Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يشير هذا العمل إلى طريقة للتحكم في إيقاع القلب لقلوب الفئران الفئران المعدلة وراثيا من القناة المعدلة وراثيا رودوبسين-2 (ChR2) باستخدام التحفيز الضوئي المحلي مع مصفوفة micro-LED ورسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات غشاء فوق القلب.

Abstract

يعد اضطراب نظم القلب البطيني سببا رئيسيا للوفيات والأمراض في جميع أنحاء العالم. إزالة الرجفان الكهربائي باستخدام الصدمات الكهربائية عالية الطاقة هو حاليا العلاج الوحيد للرجفان البطيني الذي يهدد الحياة. ومع ذلك ، قد يكون لإزالة الرجفان آثار جانبية ، بما في ذلك الألم الذي لا يطاق ، وتلف الأنسجة ، وتفاقم التشخيص ، مما يشير إلى وجود حاجة طبية كبيرة لتطوير استراتيجيات أكثر لطفا لإدارة ضربات القلب. إلى جانب النهج الكهربائية التي تقلل من الطاقة ، تم تقديم علم البصريات القلبية كأداة قوية للتأثير على نشاط القلب باستخدام قنوات أيون الغشاء الحساسة للضوء والنبضات الضوئية. في هذه الدراسة ، سيتم وصف طريقة قوية وصالحة للتحفيز الضوئي الناجح لقلوب الفئران السليمة في Langendorff استنادا إلى سرعة متعددة المواقع تطبق مجموعة 3 × 3 من الثنائيات الصغيرة الباعثة للضوء (micro-LED). يسمح رسم الخرائط البصرية المتزامنة لموجات الجهد الغشائي فوق القلبي بالتحقيق في آثار التحفيز الخاص بالمنطقة وتقييم نشاط القلب المستحث حديثا مباشرة في الموقع. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن فعالية إزالة الرجفان تعتمد بشدة على المعلمات المختارة للتحفيز الضوئي أثناء عدم انتظام ضربات القلب. سيتم إثبات أن المنطقة المضيئة من القلب تلعب دورا حاسما في نجاح الإنهاء وكذلك كيف يمكن تحقيق التحكم المستهدف في نشاط القلب أثناء الإضاءة لتعديل أنماط عدم انتظام ضربات القلب. باختصار ، توفر هذه التقنية إمكانية تحسين معالجة الآلية في الموقع على الطريق إلى التحكم في التغذية المرتدة في الوقت الفعلي لإيقاع القلب ، وفيما يتعلق بخصوصية المنطقة ، نهج جديدة في الحد من الضرر المحتمل لنظام القلب مقارنة باستخدام تطبيقات الصدمات الكهربائية غير المحددة.

Introduction

كشفت التحقيقات المبكرة للديناميكيات المكانية الزمانية أثناء عدم انتظام ضربات القلب أن الأنماط الكهربائية المعقدة أثناء الرجفان القلبي مدفوعة بموجات الإثارة الدوارة الشبيهة بالدوامة1. أعطت هذه النتيجة رؤى جديدة حول الآليات الأساسية لعدم انتظام ضربات القلب ، مما أدى بعد ذلك إلى تطوير علاجات إنهاء كهربائية جديدة تعتمد على الإثارة متعددة المواقع لعضلة القلب2،3،4. ومع ذلك ، فإن العلاجات التي تستخدم تحفيز المجال الكهربائي غير محلية وقد تعصب جميع الخلايا القابلة للإثارة المحيطة ، بما في ذلك الأنسجة العضلية ، مما يسبب تلفا للخلايا والأنسجة ، بالإضافة إلى ألم لا يطاق. وعلى النقيض من العلاجات الكهربائية، توفر الأساليب البصرية الجينية تقنية محددة وواقية للأنسجة لاستحضار إمكانات عمل الخلايا العضلية القلبية بدقة مكانية وزمنية عالية. لذلك ، فإن التحفيز البصري الوراثي لديه القدرة على التحكم في الحد الأدنى من التدخل الجراحي في أنماط التنشيط الفوضوية أثناء الرجفان القلبي.

