Gestion avancée du rythme cardiaque par application d’une photostimulation optogénétique multisite dans les cœurs murins

Résumé

Ce travail rapporte une méthode pour contrôler le rythme cardiaque de cœurs murins intacts de souris transgéniques channelrhodopsin-2 (ChR2) en utilisant la photostimulation locale avec un réseau micro-LED et la cartographie optique simultanée du potentiel de membrane épicardique.

Résumé

Les tachyarythmies ventriculaires sont une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde. La défibrillation électrique utilisant des chocs électriques à haute énergie est actuellement le seul traitement de la fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Cependant, la défibrillation peut avoir des effets secondaires, y compris une douleur intolérable, des lésions tissulaires et une aggravation du pronostic, indiquant un besoin médical important pour le développement de stratégies de gestion du rythme cardiaque plus douces. Outre les approches électriques réductrices d’énergie, l’optogénétique cardiaque a été introduite comme un outil puissant pour influencer l’activité cardiaque en utilisant des canaux ioniques membranaires sensibles à la lumière et des impulsions lumineuses. Dans la présente étude, une méthode robuste et valide pour une photostimulation réussie de cœurs murins intacts perfusés de Langendorff sera décrite sur la base d’une stimulation multisite appliquant un réseau 3 x 3 de microdiodes électroluminescentes (micro-LED). La cartographie optique simultanée des ondes de tension de la membrane épicardique permet d’étudier les effets de la stimulation spécifique à la région et d’évaluer l’activité cardiaque nouvellement induite directement sur place. Les résultats obtenus montrent que l’efficacité de la défibrillation dépend fortement des paramètres choisis pour la photostimulation lors d’une arythmie cardiaque. Il sera démontré que la zone éclairée du cœur joue un rôle crucial pour le succès de l’arrêt ainsi que la façon dont le contrôle ciblé de l’activité cardiaque pendant l’éclairage pour modifier les schémas d’arythmie peut être atteint. En résumé, cette technique offre la possibilité d’optimiser la manipulation du mécanisme sur site sur la voie du contrôle en retour en temps réel du rythme cardiaque et, en ce qui concerne la spécificité de la région, de nouvelles approches pour réduire les dommages potentiels au système cardiaque par rapport à l’utilisation d’applications de choc électrique non spécifiques.

Introduction

Les premières recherches sur la dynamique spatio-temporelle au cours de l’arythmie ont révélé que les schémas électriques complexes au cours de la fibrillation cardiaque sont entraînés par des ondes d’excitation rotatives de type vortex¹. Cette découverte a donné de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents des arythmies, ce qui a ensuite conduit au développement de nouvelles thérapies de terminaison électrique basées sur l’excitation multi-sites du myocarde ^2,3,4. Cependant, les traitements utilisant la stimulation de champ électrique sont non locaux et peuvent innerver toutes les cellules excitables environnantes, y compris le tissu musculaire, causant des dommages cellulaires et tissulaires, ainsi que des douleurs intolérables. Contrairement aux thérapies électriques, les approches optogénétiques fournissent une technique spécifique et protectrice des tissus pour évoquer les potentiels d’action des cardiomyocytes avec une grande précision spatiale et temporelle. Par conséquent, la stimulation optogénétique a le potentiel de contrôler invasivement le moins possible des schémas d’activation chaotiques pendant la fibrillation cardiaque.

L’introduction du canal ionique sensible à la lumière channelrhodopsin-2 (ChR2) dans les cellules excitables par manipulation génétique ^5,6,7, a permis la dépolarisation du potentiel membranaire des cellules excitables par photostimulation. Plusieurs applications médicales, notamment l’activation des réseaux neuronaux, le contrôle de l’activité cardiaque, la restauration de la vision et de l’ouïe, le traitement des lésions de la moelle épinière, et d’autres 8,9,10,11,12,13,14 ont été développées. L’application de ChR2 en cardiologie a un potentiel important en raison de son temps de réponse milliseconde¹⁵, ce qui le rend bien adapté au contrôle ciblé de la dynamique cardiaque arythmique.

