Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

Resumo

Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.

Resumo

As taquiarritmias ventriculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A desfibrilação elétrica usando choques elétricos de alta energia é atualmente o único tratamento para fibrilação ventricular com risco de vida. No entanto, a desfibrilação pode ter efeitos colaterais, incluindo dor intolerável, danos teciduais e piora do prognóstico, indicando uma necessidade médica significativa para o desenvolvimento de estratégias de manejo do ritmo cardíaco mais suaves. Além das abordagens elétricas redutoras de energia, a optogenética cardíaca foi introduzida como uma ferramenta poderosa para influenciar a atividade cardíaca usando canais iônicos de membrana sensíveis à luz e pulsos de luz. No presente estudo, um método robusto e válido para fotoestimulação bem-sucedida de corações murinos intactos perfundidos de Langendorff será descrito com base na estimulação multi-local aplicando uma matriz 3 x 3 de microdiodos emissores de luz (micro-LED). O mapeamento óptico simultâneo das ondas de tensão da membrana epicárdica permite a investigação dos efeitos da estimulação específica da região e avalia a atividade cardíaca recém-induzida diretamente no local. Os resultados obtidos mostram que a eficácia da desfibrilação é fortemente dependente dos parâmetros escolhidos para a fotoestimulação durante uma arritmia cardíaca. Será demonstrado que a área iluminada do coração desempenha um papel crucial para o sucesso da terminação, bem como a forma como o controle direcionado da atividade cardíaca durante a iluminação para modificar os padrões de arritmia pode ser alcançado. Em resumo, essa técnica oferece a possibilidade de otimizar a manipulação do mecanismo no local no caminho para o controle de feedback em tempo real do ritmo cardíaco e, em relação à especificidade da região, novas abordagens na redução do dano potencial ao sistema cardíaco em comparação com o uso de aplicações de choque elétrico não específicas.

Introdução

Investigações iniciais da dinâmica espaço-temporal durante a arritmia revelaram que os complexos padrões elétricos durante a fibrilação cardíaca são impulsionados por ondas de excitação rotativas semelhantes a vórtices¹. Esse achado deu novos insights sobre os mecanismos subjacentes das arritmias, o que levou ao desenvolvimento de novas terapias de terminação elétrica baseadas na excitação multissítio do miocárdio ^2,3,4. No entanto, os tratamentos que utilizam estimulação elétrica de campo não são locais e podem inervar todas as células excitáveis circundantes, incluindo o tecido muscular, causando danos celulares e teciduais, bem como dor intolerável. Em contraste com as terapias elétricas, as abordagens optogenéticas fornecem uma técnica específica e protetora dos tecidos para evocar potenciais de ação de cardiomiócitos com alta precisão espacial e temporal. Portanto, a estimulação optogenética tem o potencial de controle invasivo mínimo dos padrões de ativação caótica durante a fibrilação cardíaca.

A introdução do canal iônico sensível à luz canalrodopsina-2 (ChR2) em células excitáveis via manipulação genética ^5,6,7, possibilitou a despolarização do potencial de membrana de células excitáveis por meio da fotoestimulação. Várias aplicações médicas, incluindo a ativação de redes neuronais, o controle da atividade cardíaca, a restauração da visão e da audição, o tratamento de lesões medulares e outras 8,9,10,11,12,13,14 têm sido desenvolvidas. A aplicação da ChR2 em cardiologia tem potencial significativo devido ao seu tempo de resposta de milissegundos¹⁵, tornando-a adequada para o controle direcionado da dinâmica cardíaca arrítmica.

Neste estudo, a fotoestimulação multi-local de corações intactos de um modelo de rato transgênico é mostrada. Em resumo, foi criada uma linha de ratinhos alfa-MHC-ChR2 transgénicos no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornecida pelo Prof. S. E. Lehnart. Em geral, machos adultos transgênicos C57/B6/J, expressando Cre-recombinase sob controle de alfa-MHC foram pareados para acasalar com fêmeas B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Como o STOP cardíaco foi apagado na segunda geração, a prole apresentou expressão estável de MHC-ChR2 e foi utilizada para manter colônias fotossensíveis cardíacas. Todos os experimentos foram feitos com camundongos adultos de ambos os sexos com uma idade de 36 a 48 semanas. A iluminação é obtida usando uma matriz de micro-LED 3 x 3, fabricada conforme descrito em^16,17, exceto que o invólucro à base de silício e as fibras de vidro ópticas curtas não são implementados. Seu primeiro uso em uma aplicação cardíaca é encontrado em¹⁸. Uma matriz linear de micro-LED baseada em uma tecnologia de fabricação semelhante foi aplicada como uma sonda penetrante para o ritmo cardíaco¹⁹. Os micro-LEDs são dispostos em uma matriz 3 x 3 a um passo de 550 μm, proporcionando uma alta resolução espacial e uma alta potência radiante em uma área muito pequena. Os autores demonstram neste trabalho uma fotoestimulação multissítio local versátil que pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos métodos de terapia antiarrítmica.