إن إدخال قناة الأيونات الحساسة للضوء قناة رودوبسين-2 (ChR2) في الخلايا القابلة للإثارة عن طريق التلاعب الجيني5،6،7 ، مكن من إزالة الاستقطاب من إمكانات الغشاء للخلايا القابلة للإثارة باستخدام التحفيز الضوئي. تم تطوير العديد من التطبيقات الطبية ، بما في ذلك تنشيط الشبكات العصبية ، والتحكم في نشاط القلب ، واستعادة الرؤية والسمع ، وعلاج إصابات الحبل الشوكي ، وغيرهامن 8،9،10،11،12،13،14. تطبيق ChR2 في أمراض القلب لديه إمكانات كبيرة بسبب وقت الاستجابة بالمللي ثانية15 ، مما يجعله مناسبا تماما للتحكم المستهدف في ديناميكيات القلب غير المنتظمة.

في هذه الدراسة ، يظهر التحفيز الضوئي متعدد المواقع للقلوب السليمة لنموذج الفأر المعدل وراثيا. وبإيجاز، أنشئ خط فأر ألفا - MHC-ChR2 معدل وراثيا في نطاق البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) وتفضلت بتقديمه البروفيسور س. إ. لينارت. بشكل عام ، تم إقران الذكور البالغين المعدلة وراثيا C57 / B6 / J ، التي تعبر عن Cre-recombinase تحت سيطرة alpha-MHC للتزاوج مع الإناث B6.Cg-GT (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J. منذ حذف كاسيت STOP القلبي في الجيل الثاني ، أظهر النسل تعبيرا مستقرا MHC-ChR2 وتم استخدامه للحفاظ على مستعمرات القلب الحساسة للضوء. أجريت جميع التجارب على الفئران البالغة من كلا الجنسين في سن 36 - 48 أسبوعا. يتم تحقيق الإضاءة باستخدام صفيف 3 × 3 micro-LED ، تم تصنيعه كما هو موضح في16,17 باستثناء عدم تنفيذ السكن القائم على السيليكون والألياف الزجاجية البصرية القصيرة. تم العثور على أول استخدام له في تطبيق القلب في18. تم تطبيق مصفوفة micro-LED خطية تعتمد على تقنية تصنيع مماثلة كمسبار اختراق لسرعة القلب19. يتم ترتيب مصابيح LED الدقيقة في صفيف 3 × 3 على درجة 550 ميكرومتر ، مما يوفر دقة مكانية عالية وقوة إشعاع عالية على مساحة صغيرة جدا. يوضح المؤلفون في هذا العمل تحجيما ضوئيا محليا متعدد الاستخدامات متعدد المواقع قد يفتح الطريق لتطوير طرق علاج جديدة مضادة لعدم انتظام ضربات القلب.

يتضمن البروتوكول التجريبي التالي تروية Langendorff الرجعية خارج الجسم الحي ، والتي يعمل فيها الشريان الأورطي المعلب كمدخل تروية. بسبب ضغط التروية المطبق وتقلص القلب ، يتدفق البيرفوسات عبر الشرايين التاجية ، التي تتفرع من الشريان الأورطي. في العمل المقدم ، يتم تشغيل القلب باستخدام إعداد ضغط ثابت يتم تحقيقه عن طريق رفع خزانات البيرفوسات إلى ارتفاع 1 متر ، أي ما يعادل 73.2 مم زئبق ، مما يؤدي إلى معدل تدفق يبلغ 2.633 ± 0.583 مل / دقيقة. يتم استخدام نوعين من محلول Tyrode كعطور أثناء التجربة. يدعم محلول Tyrode العادي إيقاع الجيوب الأنفية المستقر ، في حين يتم خلط محلول Low-K + Tyrode مع Pinacidil لتمكين تحريض عدم انتظام ضربات القلب في قلوب الفئران. يسمح استخدام حمام مائي سداسي الأضلاع بمراقبة القلب من خلال ست نوافذ مستوية مختلفة ، مما يسمح باقتران العديد من المكونات البصرية مع تشوه أقل عن طريق الانكسار.

