Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

Резюме

Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).

Аннотация

Описан подробный протокол подготовки образцов малых молекул для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED). MicroED был разработан для решения структур белков и малых молекул с использованием стандартного оборудования электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, небольшие молекулы, пептиды, растворимые белки и мембранные белки недавно были определены с высоким разрешением. Представлены протоколы подготовки сеток низкомолекулярных лекарственных препаратов на примере препарата карбамазепин. Представлены протоколы скрининга и сбора данных. Дополнительные этапы общего процесса, такие как интеграция данных, определение структуры и уточнение, представлены в другом разделе. Время, необходимое для подготовки низкомолекулярных сеток, оценивается менее чем в 30 минут.

Введение

Микрокристаллическая дифракция электронов (MicroED) - это метод электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) для определения структур атомного разрешения из кристаллов субмикрометрового размера ^1,2. Кристаллы наносятся на сетки стандартного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и замораживаются путем погружения в жидкий этан или жидкий азот. Затем решетки загружаются в ПЭМ, работающую при криогенных температурах. Кристаллы располагаются на сетке и экранируются на начальное дифракционное качество. Данные MicroED непрерывного вращения собираются из подмножества экранированных кристаллов, где данные сохраняются с помощью быстрой камеры в виде видеоролика³. Эти фильмы преобразуются в стандартный кристаллографический формат и обрабатываются почти так же, как эксперимент по рентгеновской кристаллографии⁴.

MicroED был первоначально разработан для исследования белковых микрокристаллов ^1,2. Узким местом в кристаллографии белков является выращивание больших, хорошо упорядоченных кристаллов для традиционных экспериментов по синхротронной рентгеновской дифракции. Поскольку электроны взаимодействуют с веществом на порядки сильнее, чем рентгеновские лучи, ограничения размера кристалла, необходимого для получения обнаруживаемой дифракции, значительно меньше⁵. Кроме того, соотношение событий упругого и неупругого рассеяния более благоприятно для электронов, что позволяет предположить, что при меньшем общем воздействии можно собрать больше полезных данных⁵. Постоянные разработки позволили собирать данные MicroED из самых сложных микрокристаллов 6,7,8,9.

Недавно было показано, что MicroED является мощным инструментом для определения структур низкомолекулярных фармацевтических препаратов из явно аморфных материалов^10,11,12,13. Эти порошки могут поступать прямо из бутылки с покупным реагентом, очистительной колонки или даже из измельчения таблетки в мелкий порошок¹⁰. Эти порошки кажутся аморфными на глаз, но могут либо полностью состоять из нанокристаллов, либо просто содержать следовые количества нанокристаллических отложений в большей некристаллической, аморфной фракции. Нанесение материала на сетку является простым, и последующие этапы идентификации кристаллов, скрининга и сбора данных могут быть даже автоматизированы в ближайшем будущем¹⁴. В то время как другие могут использовать другие методы для подготовки образцов и сбора данных, здесь подробно описаны протоколы, разработанные и используемые в лаборатории Гонена для подготовки образцов малых молекул для MicroED и для сбора данных.

протокол

1. Подготовка образцов малых молекул

1. Переведите небольшое количество (0,01 - 1 мг) порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или пробирку.
2. Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. Высушите жидкие образцы в порошки перед попытками метода 1 (шаг 3) или 2 (шаг 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, растворенных в жидкости, можно использовать метод 3 (5.X), приведенный ниже

2. Подготовка сеток ТЕА

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ТЕА с системами автоматического заряжания требуют, чтобы решетки обрезались и помещались в кассету перед загрузкой в колонну ТЕА. Клиппинг включает в себя физическое закрепление 3-миллиметровой сетки TEM в металлическом кольце, которым может манипулировать автозагрузчик. Этот шаг и последующие шаги могут быть выполнены либо с использованием обычных сеток ТЕА, либо с использованием обрезанных сеток ТЕА. Для этих экспериментов часто легче манипулировать сетками, если они были обрезаны заранее.