O protocolo experimental a seguir envolve uma perfusão retrógrada de Langendorff ex vivo, para a qual a aorta canulada funciona como entrada de perfusão. Devido à pressão de perfusão aplicada e à contração cardíaca, o perfusato está fluindo através das artérias coronárias, que se ramificam da aorta. No trabalho apresentado, o coração é perfundido utilizando-se uma configuração de pressão constante alcançada pela elevação dos reservatórios de perfusato a 1 m de altura, equivalente a 73,2 mmHg, o que resulta em uma vazão de 2,633 ± 0,583 mL/min. Dois tipos de solução de Tyrode's são usados como perfusato durante o experimento. A solução de Tyrode regular suporta um ritmo sinusal estável, enquanto a solução de Tyrode Low-K⁺ é misturada com Pinacidil para permitir a indução de arritmia em corações murinos. O uso de um banho-maria hexagonal permite a observação do coração através de seis janelas planares diferentes, permitindo o acoplamento de vários componentes ópticos com menor distorção por refração.

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Protocolo

Todos os experimentos seguiram estritamente o regulamento de bem-estar animal, de acordo com a legislação alemã, as estipulações locais e de acordo com as recomendações da Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório (FELASA). O pedido de aprovação de experiências em animais foi aprovado pela autoridade responsável pelo bem-estar animal e todas as experiências foram comunicadas aos nossos representantes em matéria de bem-estar animal.