Protocol

اتبعت جميع التجارب بدقة لائحة رعاية الحيوان ، بالاتفاق مع التشريعات الألمانية ، والأحكام المحلية ، ووفقا لتوصيات الاتحاد الأوروبي لجمعيات علوم المختبرات الأوروبية (FELASA). تمت الموافقة على طلب الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل السلطة المسؤولة عن رعاية الحيوان ، وتم الإبلاغ عن جميع التجارب إلى ممثلي رعاية الحيوان لدينا.

1. إعداد التجربة والمواد

  1. إعداد الخرائط البصرية
    ملاحظة: يظهر الإعداد البصري، وكذلك الإعداد الكهربائي، في الشكل 1. يتم سرد جميع المكونات المستخدمة في الإعداد البصري والكهربائي بالتفصيل في جدول المواد.
    1. استخدم LED 1 و LED 2 لتحريض عدم انتظام ضربات القلب وإزالة الرجفان الاحتياطي. اختر مصابيح LED عالية الطاقة ذات الطول الموجي λالأزرق بالقرب من 475 نانومتر ، وهي ذروة الطول الموجي للإثارة في ChR26. لزيادة تضييق الطيف البصري ، استخدم مرشح ممر النطاق الترددي 470 ± 20 نانومتر.
      ملاحظة: في هذا العمل ، يكون ل LED 1 و LED 2 تدفق إشعاعي نموذجي من 3.9 إلى 5.3 واط ، وفقا لورقة البيانات20.
    2. قم بإضاءة epicardium لرسم الخرائط البصرية باستخدام LED أحمر عالي الطاقة (LED 3 في الشكل 1) ، والذي ينبعث منه ضوء بطول موجي مركزي يبلغ λأحمر = 625 نانومتر وتدفق مشع يبلغ 700 mW21. يتم ترشيح الضوء الأحمر باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 628 ± 20 نانومتر وينعكس بواسطة مرآة ثنائية اللون طويلة المرور (DM) بطول موجي قاطع يبلغ λDM = 685 نانومتر.
    3. استخدم مرشح الانبعاثات معλ filter-cam = 775 ± 70 نانومتر أمام هدف الكاميرا لتسجيل انبعاث التألق للنشاط القلبي فقط. استخدم هدفا سريعا مناسبا تماما لتطبيقات الإضاءة المنخفضة.
      ملاحظة: يتراوح تواتر الرجفان في قلب الفأر من 20 إلى 35 هرتز. لذلك ، استخدم كاميرا سريعة بما يكفي للتسجيل بتردد من 1 إلى 2 كيلو هرتز ، أو حتى أعلى.
  2. صفيف مايكرو إل إي دي
    ملاحظة: يتم تحقيق صفائف micro-LED المطبقة هنا باستخدام معالجة الأنظمة الدقيقة كما هو مفصل في مكان آخر16,17.
    1. قم بتدوير طبقة بوليميد (PI) بسماكة 5 ميكرومتر على ركائز سيليكون مقاس 4 بوصات (مصقولة من جانب واحد ، بسماكة 525 ميكرومتر).
    2. علاج طبقة PI هذه عند درجة حرارة قصوى تبلغ 450 درجة مئوية تحت جو النيتروجين. حافظ على درجة الحرارة القصوى ثابتة لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإيداع ونمط مقاومة ضوئية عكسية للصورة (PR) باستخدام الطباعة الحجرية فوق البنفسجية (UV) وإيداع طبقة بلاتينية رقيقة 250 نانومتر (Pt).
    4. قم بتكثيف هذا التمعدن القائم على Pt عن طريق الطلاء الكهربائي لطبقة ذهبية بسماكة 1 ميكرومتر (Au) مع العلاقات العامة المنقوشة التي تعمل كطبقة إخفاء.
    5. قبل طلاء طبقة PI ثانية ، قم بتعريض الرقاقة بطبقة PI الأولى والمعادن المطلية بالكهرباء Au إلى بلازما أكسجين تنشط كيميائيا سطح طبقة PI.
