Diffraction électronique microcristalline de petites molécules

Résumé

Nous décrivons ici les procédures développées dans notre laboratoire pour la préparation de poudres de cristaux de petites molécules pour des expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED).

Résumé

Un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour les expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED) est décrit. MicroED a été développé pour résoudre des structures de protéines et de petites molécules à l’aide d’un équipement standard de cryomicroscopie électronique (cryo-EM). De cette façon, de petites molécules, des peptides, des protéines solubles et des protéines membranaires ont récemment été déterminés à des résolutions élevées. Les protocoles sont présentés ici pour la préparation de grilles de produits pharmaceutiques à petites molécules en utilisant le médicament carbamazépine comme exemple. Les protocoles de dépistage et de collecte des données sont présentés. Des étapes supplémentaires du processus global, telles que l’intégration des données, la détermination de la structure et le raffinement, sont présentées ailleurs. Le temps nécessaire à la préparation des grilles de petites molécules est estimé à moins de 30 min.

Introduction

La diffraction électronique microcristalline (MicroED) est une méthode de cryomicro-microscopie électronique (cryo-EM) pour déterminer les structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille inférieure^au micromètre ^1,2. Les cristaux sont appliqués sur des grilles de microscope électronique à transmission standard (MET) et congelés en plongeant dans de l’éthane liquide ou de l’azote liquide. Les grilles sont ensuite chargées dans un TEM fonctionnant à des températures cryogéniques. Les cristaux sont situés sur la grille et criblés pour la qualité initiale de la diffraction. Les données MicroED à rotation continue sont collectées à partir d’un sous-ensemble des cristaux filtrés, où les données sont enregistrées à l’aide d’une caméra rapide comme film³. Ces films sont convertis en un format cristallographique standard et traités presque à l’identique comme une expérience de cristallographie aux rayons X⁴.

MicroED a été développé à l’origine pour étudier les microcristaux de protéines ^1,2. Un goulot d’étranglement dans la cristallographie des protéines fait pousser de gros cristaux bien ordonnés pour les expériences traditionnelles de diffraction des rayons X synchrotron. Comme les électrons interagissent avec des ordres de grandeur de matière plus forts que les rayons X, les limites de la taille des cristaux nécessaires pour produire une diffraction détectable sont considérablement plus petites⁵. De plus, le rapport entre les événements de diffusion élastiques et inélastiques est plus favorable pour les électrons, ce qui suggère que des données plus utiles peuvent être collectées avec une exposition globale plus faible⁵. Des développements constants ont permis de recueillir des données MicroED à partir des microcristaux les plus difficiles 6,7,8,9.

Récemment, MicroED s’est avéré être un outil puissant pour déterminer les structures de produits pharmaceutiques à petites molécules à partir de matériaux apparemment amorphes^10,11,12,13. Ces poudres peuvent provenir directement d’une bouteille de réactif acheté, d’une colonne de purification, ou même de l’écrasement d’une pilule en une poudre fine¹⁰. Ces poudres semblent amorphes à l’œil, mais peuvent être entièrement composées de nanocristaux ou simplement contenir des traces de dépôts nanocristallins dans une fraction amorphe non cristalline plus grande. L’application du matériau à la grille est facile, et les étapes ultérieures d’identification des cristaux, de criblage et de collecte de données pourraient même être automatisées dans un proche avenir¹⁴. Alors que d’autres peuvent utiliser des méthodes différentes pour la préparation des échantillons et la collecte de données, ici les protocoles développés et utilisés dans le laboratoire Gonen pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour MicroED et pour la collecte de données sont détaillés.

Protocole

1. Préparation d’échantillons de petites molécules

1. Transférer une petite quantité (0,01 à 1 mg) de poudre, de liquide ou de solides dans un petit flacon ou un tube.
2. Pour les échantillons déjà sous forme de poudre, scellez le tube à l’aide du bouchon jusqu’à ce que l’échantillon soit nécessaire. Sécher les échantillons liquides en poudres avant de tenter la méthode 1 (étape 3) ou 2 (étape 4).
   NOTA: Les échantillons dissous dans un liquide peuvent utiliser la méthode 3 (5.X) ci-dessous.

2. Préparation des grilles TEM

REMARQUE : Certains TEM équipés de systèmes de chargeur automatique exigent que les grilles soient clipsées et placées dans une cassette avant d’être chargées dans la colonne TEM. L’écrêtage consiste à fixer physiquement la grille TEM de 3 mm dans un anneau métallique que le chargeur automatique peut manipuler. Cette étape et les étapes suivantes peuvent être effectuées à l’aide de grilles TEM normales ou de grilles TEM qui ont été tronquées. Pour ces expériences, il est souvent plus facile de manipuler les grilles si elles ont été découpées à l’avance.