1. Preparação e materiais da experiência

1. Configuração de mapeamento óptico
   NOTA: A configuração óptica, bem como a configuração elétrica, são mostradas na Figura 1. Todos os componentes utilizados na configuração óptica e elétrica estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.
   1. Use LED 1 e LED 2 para indução de arritmia e desfibrilação de backup. Escolha LEDs de alta potência com um comprimento de onda λ_azul perto de 475 nm, que é o pico do comprimento de onda de excitação de ChR2⁶. Para estreitar ainda mais o espectro óptico, use um filtro passa-banda de 470 ± 20 nm.
      NOTA: Neste trabalho, o LED 1 e o LED 2 têm um fluxo radiante típico de 3,9 a 5,3 W, de acordo com a ficha técnica²⁰.
   2. Ilumine o epicárdio para mapeamento óptico com um LED vermelho de alta potência (LED 3 na Figura 1), que emite luz com um comprimento de onda central de λ_vermelho = 625 nm e um fluxo radiante de 700 mW²¹. A luz vermelha é filtrada com um filtro passa-banda de 628 ± 20 nm e refletida por um espelho dicroico de passagem longa (DM) com um comprimento de onda de corte de λ_DM = 685 nm.
   3. Use um filtro de emissão com λ_filter-cam = 775 ± 70 nm na frente da objetiva da câmera para registrar apenas a emissão de fluorescência da atividade cardíaca. Use um objetivo rápido que seja adequado para aplicações com pouca luz.
      NOTA: A frequência de fibrilação de um coração de rato varia de 20 a 35 Hz; portanto, use uma câmera rápida o suficiente para gravar com uma frequência de 1 a 2 kHz, ou até mais.
2. Matriz de micro-LED
   NOTA: As matrizes de micro-LED aplicadas aqui são realizadas usando o processamento de microssistemas, conforme detalhado em outro lugar^16,17.
   1. Gire uma camada de poliimida (PI) de 5 μm de espessura sobre substratos de silício de 4 polegadas (polido de lado único, 525 μm de espessura).
   2. Curar esta camada PI a uma temperatura máxima de 450 °C sob uma atmosfera de azoto. Mantenha a temperatura máxima constante por 10 min.
   3. Depositar e padronizar um fotorresistente de reversão de imagem (PR) usando litografia ultravioleta (UV) e depósito de sputter uma fina camada de platina (Pt) de 250 nm.
   4. Engrosse esta metalização à base de Pt galvanizando uma camada de ouro (Au) de 1 μm de espessura com o PR padronizado servindo como uma camada de mascaramento.
   5. Antes de revestir uma segunda camada PI, exponha a bolacha com sua primeira camada PI e a metalização galvanizada por Au a um plasma de oxigênio que ativa quimicamente a superfície da camada PI.
   6. Cure a segunda camada PI novamente a 450 °C, aplique litografia UV para padronizar uma camada PR e abra as almofadas de contato da matriz para os chips micro-LED e a placa de circuito impresso (PCB) de interface por gravação de íons reativos (RIE) usando o PR padronizado como uma camada de mascaramento.
      NOTA: Nesta etapa do processo RIE, recomenda-se aplicar 200 W e 100 W por 10 e 30 min, respectivamente, para definir as aberturas da almofada de contato, bem como a forma externa da matriz de micro-LED bidimensional (2D).
   7. Retire o PR usando solventes e gravura a plasma. Engrosse ainda mais as almofadas de contato galvanizando uma camada de ouro adicional de 6 μm de espessura.
   8. Conecte os chips micro-LED às almofadas de contato usando um colador flip-chip.
   9. Ative a superfície PI em um plasma de oxigênio e preencha os chips micro-LED com um adesivo sem solvente. Cura, em seguida, o adesivo durante 12 h a 120 °C.
   10. Para encapsular os chips micro-LED, execute outro tratamento de plasma com argônio e aplique uma fina camada de fluoropolímero manualmente. Pré-curar esta camada a 80 °C durante 1 h.
   11. Aplique manualmente o silicone como a camada de encapsulamento final depois de expor a matriz de micro-LED a um plasma de oxigênio, usado para melhorar a adesão do silício à camada subjacente de fluoropolímero. Curar a camada de silicone a 80 °C e 180 °C durante 1 h cada. Essas etapas finais de cura também curam completamente a camada de fluoropolímero.
   12. Solde as almofadas de contato do substrato PI a uma placa de circuito impresso que transporta conectores de tira para interconexão da matriz a uma instrumentação externa. Cubra as almofadas de solda na PCB usando um adesivo.
3. Configuração elétrica
   1. Use eletrodos adequados para registrar um eletrocardiograma (ECG), por exemplo, eletrodos de prata/cloreto de prata ou eletrodos de Potencial de Ação Monofásica (MAP) e um amplificador de ECG para monitorar a atividade elétrica do coração continuamente. Além disso, use um dispositivo de aquisição (DA) apropriado para registrar todos os sinais elétricos obtidos.
   2. Escolha um driver adequado para os LEDs de alta potência (LED 1, LED 2 e LED 3), que possa gerenciar a corrente máxima aplicada a cada dispositivo. Use um gerador de função arbitrária (AFG) para controlar a saída dos drivers LED com precisão.
   3. Use um driver de LED multicanal para controlar a corrente que flui através da matriz de micro-LED. Um AFG com várias saídas também é adequado para essa tarefa.
      NOTA: É aconselhável escolher drivers LED limitando a corrente à corrente máxima do micro-LED, caso contrário, os diodos podem ficar danificados. Um exemplo de um driver micro-LED multicanal é descrito em outro trabalho¹⁸. Se necessário, o AFG ou qualquer outro driver de LED pode estar conectado a um computador para controlar remotamente as configurações de micro-LED. Se este for o caso, conecte o driver LED ao computador com o protocolo de comunicação de sua escolha, por exemplo, GPIB (General Purpose Interface Bus) ou uma conexão serial.