Dans cette étude, la photostimulation multisite des cœurs intacts d’un modèle murin transgénique est montrée. En résumé, une lignée de souris transgéniques alpha-MHC-ChR2 a été établie dans le cadre du septième programme-cadre de la Communauté européenne FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) et aimablement fournie par le professeur S. E. Lehnart. En général, les mâles adultes transgéniques C57/B6/J, exprimant la Cre-recombinase sous contrôle de l’alpha-CMH, ont été jumelés pour s’accoupler avec la femelle B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Comme la cassette cardiaque STOP a été supprimée à la deuxième génération, la progéniture a montré une expression stable du CMH-ChR2 et a été utilisée pour maintenir des colonies photosensibles cardiaques. Toutes les expériences ont été effectuées sur des souris adultes des deux sexes âgées de 36 à 48 semaines. L’éclairage est réalisé à l’aide d’un réseau de micro-LED 3 x 3, fabriqué comme décrit en^16,17, sauf que le boîtier à base de silicium et les fibres de verre optiques courtes ne sont pas mis en œuvre. Sa première utilisation dans une application cardiaque se trouve dans¹⁸. Un réseau linéaire de micro-LED basé sur une technologie de fabrication similaire a été appliqué comme sonde pénétrante pour la stimulation cardiaque¹⁹. Les micro-LED sont disposées en un réseau 3 x 3 à un pas de 550 μm, fournissant à la fois une haute résolution spatiale et une puissance rayonnante élevée sur une très petite surface. Les auteurs démontrent dans ce travail une photostimulation multisite locale polyvalente qui pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles méthodes de thérapie antiarythmique.

Le protocole expérimental suivant implique une perfusion de Langendorff rétrograde ex vivo, pour laquelle l’aorte canulée fonctionne comme une entrée de perfusion. En raison de la pression de perfusion appliquée et de la contraction cardiaque, le perfusat circule dans les artères coronaires, qui se ramifient hors de l’aorte. Dans le travail présenté, le cœur est perfusé à l’aide d’une configuration à pression constante obtenue en élevant les réservoirs perfusats à 1 m de hauteur, ce qui équivaut à 73,2 mmHg, ce qui donne un débit de 2,633 ± 0,583 mL / min. Deux types de solution de Tyrode sont utilisés comme perfusat au cours de l’expérience. La solution de Tyrode régulier soutient un rythme sinusal stable, tandis que la solution de Tyrode Low-K⁺ est mélangée avec Pinacidil pour permettre l’induction de l’arythmie dans les cœurs murins. L’utilisation d’un bain-marie hexagonal permet l’observation du cœur à travers six fenêtres planes différentes, permettant le couplage de plusieurs composants optiques avec moins de distorsion par réfraction.

Protocole

Toutes les expériences ont strictement suivi la réglementation sur le bien-être animal, en accord avec la législation allemande, les stipulations locales et conformément aux recommandations de la Fédération des associations européennes de science des animaux de laboratoire (FELASA). La demande d’approbation des expériences sur les animaux a été approuvée par l’autorité responsable du bien-être animal et toutes les expériences ont été signalées à nos représentants du bien-être animal.