    6. عالج طبقة PI الثانية مرة أخرى عند 450 درجة مئوية ، وطبق الطباعة الحجرية بالأشعة فوق البنفسجية لنمط طبقة العلاقات العامة وافتح منصات التلامس الخاصة بالمصفوفة لرقائق LED الدقيقة ولوحة الدوائر المطبوعة المتداخلة (PCB) عن طريق النقش الأيوني التفاعلي (RIE) باستخدام PR المزخرف كطبقة إخفاء.
      ملاحظة: في خطوات عملية RIE هذه، يوصى بتطبيق 200 واط و100 واط لمدة 10 و30 دقيقة، على التوالي، لتحديد فتحات لوحة التلامس بالإضافة إلى الشكل الخارجي لصفيف micro-LED ثنائي الأبعاد (2D).
    7. تجريد العلاقات العامة باستخدام المذيبات وحفر البلازما. زيادة سماكة منصات التلامس عن طريق الطلاء الكهربائي لطبقة ذهبية إضافية بسماكة 6 ميكرومتر.
    8. قم بتوصيل رقائق micro-LED بمنصات التلامس باستخدام جهاز ربط رقاقة قابلة للطي.
    9. قم بتنشيط سطح PI في بلازما الأكسجين وقم بملء رقائق micro-LED بمادة لاصقة خالية من المذيبات. علاج ثم المادة اللاصقة لمدة 12 ساعة عند 120 درجة مئوية.
    10. لتغليف رقائق LED الدقيقة ، قم بإجراء معالجة بلازما أخرى باستخدام الأرجون وتطبيق طبقة رقيقة من الفلوروبوليمر يدويا. قبل علاج هذه الطبقة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    11. قم بتطبيق السيليكون يدويا كطبقة تغليف نهائية بعد تعريض صفيف micro-LED لبلازما الأكسجين ، المستخدمة لتحسين التصاق السيليكون بطبقة الفلوروبوليمر الأساسية. علاج طبقة السيليكون عند 80 درجة مئوية و 180 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لكل منهما. هذه الخطوات النهائية للعلاج أيضا علاج طبقة الفلوروبوليمر تماما.
    12. قم بلحام منصات التلامس الخاصة بركيزة PI بلوحة دوائر مطبوعة تحمل موصلات شريطية لتوصيل الصفيف بجهاز خارجي. قم بتغطية منصات اللحام على ثنائي الفينيل متعدد الكلور باستخدام مادة لاصقة.
  3. الإعداد الكهربائي
    1. استخدم أقطاب كهربائية مناسبة لتسجيل مخطط كهربية القلب (ECG)، على سبيل المثال، أقطاب الفضة / كلوريد الفضة أو أقطاب جهد العمل الأحادي (MAP) ومضخم ECG لمراقبة النشاط الكهربائي للقلب بشكل مستمر. علاوة على ذلك ، استخدم جهاز اقتناء مناسب (AD) لتسجيل جميع الإشارات الكهربائية التي تم الحصول عليها.
    2. اختر سائقا مناسبا تماما لمصابيح LED عالية الطاقة (LED 1 و LED 2 و LED 3) ، والتي يمكنها إدارة الحد الأقصى للتيار المطبق على كل جهاز. استخدم مولد وظائف عشوائي (AFG) للتحكم في إخراج برامج تشغيل LED بدقة.
    3. استخدم برنامج تشغيل LED متعدد القنوات للتحكم في التيار المتدفق عبر صفيف LED الصغير. AFG مع مخرجات متعددة مناسبة أيضا لهذه المهمة.
      ملاحظة: من المستحسن اختيار برامج تشغيل LED التي تحد من التيار إلى الحد الأقصى لتيار الصمام الصغير ، وإلا فقد تتلف الثنائيات. تم وصف أحد الأمثلة على برنامج تشغيل micro-LED متعدد القنوات في عمل آخر18. إذا لزم الأمر، قد يتم توصيل AFG أو أي برنامج تشغيل LED آخر بجهاز كمبيوتر للتحكم عن بعد في إعدادات micro-LED. إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بتوصيل برنامج تشغيل LED بالكمبيوتر باستخدام بروتوكول الاتصال الذي تختاره ، على سبيل المثال ، ناقل واجهة الأغراض العامة (GPIB) أو اتصال تسلسلي.