   

2. Procedimentos experimentais

1. Preparação da solução
   1. Preparar a solução da Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO₃, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH₂ PO₄, 5,6 mM de glicose, 0,1% BSA/Albumina.
   2. Prepare a solução Low-K+ Tyrode: Low-K⁺ Tyrode's é feita da mesma forma que a solução Tyrode's regular, exceto que apenas metade da quantidade de KCl é adicionada (2 mM em vez de 4 mM KCl).
      NOTA: Para um experimento com duração de 3 h geralmente 2-3 L de Tyrode Low-K⁺ (adicionalmente misturado com Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for realizado) e 1-2 L de Tyrode regular são suficientes.
   3. Adicionar Pinacidil à solução de Low-K⁺ Tyrode para facilitar o processo de indução de arritmia, conforme descrito em²², para obter uma concentração de 100 mM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Pinacidil.
   4. Preparar 1 ml de 50 μM DI-4-ANBDQPQ com a solução regular de Tyrode. Proteja o corante da luz para evitar o fotobranqueamento.
   5. Faça uma solução de estoque de 10 mM de Blebbistatin. Para o mapeamento óptico, misturar a Blebistatina com a solução de Pinacidil-Tirode a 100 mM (Passo 2.1.3) para obter uma solução de 5 μM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Blebbistatin.
      NOTA: Mantenha o corante e a solução de Blebistatina de lado até que o mapeamento óptico comece.
2. Perfusão Langendorff
   NOTA: A configuração consiste em dois reservatórios para as duas soluções da Tyrode. Eles são conectados a uma armadilha de bolhas através de tubos com galos de três vias. O coração é posteriormente anexado à armadilha de bolhas por um conector de bloqueio Luer, e é então suspenso em um banho de água hexagonal. O banho-maria é, por sua vez, ligado a um contentor de resíduos para recolher a solução utilizada da Tyrode.
   1. Limpe todos os tubos antes de cada experimento com água totalmente desmineralizada.
   2. Arejar ambas as soluções da Tyrode com Carbogen (5% de CO 2 e 95% de O₂) por 30 min à temperatura ambiente antes do início do experimento. Ajustar o valor de pH das soluções de Tyrode para 7,4 com NaOH.
   3. Encha 500 ml de cada solução de Tyrode no reservatório correspondente e desaregue os tubos, bem como a armadilha de bolhas, executando a solução de Tyrode através do sistema de perfusão até que não sejam mais vistas bolhas de ar presas nos tubos ou na armadilha de bolhas.
   4. Continue arejando as soluções de Tyrode durante todo o experimento nos reservatórios com Carbogen para garantir que o pH do perfusato permaneça estável mais tarde durante a perfusão.
   5. Aqueça o sistema de perfusão a 37 °C com uma bomba de calor de água. Mantenha a temperatura do perfusato constante dentro do banho-maria usando um elemento de aquecimento adicional, como um cabo de aquecimento à prova d'água.
      NOTA: Durante o experimento, é crucial reabastecer os reservatórios do Tyrodes antes que eles fiquem vazios. Caso contrário, as bolhas de ar podem entrar no coração, o que pode entupir os vasos e levar à isquemia.
3. Preparação do mouse
   1. Injetar por via subcutânea 0,1 mL de 500 I.E. Heparina 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.
   2. Encha uma placa de Petri de 6 cm e uma seringa de 2 ml com solução de Tyrode gelada. Coloque sob o microscópio estereoscópico.
   3. Realizar anestesia de curto prazo de camundongos por um ambiente saturado de isoflurano por 2 min e luxação cervical imediata depois.
      NOTA: A fim de verificar anestesia suficiente, uma verificação para o reflexo negativo entre os dedos do pé é absolutamente necessária.
   4. Abra o peito, retire o coração, como descrito em outro lugar²³, e coloque-o na placa de Petri de 6 cm com solução gelada de Tyrode. O batimento cardíaco será diminuído devido à queda de temperatura.
   5. Faça a preparação fina sob um microscópio estereoscópico, conforme detalhado em outro lugar²³. Prenda a aorta na agulha contundente e fixe o vaso com material de sutura.
   6. Como controlo, injete a solução de Tyrode gelada através da agulha no coração e verifique se o coração está bem montado. Este passo também enxagua o sangue restante para fora do coração.
   7. Transfira o coração montado para o sistema de perfusão. Certifique-se de que o perfusato está fluindo para evitar que o ar entre no coração enquanto conecta a agulha com a armadilha de bolhas. Verifique se o coração está coberto com a solução de Tyrode's no banho de água. As etapas 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 são ilustradas na Figura 2.