1. Enroulez un film plastique autour d’une extrémité d’une lame de couvercle en verre.
2. Placez les grilles TEM sur le film sur le dessus de la diapositive de couverture, le côté carbone vers le haut. Identifiez les deux côtés de la grille sous une lumière. Le côté cuivre brille et apparaît métallique, tandis que le côté carbone apparaît d’une couleur terne et brune (Figure 1C, D). Pour les grilles clipsées, le côté carbone doit faire face à la face plate de l’anneau de clip.
3. Placez la glissière avec des grilles dans la chambre de décharge luminescente. Décharge luminescente du couvercle pendant environ 30 s en utilisant le réglage négatif à 15 pA. Rangez les grilles sur la lame de couverture à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre tapissée de papier filtre avant d’ajouter l’échantillon aux grilles.

3. Application de l’échantillon sur des grilles en créant une poudre fine homogène (méthode 1)

1. Retirez une grille TEM à décharge luminescente de la boîte de Petri couverte à l’aide d’une pince à épiler. Placez la grille sur un papier filtre circulaire avec le côté carbone vers le haut.
2. À l’aide d’une petite spatule, retirez une très petite cuillère de poudre (environ 0,1 mg) et placez-la sur une petite feuille de verre carrée juste à côté de la grille TEM sur le papier filtre. Placez une autre petite lame de verre carrée ou une lamelle de couverture sur la poudre.
3. Avec les doigts, frottez doucement les deux lames de verre ensemble pour obtenir une poudre fine.
4. Inclinez les lamelles de couverture et placez-les juste au-dessus de la grille TEM sur le papier filtre et continuez à frotter les lamelles ensemble, à quelques cm seulement au-dessus de la grille TEM déchargée à la lueur (Figure 1).
5. Observez pour voir si la poudre tombe vers la grille. Découvrir la poudre finement broyée en retirant l’une des deux lamelles de couvercle en verre. Badigeonner doucement la fine poudre de la lamelle de couverture à l’aide d’un morceau de papier filtre sur la grille TEM (Figure 1).

4. Application de l’échantillon aux grilles en appliquant la méthode de l’agitation (méthode 2)

1. Prenez une grille à l’aide d’une pince à épiler et déposez-la dans le flacon ou le tube de l’échantillon de poudre. Fermez le flacon à l’aide du capuchon en plastique pour vous assurer qu’aucun matériau ne s’échappera lorsqu’il sera secoué.
2. En saisissant le flacon dans la main, secouez le flacon de manière à ce que la poudre et la grille bougent pendant environ 10 à 30 s.
3. Vider le contenu du flacon sur un papier filtre circulaire. En saisissant la grille sur un bord, tapotez doucement le bord de la grille sur le papier filtre pour enlever tout excès de matériau de la grille.
   NOTE: Selon le type de flacon et la taille, on peut également utiliser une pince à épiler pour retirer la grille TEM sans vider le contenu.

5. Application de l’échantillon aux grilles à l’aide de la méthode d’évaporation (méthode 3)

1. Placez une grille (clipsée ou non) au centre d’un morceau circulaire de papier filtre avec le côté carbone vers le haut et le côté cuivre vers le bas.
2. À l’aide d’une seringue étanche aux gaz de 10 μL, appliquer une petite goutte (environ 1 à 3 μL) de composé dissous sur le côté carbone de la grille.
3. Déplacez délicatement le papier filtre avec des grilles dans une chambre de dessiccation sous vide. Couvrez la chambre et allumez l’aspirateur. Laissez les grilles sous vide sécher jusqu’à une journée.
4. Éteignez l’aspirateur et laissez la chambre s’évacuer pendant 5 min. La ventilation de la chambre évite que les grilles se déplacent ou s’envolent lorsqu’elles sont découvertes.