   

2. الإجراءات التجريبية

  1. إعداد الحلول
    1. تحضير محلول Tyrode: 130 mM NaCl ، 4 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 24 mM NaHCO3 ، 1.8 mM CaCl 2 ، 1.2 mM KH2 PO 4 ، 5.6 mM Glucose ، 0.1٪ BSA / Albumin.
    2. تحضير حل Low-K+ Tyrode: يتم تصنيع Low-K + Tyrode بنفس طريقة حل Tyrode العادي باستثناء أنه يتم إضافة نصف كمية KCl فقط (2 mM بدلا من 4 mM KCl).
      ملاحظة: بالنسبة للتجربة التي تدوم 3 ساعات ، عادة ما يكون 2-3 لتر من Tyrode منخفض K + Tyrode (بالإضافة إلى ذلك مختلطا مع Blebbistatin (الخطوة 2.1.5) إذا تم إجراء رسم الخرائط البصرية) و 1-2 لتر من Tyrode العادي كافية.
    3. أضف Pinacidil إلى محلول Low-K + Tyrode لتسهيل عملية تحريض عدم انتظام ضربات القلب ، كما هو موضح في22 ، للحصول على تركيز 100 mM. ارتداء قفازات المختبر الواقية عند التعامل مع Pinacidil.
    4. تحضير 1 مل من 50 ميكرومتر DI-4-ANBDQPQ مع حل Tyrode العادي. حماية الصبغة من الضوء لمنع التبييض الضوئي.
    5. اصنع محلول مخزون 10 mM من Blebbistatin. بالنسبة للرسم الخرائط البصرية، امزج Blebbistatin مع محلول Pinacidil-Tyrode سعة 100 ملليمتر (الخطوة 2.1.3) للحصول على محلول 5 ميكرومتر. ارتداء قفازات المختبر الواقية عند التعامل مع Blebbistatin.
      ملاحظة: احتفظ بكل من الصبغة ومحلول Blebbistatin جانبا حتى يبدأ رسم الخرائط البصرية.
  2. لانغندورف التروية
    ملاحظة: يتكون الإعداد من خزانين لحلي Tyrode. وهي متصلة بفخ فقاعة عبر أنابيب مع ديوك ثلاثية الاتجاهات. يتم توصيل القلب لاحقا بمصيدة الفقاعات بواسطة موصل قفل Luer ، ثم يتم تعليقه في حمام مائي سداسي الأضلاع. الحمام المائي ، بدوره ، متصل بحاوية نفايات لجمع محلول Tyrode المستخدم.
    1. نظف جميع الأنابيب قبل كل تجربة بمياه منزوعة المعادن بالكامل.
    2. قم بتهوية كل من حلول Tyrode باستخدام Carbogen (5٪ CO 2 و 95٪ O2) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجربة. اضبط قيمة الرقم الهيدروجيني لحلول Tyrode إلى 7.4 باستخدام NaOH.
    3. املأ 500 مل من محلول Tyrode في الخزان المقابل وقم بإزالة تهوية الأنابيب وكذلك مصيدة الفقاعات عن طريق تشغيل محلول Tyrode من خلال نظام التروية حتى لا يتم رؤية المزيد من فقاعات الهواء المحاصرة في الأنابيب أو في مصيدة الفقاعة.
    4. استمر في تهوية محاليل Tyrode خلال التجربة بأكملها في الخزانات باستخدام Carbogen لضمان بقاء الرقم الهيدروجيني لل perfusate مستقرا لاحقا أثناء التروية.
    5. قم بتسخين نظام التروية إلى 37 درجة مئوية باستخدام مضخة حرارية للمياه. حافظ على ثبات درجة حرارة العطر داخل الحمام المائي باستخدام عنصر تسخين إضافي مثل كابل تسخين مقاوم للماء.