1. Préparation et matériel de l’expérience

1. Configuration de la cartographie optique
   REMARQUE : La configuration optique, ainsi que la configuration électrique, sont illustrées à la Figure 1. Tous les composants utilisés dans la configuration optique et électrique sont énumérés en détail dans le tableau des matériaux.
   1. Utilisez LED 1 et LED 2 pour l’induction de l’arythmie et la défibrillation de secours. Choisissez des LED haute puissance avec une longueur d’onde λ_bleue proche de 475 nm, qui est le pic de la longueur d’onde d’excitation de ChR2⁶. Pour réduire davantage le spectre optique, utilisez un filtre passe-bande de 470 ± 20 nm.
      NOTE: Dans ce travail, LED 1 et LED 2 ont un flux radiant typique de 3,9 à 5,3 W, selon la fiche technique²⁰.
   2. Illuminer l’épicarde pour la cartographie optique avec une LED rouge haute puissance (LED 3 sur la figure 1), qui émet de la lumière avec une longueur d’onde centrale de λ_rouge = 625 nm et un flux rayonnant de 700 mW²¹. La lumière rouge est filtrée avec un filtre passe-bande de 628 ± 20 nm et réfléchie par un miroir dichroïque (DM) passe-long avec une longueur d’onde de coupure de λ_DM = 685 nm.
   3. Utilisez un filtre d’émission avec λ_filtre-cames = 775 ± 70 nm devant l’objectif de la caméra pour enregistrer uniquement l’émission de fluorescence de l’activité cardiaque. Utilisez un objectif rapide qui convient bien aux applications à faible luminosité.
      NOTE: La fréquence de fibrillation d’un cœur de souris varie de 20 à 35 Hz; par conséquent, utilisez une caméra assez rapide pour enregistrer avec une fréquence de 1 à 2 kHz, voire plus.
2. Réseau de micro-LED
   NOTE: Les réseaux de micro-LED appliqués ici sont réalisés en utilisant le traitement des microsystèmes comme détaillé ailleurs^16,17.
   1. Enduire de spin une couche de polyimide (PI) de 5 μm d’épaisseur sur des substrats de silicium de 4 pouces (polis simple face, épaisseur de 525 μm).
   2. Durcir cette couche de PI à une température maximale de 450 °C sous atmosphère d’azote. Maintenez la température maximale constante pendant 10 min.
   3. Déposer et modeler une photorésine photosensible (PR) inversée d’image en utilisant la lithographie ultraviolette (UV) et déposer par pulvérisation une fine couche de platine (Pt) de 250 nm.
   4. Épaissir cette métallisation à base de Pt en galvanoplastique une couche d’or (Au) de 1 μm d’épaisseur avec le PR à motifs servant de couche de masquage.
   5. Avant de recouvrir une deuxième couche de PI, exposer la plaquette avec sa première couche de PI et la métallisation électrolytique au à un plasma d’oxygène qui active chimiquement la surface de la couche de PI.
   6. Durcissez à nouveau la deuxième couche PI à 450 °C, appliquez la lithographie UV pour modeler une couche PR et ouvrez les pastilles de contact du réseau pour les puces micro-LED et la carte de circuit imprimé (PCB) d’interfaçage par gravure ionique réactive (RIE) en utilisant le PR à motifs comme couche de masquage.
      REMARQUE: Dans ces étapes de processus RIE, il est recommandé d’appliquer 200 W et 100 W pendant 10 et 30 min, respectivement, pour définir les ouvertures du pavé de contact ainsi que la forme extérieure du réseau micro-LED bidimensionnel (2D).
   7. Décaper le PN à l’aide de solvants et de gravure au plasma. Épaissir davantage les plaquettes de contact en galvanoplastie une couche d’or supplémentaire de 6 μm d’épaisseur.
   8. Fixez les puces micro-LED aux plaquettes de contact à l’aide d’un bonder flip-chip.
   9. Activez la surface PI dans un plasma d’oxygène et remplissez les puces micro-LED avec un adhésif sans solvant. Durcir ensuite l’adhésif pendant 12 h à 120 °C.
   10. Pour encapsuler les puces micro-LED, effectuez un autre traitement plasma avec de l’argon et appliquez manuellement une fine couche de fluoropolymère. Pré-durcir cette couche à 80 °C pendant 1 h.
   11. Appliquer manuellement le silicone comme couche d’encapsulation finale après avoir exposé le réseau micro-LED à un plasma d’oxygène, utilisé pour améliorer l’adhérence du silicium à la couche de fluoropolymère sous-jacente. Durcir la couche de silicone à 80 °C et 180 °C pendant 1 h chacune. Ces dernières étapes de durcissement durcissent également complètement la couche de fluoropolymère.
   12. Souder les pastilles de contact du substrat PI à une carte de circuit imprimé qui transporte des connecteurs de bande pour l’interconnexion de la matrice à une instrumentation externe. Couvrez les tampons de soudure sur le circuit imprimé à l’aide d’un adhésif.
3. Installation électrique
   1. Utilisez des électrodes adaptées à l’enregistrement d’un électrocardiogramme (ECG), par exemple, des électrodes argent/chlorure d’argent ou des électrodes de potentiel d’action monophasique (MAP) et un amplificateur ECG pour surveiller l’activité électrique du cœur en continu. De plus, utilisez un dispositif d’acquisition (AD) approprié pour enregistrer tous les signaux électriques obtenus.
   2. Choisissez un pilote bien adapté aux LED haute puissance (LED 1, LED 2 et LED 3), qui peut gérer le courant maximal appliqué à chaque appareil. Utilisez un générateur de fonctions arbitraires (AFG) pour contrôler avec précision la sortie des pilotes LED.
   3. Utilisez un pilote LED multicanal pour contrôler le courant circulant dans le réseau de micro-LED. Un AFG avec plusieurs sorties convient également à cette tâche.
      REMARQUE: Il est conseillé de choisir des pilotes LED limitant le courant au courant maximum de la micro-LED, sinon les diodes pourraient être endommagées. Un exemple de pilote micro-LED multicanal est décrit dans un autre ouvrage¹⁸. Si nécessaire, l’AFG ou tout autre pilote LED peut être connecté à un ordinateur pour contrôler à distance les paramètres micro-LED. Si tel est le cas, connectez le pilote LED à l’ordinateur avec le protocole de communication de votre choix, par exemple, General Purpose Interface Bus (GPIB) ou une connexion série.