6. Congélation et chargement des grilles dans le GDT

1. Saisissez le bord de la grille TEM à l’aide d’une pince à épiler, en vous assurant que les pointes ne perforent aucun des carrés de la grille. Soulevez la grille de 1 à 2 cm au-dessus du papier filtre et inclinez la grille à 90° par rapport au papier en dessous. Tapotez doucement la pince à épiler tout en gardant la grille fermement serrée pour enlever toute poudre en vrac.
2. Congelez la grille en déplaçant la pointe de la pince à épiler avec la grille directement dans un récipient d’azote liquide à la main. Ce conteneur est généralement la station de chargement du réseau pour le TEM, mais il peut s’agir de tout conteneur sûr, tel qu’un thermos à azote liquide, qui peut être transféré ou stocké. L’azote liquide est de -196 °C.
3. Attendez que la grille et la pince à épiler cessent de bouillir avant de poursuivre les manipulations.
4. Sous l’azote liquide ou dans les vapeurs d’azote, placez la grille dans le porte-échantillon avec le côté carbone orienté de telle sorte que l’échantillon sera frappé par le faisceau avant le film de support de carbone.
5. Charger le porte-échantillon dans le TEM en s’assurant que la grille est maintenue à la température de l’azote liquide en tout temps.
   1. Pour les systèmes de chargement automatique, placez les grilles clipsées dans une cassette dans un récipient refroidi à l’azote liquide. Cette cassette transférée dans un conteneur de navette permet à la robotique du chargeur automatique d’accepter la cassette tout en gardant les échantillons en sécurité pour la navette entre le chargeur automatique et la colonne.
   2. Pour les installations TEM à entrée latérale, fixer le réseau à un support TEM commercial à entrée latérale. Ces supports ont un récipient de préparation d’échantillon rempli d’azote liquide pour permettre le transfert de la grille au support sans réchauffer l’échantillon. Le porte-entrée latérale est inséré dans le TEM directement avec l’échantillon fixé à l’extrémité.