      ملاحظة: أثناء التجربة، من الأهمية بمكان إعادة ملء خزانات Tyrode قبل أن تصبح فارغة. خلاف ذلك ، يمكن أن تدخل فقاعات الهواء إلى القلب ، والتي يمكن أن تسد الأوعية وتؤدي إلى نقص التروية.
  3. إعداد الماوس
    1. حقن تحت الجلد 0.1 مل من 500 أي الهيبارين 30 دقيقة قبل إجراء عزل القلب.
    2. املأ طبق بتري 6 سم ومحقنة سعة 2 مل بمحلول Tyrode المثلج. ضع تحت المجهر المجسم.
    3. إجراء تخدير قصير الوقت للفئران بواسطة بيئة Isoflurane المشبعة لمدة 2 دقيقة وخلع عنق الرحم الفوري بعد ذلك.
      ملاحظة: من أجل التحقق من التخدير الكافي ، من الضروري للغاية التحقق من المنعكس السلبي بين أصابع القدمين.
    4. افتح الصدر ، وأزل القلب ، كما هو موضح في مكان آخر23 ، وضعه في طبق Petri الذي يبلغ طوله 6 سم مع محلول Tyrode البارد المثلج. سوف يتضاءل ضربات القلب بسبب انخفاض درجة الحرارة.
    5. قم بالتحضير الدقيق تحت المجهر المجسم، كما هو مفصل في مكان آخر23. نعلق الشريان الأورطي على إبرة حادة وإصلاح الوعاء بمادة خياطة.
    6. كعنصر تحكم ، حقن محلول Tyrode البارد من خلال الإبرة في القلب وتحقق من أن القلب مثبت بإحكام. هذه الخطوة أيضا شطف الدم المتبقي من القلب.
    7. انقل القلب المثبت إلى نظام التروية. تأكد من تدفق العطر لمنع الهواء من دخول القلب أثناء توصيل الإبرة بفخ الفقاعة. تحقق من أن القلب مغطى بمحلول Tyrode في الحمام المائي. ويوضح الشكل 2 الخطوات 2-3-4 و2-3-5 و2-3-7.
    8. تأكد من أن القلب يبدأ في النبض في غضون بضع دقائق. دع القلب يتكيف مع إعداد التروية لمدة 15 إلى 20 دقيقة ، ثم انتقل إلى محلول Low K + Tyrode مع Pinacidil (الخطوة 2.1.3) على التوالي محلول Tyrode منخفض K + مع Pinacidil و Blebbistatin (الخطوة 2.1.5) إذا كان سيتم إجراء رسم الخرائط البصرية.
  4. تحريض عدم انتظام ضربات القلب وإزالة الرجفان البصري
    1. ضع أحد أقطاب تخطيط القلب الكهربائي في أقرب مكان ممكن من سطح القلب لضمان جودة إشارة جيدة. قطب ECG الثاني في محلول Tyrode. تأكد من أن ECG المكتسبة يتم تسجيلها بواسطة AD الذي تختاره.
    2. ضع مصفوفة micro-LED في المنطقة التي تهم الدراسة ، على سبيل المثال ، على البطين الأيسر.
    3. قم بتغيير التروية إلى Tyrode منخفض K + مع Pinacidil وقم بتحريك القلب لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
    4. للحث على عدم انتظام ضربات القلب ، قم بإضاءة القلب باستخدام LED 1 و LED 2 بقطار من 20 إلى 50 نبضة ضوئية بتردد f ind من 25 إلى 35 هرتز ، ومدةالنبض Wind من 2 إلى 15 مللي ثانية ، وشدة الضوء LIopt_ind من 2.8 ميجاوات مم-2.
    5. كرر العملية حتى يتم تحفيز عدم انتظام ضربات القلب.
