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Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
本研究では、トランスジェニックチャネルロドプシン-2(ChR2)マウスの無傷マウス心臓の心調律を、マイクロLEDアレイによる局所光刺激と心外膜電位の同時光学マッピングを用いて制御する方法を報告する。
心室頻脈性不整脈は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。高エネルギー電気ショックを用いた電気除細動は、現在、生命を脅かす心室細動の唯一の治療法です。しかし、除細動は耐え難い痛み、組織の損傷、予後の悪化などの副作用をもたらす可能性があり、より穏やかな心調律管理戦略の開発に対する重要な医学的必要性を示しています。エネルギーを低減する電気的アプローチに加えて、心臓オプトジェネティクスは、光感受性膜イオンチャネルと光パルスを使用して心臓の活動に影響を与える強力なツールとして導入されました。本研究では、ランゲンドルフ灌流された無傷のマウス心臓の光刺激を成功させるための堅牢で有効な方法を、3 x 3アレイのマイクロ発光ダイオード(マイクロLED)を適用したマルチサイトペーシングに基づいて説明します。心外膜電圧波の同時光学マッピングにより、領域特異的刺激の効果を調査し、新たに誘発された心臓活動を現場で直接評価することができます。得られた結果は、除細動の有効性が心不整脈の間の光刺激のために選択されたパラメータに強く依存することを示している。心臓の照明領域が重要な役割を果たすことが実証されます 終了の成功と、 不整脈パターンを変更するための照明中の心臓活動の標的制御をどのように達成できるか。要約すると、この技術は、心調律のリアルタイムフィードバック制御に向かう途中で現場でのメカニズム操作を最適化する可能性を提供し、領域特異性に関して、非特異的な電気ショックアプリケーションの使用と比較して心臓系への潜在的な害を減らすための新しいアプローチを提供します。
不整脈時の時空間ダイナミクスの初期の研究により、心細動時の複雑な電気パターンは、渦のような回転励起波によって駆動されることが明らかになりました1。この発見は、不整脈の根底にあるメカニズムについての新しい洞察を与え、心筋の多部位興奮に基づく新しい電気的終結療法の開発につながりました2,3,4。ただし、電界刺激を使用した治療は非局所的であり、筋肉組織を含む周囲のすべての興奮性細胞を神経支配し、細胞および組織の損傷、および耐え難い痛みを引き起こす可能性があります。電気療法とは対照的に、光遺伝学的アプローチは、心筋細胞の活動電位を高い空間的および時間的精度で誘発するための特異的で組織保護的な技術を提供します。したがって、光遺伝学的刺激は、心臓細動中のカオス的活性化パターンの最小限の侵襲的制御の可能性を秘めています。
遺伝子操作5,6,7を介して興奮性細胞に光感受性イオンチャネルロドプシン-2(ChR2)を導入することで、光刺激を使用して興奮性細胞の膜電位の脱分極が可能になりました。ニューロンネットワークの活性化、心臓活動の制御、視力および聴覚の回復、脊髄損傷の治療などを含むいくつかの医学的用途が開発されている8,9,10,11,12,13,14。心臓病学におけるChR2の応用は、そのミリ秒の応答時間15のために大きな可能性を秘めており、不整脈心ダイナミクスの標的制御に非常に適しています。
この研究では、トランスジェニックマウスモデルの無傷の心臓のマルチサイト光刺激が示されています。要約すると、トランスジェニックα-MHC-ChR2マウス株は、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムFP7 / 2007-2013(HEALTH-F2-2009-241526)の範囲内で確立され、S.E.Lehnart教授によって親切に提供されました。一般に、α-MHCの制御下でCre-リコンビナーゼを発現するトランスジェニック成体雄C57/B6/Jは、雌の B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdトマト)Hye/Jと対になっていた。心臓STOPカセットは第2世代で欠失したため、子孫は安定したMHC-ChR2発現を示し、心臓感光性コロニーを維持するために使用されました。全ての実験は、36〜48週齢の両性の成体マウスを用いて行われた。照明は、シリコンベースのハウジングおよび短い光ガラスファイバが実装されていないことを除いて、16,17で説明したように製造された3×3マイクロLEDアレイを用いて達成される。心臓アプリケーションでの最初の使用法は18で発見されました。同様の製造技術に基づく線形マイクロLEDアレイが、心臓ペーシング19のための貫通プローブとして適用されている。マイクロLEDは、550μmピッチで3 x 3アレイに配置され、非常に小さな領域で高い空間分解能と高い放射電力の両方を提供します。著者らは、この研究で、新しい抗不整脈治療法を開発するための道を開く可能性のある、用途の広い局所多部位光刺激を示しています。
以下の実験プロトコルには、逆行性ランゲンドルフ灌流ex vivoが含まれ、そのためにカニューレ大動脈が灌流入口として機能します。加えられた灌流圧と心臓収縮のために、灌流液は大動脈から分岐する冠状動脈を通って流れています。提示された研究では、灌流液リザーバーを1 mの高さ(73.2 mmHgに相当)に上げることによって達成される定圧セットアップを使用して心臓を灌流し、2.633 ± 0.583 mL / minの流量になります。実験中、2種類のTyrode溶液が灌流液として使用されます。通常のTyrodeのソリューションは安定した洞調律をサポートしますが、Low-K + Tyrodeのソリューションはピナシジルと混合して、マウスの心臓に不整脈を誘発することができます。六角形のウォーターバスを使用することで、6つの異なる平面窓を通して心臓を観察することができ、屈折による歪みの少ない複数の光学部品の結合が可能になります。
すべての実験は、ドイツの法律、地域の規定、および欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)の勧告に従って、動物福祉規則に厳密に従いました。動物実験の承認申請は、担当の動物福祉当局によって承認され、すべての実験は動物福祉担当者に報告されました。
1. 実験準備と材料
2. 実験手順
このプロトコルは、LED 1とLED 2(図1)によって生成された光刺激パルスを使用して、無傷のマウス心臓に心室性不整脈を誘導し、周波数f indは25 Hz〜35 Hz、パルス持続時間Windは2ミリ秒から10ミリ秒です。このような急速な光パルスの目的は、心臓のリズムを捉えることではなく、心臓活動のバランスを崩して不規則な電波を発生させ、不整脈を促進すること?...
心臓頻脈性不整脈の治療の成功は、心臓治療の鍵です。しかし、不整脈の開始、永続化、終了の根底にある生物物理学的メカニズムは完全には理解されていません。したがって、心臓研究は、不整脈のより穏やかな終了に向けて電気ショック療法を最適化し、それによって患者の生活の質を向上させることを目的としています28,29,30,31。
著者は利益相反を宣言していません。
著者らは、実験中の優れた技術サポートに対して、マリオン・クンツェとティナ・アルトハウスに感謝したいと思います。この成果につながる研究は、欧州共同体の第7次枠組みプログラムFP7/2007-2013から助成金契約番号HEALTH-F2-2009-241526で資金提供を受けています。ドイツ心臓血管研究センター、DZHK e.V.(プロジェクトMD28)、パートナーサイトゲッティンゲン、ドイツ研究財団CRC 1002(プロジェクトC03)、マックスプランク協会からも支援を受けました。この研究の一部は、ドイツ研究財団(DFG、助成金番号EXC 1086)が資金提供するBrainLinks-BrainTools、クラスターオブエクセレンスによってサポートされました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical Components | |||
Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
Electrical Setup | |||
Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
Hexagonal water bath | |||
LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
micro-LED Array Components | |||
Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
Optical Mapping | |||
Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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