1. Оберните полиэтиленовую пленку вокруг одного конца предметного стекла.
2. Поместите сетки ПЭМ на пленку в верхней части предметного стекла крышки карбоновой стороной вверх. Определите две стороны сетки под светом. Медная сторона блестит и кажется металлической, тогда как карбоновая сторона имеет тусклый коричневый цвет (рис. 1C, D). Для обрезанных сеток карбоновая сторона должна быть обращена к плоской поверхности зажимного кольца.
3. Поместите предметное стекло с решетками в камеру тлеющего разряда. Тлеющий разряд крышки в течение примерно 30 с, используя отрицательную настройку при 15 пА. Храните решетки на предметном стекле внутри стеклянной чашки Петри, выстланной фильтровальной бумагой, прежде чем добавлять образец в сетки.

3. Нанесение образца на сетки путем создания однородного мелкодисперсного порошка (метод 1)

1. Удалите с помощью пинцета тлеющую разряженную ПЭМ-сетку с закрытой чашки Петри. Поместите сетку на круглую фильтровальную бумагу карбоновой стороной вверх.
2. Используя небольшой шпатель, удалите очень маленькую мерную ложку порошка (примерно 0,1 мг) и поместите ее на маленькое квадратное стеклянное стекло рядом с сеткой TEM на фильтровальной бумаге. Положите еще одно небольшое квадратное предметное стекло или покровное стекло поверх порошка.
3. Пальцами аккуратно потрите два предметных стекла друг о друга, чтобы получился мелкий порошок.
4. Наклоните покровные стекла и расположите их чуть выше сетки ПЭМ на фильтровальной бумаге и продолжайте тереть покровные стекла друг о друга, всего на несколько см выше тлеющей разряженной сетки ПЭМ (рис. 1).
5. Наблюдайте, падает ли порошок на сетку. Раскройте мелко измельченный порошок, сняв одно из двух стеклянных покровных стекол. Аккуратно смахните мелкий порошок с покровного стекла с помощью кусочка фильтровальной бумаги на сетку ПЭМ (рис. 1).

4. Нанесение образца на сетки методом «встряхивания» (Метод 2)

1. Возьмите сетку с помощью пинцета и бросьте ее во флакон или пробирку с образцом порошка. Закройте флакон пластиковым колпачком, чтобы при встряхивании материал не вытекал.
2. Взяв флакон в руку, встряхните флакон так, чтобы порошок и сетка двигались примерно 10 - 30 с.
3. Вылейте содержимое флакона на круглую фильтровальную бумагу. Взявшись за сетку за край, аккуратно постучите по краю сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить излишки материала с сетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа флакона и размера можно также использовать пинцет для удаления сетки ПЭМ без опорожнения содержимого.

5. Нанесение пробы на решетки методом выпаривания (Метод 3)

1. Поместите сетку (обрезанную или нет) в центр круглого листа фильтровальной бумаги углеродной стороной вверх, а медной стороной вниз.
2. Используя газонепроницаемый шприц объемом 10 мкл, нанесите небольшую каплю (примерно 1-3 мкл) растворенного соединения на углеродную сторону решетки.
3. Аккуратно переместите фильтровальную бумагу с решетками в вакуумную камеру осушения. Накройте камеру крышкой и включите пылесос. Оставьте решетки под вакуумом для высыхания на срок до одного дня.
4. Выключите вакуум и дайте камере выйти на вентиляцию в течение 5 минут. Вентиляция камеры предотвращает смещение или разлет решеток при ее открытии.