      ملاحظة: من السهل تحديد عدم انتظام ضربات القلب في إشارة تخطيط القلب لأن تردد الإشارة ومورفولوجيتها يختلفان عن إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعي. إذا انتهى عدم انتظام ضربات القلب خلال ال 5 ثوان التالية ، فقم بتصنيفه على أنه إنهاء ذاتي ، وابدأ محاولة تحريض جديدة.
    6. بمجرد اكتشاف عدم انتظام ضربات القلب المستمر بصريا ، قم بتطبيق دفعة من النبضات بعروض مختلفة W def والترددات fdef ، باستخدام ثلاثة أو ستة أو تسعة مصابيح LED دقيقة من الصفيف عندنبضة I الحالية النابضة من 15 mA مما يؤدي إلى شدة الضوء LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. إذا استمر عدم انتظام ضربات القلب بعد خمس تجارب لإزالة الرجفان تعتمد على صفيف LED الصغير ، فقم بتصنيف المحاولة على أنها غير ناجحة وابدأ إزالة الرجفان الاحتياطي.
    8. لإزالة الرجفان الاحتياطي ، استخدم LED 1 و LED 2 باستخدام نفس معلمات التوقيت المحددة لصفيف micro-LED.
      ملاحظة: نظرا لأن القلب يتعرض لإجهاد نقص تروية واستقلابية طوال الفترة التجريبية بأكملها ، فمن الممكن أن تكون محاولات إنهاء عدم انتظام ضربات القلب غير ناجحة حتى مع إزالة الرجفان الاحتياطي. كلما حدث هذا ، قم بتغيير محلول التروية إلى Tyrode العادي واترك القلب يتعافى لمدة 5 إلى 10 دقائق. عندما يعود تخطيط كهربية القلب إلى إيقاع الجيوب الأنفية، كرر البروتوكول من الخطوة 2.4.3 مرة أخرى.
  5. الخرائط البصرية
    1. قم بدمج القلب بمحلول Blebbistatin المعد في الخطوة 2.1.5 وانتظر حتى يحدث فك الارتباط الميكانيكي. يتم تحقيق ذلك عندما يتوقف القلب عن النبض ، ولكن إشارة تخطيط القلب لا تزال قابلة للقياس.
      ملاحظة: إن خلط محلول Blebbistatin مع التركيز المذكور والحفاظ على القلب مندمجا مع هذا المحلول يحافظ على النشاط الميكانيكي للقلب غير المقترن بالنشاط الكهربائي أثناء التجربة بأكملها.
    2. أعط صبغة الجهد 1 مل DI-4-ANBDQPQ (أعدت في الخطوة 2.1.4) كبلعة في فخ الفقاعة من تروية لانغندورف. انتظر لمدة 5 إلى 10 دقائق للسماح للصبغة بأداء القلب بشكل موحد.
      ملاحظة: تجنب التبييض الضوئي للصبغة عن طريق إيقاف تشغيل الضوء الأحمر كلما لم يتم إجراء أي تسجيل. إذا أصبحت نسبة الإشارة إلى الضوضاء في التسجيل صغيرة جدا (الإشارة المكتسبة صاخبة جدا)، كرر الخطوتين 2.1.4 و2.5.2.
    3. ركز الكاميرا على سطح القلب، وقم بتشغيل LED 3، واستخدم طاقة بصرية تبلغ 1.27 ميجاوات مم-2 .
    4. أطفئ أضواء المختبر وابدأ التسجيل. تأكد من الحصول على إشارة بصرية من خلال مقارنة تردد الإشارة التي تم الحصول عليها بتردد تخطيط القلب المسجل. هذا يضمن أن الإشارة الضوئية التي تم الحصول عليها مرتبطة تماما بالنشاط الكهربائي للقلب.
      ملاحظة: نظرا لأن الضوء الفلوري المنبعث من الصبغة هو أسبوع واحد جدا ، يتم رسم الخرائط البصرية في غرفة مظلمة. هذا يتجنب تداخل الإشارة من أي مصادر ضوء أخرى.