   

2. Procédures expérimentales

1. Préparation de la solution
   1. Préparer la solution de Tyrode : 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM_NaHCO3, 1,8 mM CaCl2, 1,2 mM KH₂PO₄, 5,6 mM Glucose,_0,1% BSA/Albumine.
   2. Préparer la solution de Tyrode Low-K⁺ : Low-K⁺ Tyrode est fabriquée de la même manière que la solution de Tyrode ordinaire, sauf que seulement la moitié de la quantité de KCl est ajoutée (2 mM au lieu de 4 mM KCl).
      NOTE: Pour une expérience d’une durée de 3 heures, généralement 2-3 L de Tyrode Low-K⁺ (en plus mélangé avec de la Blébbistatine (étape 2.1.5) si une cartographie optique est effectuée) et 1-2 L de Tyrode régulier sont suffisants.
   3. Ajouter Pinacidil à la solution de Low-K⁺ Tyrode pour faciliter le processus d’induction de l’arythmie, tel que décrit en²², pour obtenir une concentration de 100 mM. Portez des gants de laboratoire protecteurs lors de la manipulation de Pinacidil.
   4. Préparer 1 mL de DI-4-ANBDQPQ 50 μM avec la solution régulière de Tyrode. Protégez le colorant de la lumière pour éviter le photoblanchiment.
   5. Faire une solution mère de 10 mM de blébbistatine. Pour la cartographie optique, mélanger la blébbistatine avec la solution de Pinacidil-Tyrode à 100 mM (étape 2.1.3) pour obtenir une solution de 5 μM. Porter des gants de laboratoire protecteurs lors de la manipulation de la blébbistatine.
      REMARQUE: Gardez le colorant et la solution de blébbistatine de côté jusqu’à ce que la cartographie optique commence.
2. Perfusion de Langendorff
   REMARQUE: La configuration se compose de deux réservoirs pour les deux solutions du Tyrode. Ils sont reliés à un piège à bulles via des tubes avec des coqs à trois voies. Le cœur est ensuite attaché au piège à bulles par un connecteur de verrouillage Luer, puis suspendu dans un bain-marie hexagonal. Le bain-marie est, à son tour, relié à un conteneur à déchets pour recueillir la solution de Tyrode usagée.
   1. Nettoyez tous les tubes avant chaque expérience avec de l’eau entièrement déminéralisée.
   2. Aérer les deux solutions de Tyrode avec du Carbogen (5% de CO₂ et 95% d’O2) pendant 30 min à température ambiante avant le début de l’expérience. Ajustez la valeur du pH des solutions Tyrode à 7,4 avec NaOH.
   3. Remplir 500 mL de chaque solution de Tyrode dans le réservoir correspondant et désaérer les tubes ainsi que le piège à bulles en faisant passer la solution de Tyrode dans le système de perfusion jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles d’air piégées dans les tubes ou dans le piège à bulles.
   4. Continuer à aérer les solutions du Tyrode pendant toute l’expérience dans les réservoirs avec Carbogen pour s’assurer que le pH du perfusat reste stable plus tard pendant la perfusion.
   5. Chauffer le système de perfusion à 37 °C avec une pompe à chaleur à eau. Maintenez la température du perfusat constante dans le bain-marie en utilisant un élément chauffant supplémentaire tel qu’un câble chauffant étanche.
      NOTE: Au cours de l’expérience, il est crucial de remplir les réservoirs du Tyrode avant qu’ils ne soient vides. Sinon, des bulles d’air peuvent pénétrer dans le cœur, ce qui peut obstruer les vaisseaux et entraîner une ischémie.
3. Préparation de la souris
   1. Injecter par voie sous-cutanée 0,1 mL de 500 I.E. Heparine 30 min avant la procédure d’isolement cardiaque.
   2. Remplissez une boîte de Petri de 6 cm et une seringue de 2 ml avec la solution de Tyrode glacée. Placer sous le microscope stéréoscopique.
   3. Effectuer une anesthésie de courte durée sur des souris dans un environnement saturé d’isoflurane pendant 2 minutes et une luxation cervicale immédiate par la suite.
      REMARQUE: Afin de vérifier une anesthésie suffisante, une vérification du réflexe inter-orteil négatif est absolument nécessaire.
   4. Ouvrez la poitrine, retirez le cœur, comme décrit ailleurs²³, et placez-le dans la boîte de Petri de 6 cm avec la solution de Tyrode glacée. Les battements cardiaques seront diminués en raison de la chute de température.
   5. Faire la préparation fine au microscope stéréoscopique, comme détaillé ailleurs²³. Fixez l’aorte sur l’aiguille émoussée et fixez le vaisseau avec un matériau de suture.
   6. Comme contrôle, injectez la solution de Tyrode glacée à travers l’aiguille dans le cœur et vérifiez que le cœur est bien monté. Cette étape rince également le sang restant du cœur.