6. Замораживание и загрузка решеток в ТЭМ

1. Возьмитесь за край сетки ТЕМ с помощью пинцета, убедившись, что кончики не проколют ни один из квадратов сетки. Поднимите сетку на 1-2 см над фильтровальной бумагой и наклоните сетку под углом 90° к бумаге внизу. Аккуратно постучите по пинцету, удерживая сетку плотно прижатым, чтобы удалить рассыпчатый порошок.
2. Заморозьте сетку, переместив кончик пинцета с сеткой прямо в контейнер с жидким азотом вручную. Этот контейнер, как правило, является сетчатой загрузочной станцией для ТЕА, но может быть любым безопасным контейнером, таким как термос, безопасный для жидкого азота, приемлемый для транспортировки или хранения. Жидкий азот -196 °C.
3. Дождитесь, пока сетка и пинцет перестанут кипеть, прежде чем приступать к дальнейшим манипуляциям.
4. Под жидким азотом или в парах азота поместите решетку в держатель образца так, чтобы углеродная сторона была ориентирована таким образом, чтобы образец был поражен лучом перед углеродной опорной пленкой.
5. Загрузите держатель образца в ПЭМ, убедившись, что решетка постоянно поддерживается при температуре жидкого азота.
   1. Для систем автозагрузчика поместите обрезанные решетки в кассету в контейнере с жидким азотом. Эта кассета переносится в челночный контейнер, что позволяет робототехнике автозагрузчика принимать кассету, сохраняя при этом образцы в безопасности для перемещения между автоматом загрузки и колонной.
   2. Для установок ТЕА с боковым входом прикрепите решетку к коммерческому держателю ТЕА с боковым входом. Эти держатели имеют контейнер для пробоподготовки, который заполнен жидким азотом, чтобы можно было перенести решетку на держатель без нагрева образца. Держатель бокового входа вставляется непосредственно в ТЕА, а образец закрепляется на конце.