7. Collecte de données MicroED

1. Localisation et criblage des nanocristaux
   1. Ouvrez les vannes de colonne TEM. Ajustez le grossissement à l’aide des panneaux manuels au grossissement le plus bas possible. Trouvez le faisceau en ajustant le bouton d’intensité sur les panneaux de main de manière à ce qu’une zone ronde et lumineuse soit visible sur l’écran fluorescent.
   2. Prenez un atlas toutes grilles à faible grossissement (50 - 300x) à l’aide du logiciel approprié^14,15,16 (Figure 2). Assurez-vous que le microscope est bien aligné pour l’imagerie à faible et à fort grossissement avant de collecter des données MicroED haute résolution.
   3. Identifiez les carrés de grille sans carbone cassé et ayez un matériau/des grains noirs ou foncés visibles sur le film (Figure 2). Naviguez autour de la grille, soit physiquement à l’aide du joystick sur les panneaux de main, soit virtuellement sur l’Atlas collecté, afin de rechercher des carrés de grille qui ne sont pas cassés et contiennent des microcristaux.
   4. Ajoutez le centre de chacun de ces carrés à une liste d’emplacements de grille à examiner. Ces emplacements peuvent être ajoutés à un ordinateur portable, dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel d’automatisation du microscope.
   5. Augmentez le grossissement à 500-1 300x et ajustez la hauteur eucentrique à chaque emplacement de grille stocké et mettez à jour la valeur Z enregistrée aux positions indiquées dans 7.1.4.
   6. Recherchez sur l’écran fluorescent ou sur une caméra rapide à ce grossissement plus élevé les petites taches noires / grains sur la grille. Un bon échantillon avec souvent des arêtes vives à fort grossissement, suggérant un ordre cristallin.
   7. Déplacez un cristal de potentiel localisé vers le centre de l’écran et augmentez le grossissement de sorte que le TEM passe en mode de grossissement élevé.
      REMARQUE: Ceci est appelé mode à grossissement élevé, Zoom2 ou SA sur différents instruments et correspond généralement à des grossissements de 3 000x ou plus.
   8. Insérez une ouverture de zone sélectionnée. Modifiez l’ouverture pour une taille plus grande ou plus petite pour vous assurer que la zone sélectionnée est juste plus grande que le cristal (Figure 3).
   9. Passez en mode diffraction en appuyant sur le bouton de diffraction sur les panneaux manuels TEM, en vous assurant que l’écran fluorescent est inséré. Ajustez la longueur de la caméra à l’aide du bouton d’agrandissement de sorte que le bord ait une résolution d’au moins 1 Å.
      REMARQUE : L’étalonnage des longueurs de diffraction doit être effectué par un technicien de service à l’aide d’un réseau de gaufres en or ou d’un échantillon connu avant de tenter des expériences MicroED.
   10. Ajustez la mise au point de diffraction de manière à ce que la tache centrale soit aussi nette et petite que possible. À l’aide des boutons de changement de vitesse de diffraction, déplacez le faisceau central vers le centre de l’écran fluorescent
   11. Insérez la butée du faisceau et assurez-vous que le faisceau est derrière lui. Soulevez l’écran fluorescent. Prenez une courte exposition (environ 1 s) sur l’appareil photo (Figure 4).
   12. Inspectez le diagramme de diffraction correspondant. Un bon candidat pour la collecte d’un ensemble de données complet aura des points pointus qui sont régulièrement disposés en colonnes et en lignes, et la diffraction s’étendra au-delà de 2 Å, de préférence au moins à 1 Å (Figure 4). Enregistrez les coordonnées cristallines dans l’interface utilisateur TEM ou en les écrivant.
   13. Répéter le criblage par diffraction pour tous les cristaux potentiels d’intérêt sur le carré de la grille actuelle.
2. Collecte de données
   1. Centrez un cristal grillagé sur l’écran à fort grossissement (> 1 000x). Ajustez la hauteur eucentrique du cristal à l’aide d’une routine automatique ou à la main.
   2. Insérez l’ouverture de zone sélectionnée qui correspond le mieux à la taille et à la forme du cristal, telles que déterminées au point 7.1.8 (figure 3). Inclinez la scène dans les directions négative et positive jusqu’à ce que l’image soit obstruée par les barres de grille (Figure 3). Notez ces angles à des fins de collecte de données.
   3. Déterminez le nombre d’images qui seront nécessaires pour couvrir le coin angulaire total du jeu de données. Il est typique d’utiliser des coins de 0,5 à 1,0° pour chaque image, les images étant lues toutes les 1 à 5 secondes en fonction de la sensibilité de la caméra. Par exemple, un coin s’étendant de -30° à +30°, tournant à une vitesse constante de 1° ^s-1 avec un cadre lu toutes les 1s, nécessiterait 60 images au total.
   4. Compte tenu de la plage d’inclinaison totale maximale de -72° à +72°, commencez à faire pivoter la scène à une vitesse constante de 1° ^s-1 , puis commencez à lire les données toutes les 1s sur un appareil photo moderne avec un mode de lecture à obturateur roulant (Movie 1). Ce processus peut être effectué manuellement ou à l’aide d’un logiciel spécifique à la GDT.
      1. Réglez la vitesse de rotation en spécifiant le % de la vitesse d’inclinaison maximale et quand s’arrêter dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel dédié. Dans cette étude, cela a été mesuré à 0,3 ° ^s-1 pour chaque % de vitesse maximale, mais devra être vérifié indépendamment pour chaque microscope.
         REMARQUE: L’inclinaison et la collecte de données de caméra sont configurées indépendamment ici, mais les logiciels¹⁴ peuvent coordonner cela pour simplifier le processus.
      2. Écarter environ 1° de chaque côté de la cale spécifiée dans la plupart des cas comme temps mort, lorsque l’étage monte en puissance ou ralentit jusqu’à la vitesse de rotation souhaitée.
   5. Enregistrez les données dans une variété de formats sous forme d’images individuelles ou sous forme de pile d’images (film 1).
   6. Convertissez ces images de diffraction dans un format cristallographique typique à l’aide des outils MicroED - disponibles ici (https://cryoem.ucla.edu). Les images de diffraction enregistrées au format SMV sont facilement traitées à l’aide d’un logiciel cristallographique documenté^17,18.

Résultats

MicroED est une méthode cryoEM qui exploite les interactions fortes entre les électrons et la matière, ce qui permet d’étudier des cristaux de plus en plus petits^12,13. Après ces étapes, on s’attend à ce qu’un film de diffraction en format cristallographique prélevé sur des microcristaux (film 1). Ici, la technique est démontrée à l’aide de carbamazépine¹². Les résultats montrent un ensemble de donné...

Discussion

La préparation des échantillons est généralement un processus itératif, où des optimisations sont effectuées après des séances de dépistage et de collecte de données. Pour les échantillons de petites molécules, il est souvent prudent de tenter d’abord la préparation de la grille sans décharge luminescente les grilles, car de nombreux produits pharmaceutiques ont tendance à être hydrophobes^10,11. Si les grilles ont trop peu de dépôts nanocrist...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300	Any vial or tube will do.
Autogrid clips	Thermo-Fisher	1036173	Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector	Thermo-Fisher	CetaD 16M	We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.
Delphi software	Thermo-Fisher	N/A	Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software	Thermo-Fisher	N/A	Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides	Hampton	HR3-231
Glow discharger	Pelco	easiGlow
High PrecisionTweezers	EMS	78325-AC	Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel	Spear Lab	FD-800	A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software	UC Boulder	N/A	Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.
transmission electron microscope (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman circular filter paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm or larger