   7. Transférer le cœur monté dans le système de perfusion. Assurez-vous que le perfusat circule pour empêcher l’air de pénétrer dans le cœur tout en reliant l’aiguille au piège à bulles. Vérifiez que le cœur est recouvert de la solution de Tyrode au bain-marie. Les étapes 2.3.4, 2.3.5 et 2.3.7 sont illustrées à la figure 2.
   8. Assurez-vous que le cœur commence à battre en quelques minutes. Laissez le cœur s’adapter à la configuration de perfusion pendant 15 à 20 min, puis passez à la solution de Tyrode à faible K+ avec Pinacidil (étape 2.1.3) ou à la solution de Tyrode à faible K⁺ avec Pinacidil et Blebbistatin (étape 2.1.5) si une cartographie optique doit être effectuée.
4. Induction de l’arythmie et défibrillation optique
   1. Placez l’une des électrodes ECG aussi près que possible de la surface du cœur pour assurer une bonne qualité du signal. Suspendre la deuxième électrode ECG dans la solution Tyrode. Assurez-vous que l’ECG acquis est enregistré par l’AD de votre choix.
   2. Placez le réseau de micro-LED sur la zone d’intérêt de l’étude, par exemple, sur le ventricule gauche.
   3. Changez la perfusion en Tyrode à faible K ⁺ avec Pinacidil et perfusez le cœur pendant 15 à 30 minutes.
   4. Pour induire l’arythmie, illuminer le cœur avec LED 1 et LED 2 avec un train de 20 à 50 impulsions lumineuses avec une fréquence f ind de 25 à 35 Hz, une durée d’impulsion W_ind de 2 à 15 ms et une intensité lumineuse LI_{opt_ind} de 2,8 mW ^mm-2.
   5. Répétez le processus jusqu’à ce que l’arythmie soit induite.
      REMARQUE: Les arythmies sont faciles à identifier dans le signal ECG car la fréquence et la morphologie du signal diffèrent du rythme sinusal normal. Si l’arythmie se termine dans les 5 s suivantes, classez-la comme auto-terminée et commencez une nouvelle tentative d’induction.
   6. Une fois qu’une arythmie soutenue est détectée visuellement, appliquez une rafale d’impulsions de différentes largeurs W_def et fréquences f_def, en utilisant trois, six ou neuf micro-LED du réseau à une_impulsion de courant pulsé I de 15 mA cédant à une intensité lumineuse LI_μLED = 33,31 ± 2,05 mW ^mm-2.
   7. Si l’arythmie persiste après cinq essais de défibrillation à base de micro-LED, classez la tentative comme infructueuse et commencez la défibrillation de secours.
   8. Pour la défibrillation de secours, utilisez LED 1 et LED 2 en utilisant les mêmes paramètres de synchronisation que ceux définis pour la matrice micro-LED.
      REMARQUE: Parce que le cœur est exposé à un stress ischémique et métabolique pendant toute la période expérimentale, il est possible que les tentatives d’arrêt de l’arythmie échouent, même avec une défibrillation de secours. Chaque fois que cela se produit, changez la solution de perfusion pour le Tyrode régulier et laissez le cœur récupérer pendant 5 à 10 minutes. Lorsque l’ECG revient au rythme sinusal, répétez le protocole de l’étape 2.4.3.
5. Cartographie optique
   1. Perfuser le cœur avec la solution de Blebbistatin préparée à l’étape 2.1.5 et attendre le découplage mécanique. Ceci est accompli lorsque le cœur cesse de battre, mais un signal ECG est toujours mesurable.
      REMARQUE: Le mélange de la solution de blébbistatine à la concentration mentionnée et le maintien du cœur perfusé avec cette solution maintiennent l’activité mécanique cardiaque découplée de l’activité électrique pendant toute l’expérience.
   2. Donner le colorant de tension de 1 mL DI-4-ANBDQPQ (préparé à l’étape 2.1.4) comme bol dans le piège à bulles de la perfusion de Langendorff. Attendez 5 à 10 minutes pour permettre au colorant de perfuser le cœur uniformément.
      REMARQUE: Évitez le photoblanchiment du colorant en éteignant la lumière rouge chaque fois qu’aucun enregistrement n’est effectué. Si le rapport signal/bruit de l’enregistrement devient trop faible (le signal acquis est trop bruyant), répétez les étapes 2.1.4 et 2.5.2.
   3. Concentrez la caméra sur la surface du cœur, allumez la LED 3 et appliquez une puissance optique de 1,27 mW ^mm-2 .
   4. Éteignez les lumières du laboratoire et commencez l’enregistrement. Assurez-vous qu’un signal optique est acquis en comparant la fréquence du signal obtenu à la fréquence de l’ECG enregistré. Cela garantit que le signal optique obtenu est purement lié à l’activité électrique du cœur.
      REMARQUE: Comme la lumière de fluorescence émise par le colorant est très hebdomadaire, la cartographie optique se fait dans une pièce sombre. Cela évite les interférences de signal provenant de toute autre source lumineuse.