النتائج

يسمح البروتوكول بتحريض عدم انتظام ضربات القلب البطيني في قلوب الفئران السليمة باستخدام نبضات التحفيز الضوئي الناتجة عن LED 1 و LED 2 (الشكل 1) بتردد f ind بين 25 هرتز و 35 هرتز ومدة نبض Wind بين 2 مللي ثانية و 10 مللي ثانية. يرجى ملاحظة أن الهدف من هذه النبضات الضوئية السريعة ?...

Discussion

العلاج الناجح لاضطرابات نظم القلب هو مفتاح علاج القلب. ومع ذلك ، فإن الآليات الفيزيائية الحيوية الكامنة وراء بدء عدم انتظام ضربات القلب واستمراره وإنهائه ليست مفهومة تماما. لذلك ، تهدف أبحاث القلب إلى تحسين العلاج بالصدمة الكهربائية نحو إنهاء أكثر لطفا لعدم انتظام ضربات القلب ، وبالتالي ...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا ماريون كونزي وتينا ألتهاوس على دعمهم الفني الممتاز أثناء التجارب. وقد تلقى البحث الذي أدى إلى النتائج تمويلا من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241526. كما تم تقديم الدعم من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، DZHK e.V. (المشروع MD28)، والموقع الشريك Goettingen، ومؤسسة الأبحاث الألمانية CRC 1002 (المشروع C03)، وجمعية ماكس بلانك. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل BrainLinks-BrainTools ، مجموعة التميز التي تمولها مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG ، رقم المنحة EXC 1086).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemical Components
BlebbistatinTargetMolT603810 mM stock solution
BSA/AlbuminSigma-AldrichA4919
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l bottle
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Dye for Optical Mapping
GlucoseSigma-AldrichD9434C6H12O6
HeparinLEO PharmaHeparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid AcidMerck1.09057.1000HCl, 1 M stock solution
IsofluraneCP Pharma1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium ChlorideMerck8.14733.0500MgCl2
Monopotassium PhosphateSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil monohydrateSigma-AldrichP154-500mg10 mM stock solution
Potassium ChlorideSigma-AldrichP5405KCl
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sodium ChlorideSigma-AldrichS5886NaCl
Sodium HydroxideMerck1.09137.1000NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150Biopac SystemsMP150WSWdata acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100CBiopac SystemsECG100CElectrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cableRMS Heating SystemHK-5,0-12Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supplyThorlabsKPS10115 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED DriverThorlabsLEDD1BT-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG ElectrodeHugo Sachs ElektronikBS4 73-0200Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFGAgilent InstrumentsA-2230Arbitrary function generator (AFG)
Signal GeneratorAgilent InstrumentsA-2230AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glueEpoxy TechnologyEPO-TEK 353NDTwo component epoxy
Fluoropolymer Asahi Glass Co. Ltd.Cytop 809MFluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresistMerck KGaAAZ 5214EImage Reversal Resist for High Resolution
LED chip Cree Inc.C460TR2227-S2100Blue micro-LED
PhotoresistMerck KGaAAZ 9260Thick Positive Photoresists
PolyimideUBE Industries Ltd.U-Varnish SPolyimide Solution
SiliconeNuSil Technology LLCMED-6215Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesiveJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue FilterChroma Technology CorporationET470/40xBlue excitation filter
CameraPhotometricsCascade 128+High performance EMCCD Camera
Camera ObjectiveNavitarDO-5095Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic MirrorSemrockFF685-Di02-25x36685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision FilterSemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
HeatsinkAdvanced Thermal SolutionsATSEU-077A-C3-R0Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
LensesLED Engin OsramLLNF-2T06-HLED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meterThorlabsS120VCStandard Photodiode Power Sensor
Power MeterThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter
Red FilterSemrockFF02-628/40-25BrightLine® single-band bandpass filter

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
  21. . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 LED DI 4 ANBDQPQ 2 ChR2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved