear Lab	FD-800	A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software	UC Boulder	N/A	Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.
transmission electron microscope (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman circular filter paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm or larger