Résultats

Le protocole permet l’induction d’arythmies ventriculaires dans des cœurs murins intacts à l’aide d’impulsions de photostimulation générées par LED 1 et LED 2 (Figure 1) avec une fréquence f ind comprise entre 25 Hz et 35 Hz et une durée d’impulsion W_ind comprise entre 2 ms et 10 ms. Veuillez noter que le but de telles impulsions lumineuses rapides n’est pas de capturer le rythme cardiaque, mais plutôt de déséquilibrer l’activité cardiaque afin ...

Discussion

Un traitement réussi des tachyarythmies cardiaques est la clé de la thérapie cardiaque. Cependant, les mécanismes biophysiques sous-jacents à l’initiation, à la perpétuation et à l’arrêt de l’arythmie ne sont pas entièrement compris. Par conséquent, la recherche cardiaque vise à optimiser la thérapie par choc électrique vers une fin plus douce des arythmies, augmentant ainsi la qualité de vie des patients 28,29,30,31.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical Components
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM stock solution
BSA/Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Carbogen	Westfalen		50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	Dye for Optical Mapping
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	C6H12O6
Heparin	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid	Merck	1.09057.1000	HCl, 1 M stock solution
Isoflurane	CP Pharma		1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride	Merck	8.14733.0500	MgCl2
Monopotassium Phosphate	Sigma-Aldrich	30407	KH2PO4
Pinacidil monohydrate	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM stock solution
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
Sodium Hydroxide	Merck	1.09137.1000	NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable	RMS Heating System	HK-5,0-12	Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply	Thorlabs	KPS101	15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver	Thorlabs	LEDD1B	T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG	Agilent Instruments	A-2230	Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator	Agilent Instruments	A-2230	AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	Two component epoxy
Fluoropolymer	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist	Merck KGaA	AZ 5214E	Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	Blue micro-LED
Photoresist	Merck KGaA	AZ 9260	Thick Positive Photoresists
Polyimide	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	Polyimide Solution
Silicone	NuSil Technology LLC	MED-6215	Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	Blue excitation filter
Camera	Photometrics	Cascade 128+	High performance EMCCD Camera
Camera Objective	Navitar	DO-5095	Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter	Thorlabs	S120VC	Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter	Thorlabs	PM100D	Compact Power and Energy Meter
Red Filter	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® single-band bandpass filter