7. Сбор данных MicroED

1. Локализация и скрининг нанокристаллов
   1. Откройте клапаны колонны ТЭМ. Отрегулируйте увеличение с помощью ручных панелей на минимально возможное увеличение. Найдите луч, отрегулировав ручку интенсивности на ручных панелях таким образом, чтобы на флуоресцентном экране была видна круглая яркая область.
   2. Возьмите атлас с полной сеткой с малым увеличением (50 - 300x), используя соответствующее программное обеспечение^14,15,16 (рис. 2). Перед сбором данных MicroED с высоким разрешением убедитесь, что микроскоп хорошо выровнен для получения изображений как с малым, так и с большим увеличением.
   3. Определите квадраты сетки без разрушенного углерода и с видимым черным или темным материалом / зернами на пленке (рис. 2). Перемещайтесь по сетке, либо физически с помощью джойстика на ручных панелях, либо виртуально по собранному Атласу, чтобы искать квадраты сетки, которые не разбиты и содержат микрокристаллы.
   4. Добавьте центр каждого из этих квадратов в список расположений сетки для исследования. Эти местоположения могут быть добавлены в ноутбук, в пользовательский интерфейс микроскопа или в программное обеспечение для автоматизации микроскопа.
   5. Увеличьте увеличение до 500-1,300x и отрегулируйте эуцентрическую высоту в каждом месте сохраненной сетки и обновите сохраненное значение Z до позиций, указанных в 7.1.4.
   6. Ищите на флуоресцентном экране или на быстрой камере с этим большим увеличением небольшие черные пятна/зерна на сетке. Хороший образец часто имеет острые края при большом увеличении, что предполагает кристаллический порядок.
   7. Переместите расположенный потенциальный кристалл в центр экрана и увеличьте увеличение таким образом, чтобы ПЭМ перешел в режим большого увеличения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это называется режимом с большим увеличением, Zoom2 или SA на разных инструментах и обычно соответствует увеличению 3,000x или выше.
   8. Вставьте выбранную область апертуры. Измените апертуру на больший или меньший размер, чтобы убедиться, что выбранная область просто больше, чем кристалл (рис. 3).
   9. Переключитесь в режим дифракции, нажав кнопку дифракции на ручных панелях ПЭМ, убедившись, что флуоресцентный экран вставлен. Отрегулируйте длину камеры с помощью ручки увеличения таким образом, чтобы разрешение края было не менее 1 Å.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка дифракционных длин должна выполняться сервисным инженером с использованием золотой вафельной решетки или известного образца перед попыткой экспериментов MicroED.
   10. Отрегулируйте дифракционный фокус таким образом, чтобы центральное пятно было как можно более резким и маленьким. С помощью ручек дифракционного сдвига переместите центральный луч в центр флуоресцентного экрана
   11. Вставьте упор балки и убедитесь, что балка находится за ней. Поднимите флуоресцентный экран. Сделайте короткую (примерно 1 с) экспозицию на камере (рис. 4).
   12. Проверьте соответствующую дифракционную картину. Хороший кандидат для сбора полного набора данных будет иметь острые пятна, которые регулярно располагаются в столбцах и строках, и дифракция будет простираться за пределы 2 Å, предпочтительно, по крайней мере, до 1 Å (рис. 4). Сохраните координаты кристалла либо в пользовательском интерфейсе TEM, либо записав их.
   13. Повторите дифракционный скрининг для всех интересующих потенциальных кристаллов на текущем квадрате сетки.
2. Сбор данных
   1. Центрируйте экранированный кристалл на экране с большим увеличением (> 1,000x). Отрегулируйте эуцентрическую высоту кристалла с помощью автоматической процедуры или вручную.
   2. Вставьте выбранную область апертуры, которая наилучшим образом соответствует размеру и форме кристалла, как определено в 7.1.8 (рис. 3). Наклоняйте сцену в отрицательном и положительном направлениях до тех пор, пока изображение не будет закрыто полосами сетки (рис. 3). Обратите внимание на эти углы для сбора данных.
   3. Определите количество кадров, которое потребуется для охвата общего углового клина набора данных. Обычно для каждого кадра используются клинья под углом 0,5 - 1,0°, при этом кадры считываются каждые 1-5 секунд в зависимости от чувствительности камеры. Например, клин в диапазоне от -30° до +30°, вращающийся с постоянной скоростью 1° ^с-1 с кадром, считываемым каждые 1 с, потребует 60 кадров.
   4. Учитывая максимальный суммарный диапазон наклона от -72° до +72°, начните вращать столик с постоянной скоростью 1° ^с-1 , а затем начните считывать данные каждые 1 с на современной камере с режимом считывания со скользящим затвором (Видео 1). Этот процесс может быть выполнен вручную или с помощью специального программного обеспечения TEM.
      1. Установите скорость вращения, указав % максимальной скорости наклона и время остановки в пользовательском интерфейсе микроскопа или в специальном программном обеспечении. В этом исследовании было измерено, что это составляет 0,3 ° ^с-1 на каждый процент максимальной скорости, но необходимо будет провести независимую проверку для каждого микроскопа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон и сбор данных камеры здесь настраиваются независимо друг от друга, но программы¹⁴ могут координировать это для упрощения процесса.
      2. Отбрасывайте примерно по 1° с каждой стороны указанного клина в большинстве случаев как мертвое время, когда ступень либо увеличивается, либо замедляется до желаемой скорости вращения.
   5. Сохраняйте данные в различных форматах как в виде отдельных кадров, так и в виде стопки изображений (Фильм 1).
   6. Преобразуйте эти дифракционные кадры в типичный кристаллографический формат с помощью инструментов MicroED, доступных здесь (https://cryoem.ucla.edu). Дифракционные изображения, сохраненные в формате SMV, легко обрабатываются с использованием документированного кристаллографического программного обеспечения^17,18.

Результаты

MicroED - это метод криоЭМ, который использует сильные взаимодействия между электронами и веществом, что позволяет исследовать исчезающе малые кристаллы^12,13. Ожидается, что после этих этапов будет получен дифракционный фильм в кристаллографическом формате, ...

Обсуждение

Пробоподготовка обычно представляет собой итеративный процесс, при котором оптимизация производится после сеансов скрининга и сбора данных. Для низкомолекулярных образцов часто целесообразно сначала попытаться получить решетку без тлеющей разрядки решеток, поскольку многие фармац...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300	Any vial or tube will do.
Autogrid clips	Thermo-Fisher	1036173	Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector	Thermo-Fisher	CetaD 16M	We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.
Delphi software	Thermo-Fisher	N/A	Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software	Thermo-Fisher	N/A	Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides	Hampton	HR3-231
Glow discharger	Pelco	easiGlow
High PrecisionTweezers	EMS	78325-AC	Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel	Spear Lab	FD-800	A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software	UC Boulder	N/A	Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.
transmission electron microscope (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman circular filter paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm or larger