   8. Certifique-se de que o coração comece a bater dentro de alguns minutos. Deixe o coração adaptar-se à configuração de perfusão durante 15 a 20 minutos e, em seguida, mude para a solução de Tyrode de baixo K + com Pinacidil (Passo 2.1.3) respetivamente solução de Tyrode de baixo K ⁺ com Pinacidil e Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for para ser realizado.
4. Indução de arritmia e desfibrilação óptica
   1. Coloque um dos eletrodos de ECG o mais próximo possível da superfície do coração para garantir uma boa qualidade de sinal. Suspender o segundo eléctrodo de ECG na solução de Tyrode. Certifique-se de que o ECG adquirido está sendo registrado pelo DA de escolha.
   2. Coloque a matriz micro-LED na área de interesse do estudo, por exemplo, no ventrículo esquerdo.
   3. Mude a perfusão para Tyrode's low-K⁺ com Pinacidil e perfunda o coração por 15 a 30 min.
   4. Para induzir arritmia, ilumine o coração com LED 1 e LED 2 com um trem de 20 a 50 pulsos de luz com uma frequência f ind de 25 a 35 Hz, duração do pulso W_ind de 2 a 15 ms, e intensidade de luz LI_{opt_ind} de 2,8 mW ^mm-2.
   5. Repita o processo até que a arritmia seja induzida.
      NOTA: As arritmias são fáceis de identificar no sinal de ECG porque a frequência e a morfologia do sinal diferem do ritmo sinusal normal. Se a arritmia terminar dentro dos próximos 5 s, classifique-a como auto-terminada e inicie uma nova tentativa de indução.
   6. Uma vez que uma arritmia sustentada é detectada visualmente, aplique uma explosão de pulsos com diferentes larguras W def e frequências f_def, usando três, seis ou nove micro-LEDs da matriz a um_pulso de corrente pulsante I de 15 mA cedendo a uma intensidade de luz LI_μLED = 33,31 ± 2,05 mW ^mm-2.
   7. Se a arritmia continuar após cinco ensaios de desfibrilação baseados em matriz de micro-LED, classifique a tentativa como malsucedida e inicie a desfibrilação de backup.
   8. Para desfibrilação de backup, use o LED 1 e o LED 2 usando os mesmos parâmetros de temporização definidos para a matriz de micro-LED.
      NOTA: Como o coração é exposto ao estresse isquêmico e metabólico durante todo o período experimental, é possível que as tentativas de terminação da arritmia não sejam bem-sucedidas, mesmo com a desfibrilação de backup. Sempre que isso acontecer, mude a solução de perfusão para o Tyrode regular e deixe o coração se recuperar por 5 a 10 minutos. Quando o ECG retornar ao ritmo sinusal, repita o protocolo da Etapa 2.4.3 novamente.
5. Mapeamento óptico
   1. Perfundir o coração com a solução de Blebistatina preparada na Etapa 2.1.5 e aguardar até que ocorra o desacoplamento mecânico. Isso é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável.
      NOTA: A mistura da solução de Blebistatina à concentração mencionada e a manutenção do coração perfundido com esta solução mantêm a atividade mecânica cardíaca desacoplada da atividade elétrica durante todo o experimento.
   2. Dê o corante de tensão de 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparado na Etapa 2.1.4) como um bolus na armadilha de bolhas da perfusão de Langendorff. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que o corante perfunda o coração uniformemente.
      NOTA: Evite o fotobranqueamento do corante desligando a luz vermelha sempre que nenhuma gravação estiver sendo feita. Se a relação sinal-ruído da gravação se tornar muito pequena (o sinal adquirido é muito ruidoso), repita as etapas 2.1.4 e 2.5.2.
   3. Foque a câmera na superfície do coração, ligue o LED 3 e aplique energia óptica de 1,27 mW ^mm-2 .
   4. Desligue as luzes do laboratório e comece a gravar. Certifique-se de que um sinal óptico está sendo adquirido comparando a frequência do sinal obtido com a frequência do ECG gravado. Isso garante que o sinal óptico obtido esteja puramente relacionado à atividade elétrica do coração.
      NOTA: Como a luz de fluorescência emitida pelo corante é muito semanal, o mapeamento óptico é feito em uma sala escura. Isso evita a interferência de sinal de quaisquer outras fontes de luz.

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Resultados

O protocolo permite a indução de arritmias ventriculares em corações murinos intactos utilizando pulsos de fotoestimulação gerados por LED 1 e LED 2 (Figura 1) com frequência f ind entre 25 Hz e 35 Hz e pulso de duração W_ind entre 2 ms e 10 ms. Observe que o objetivo de tais pulsos de luz rápidos não é capturar o ritmo cardíaco, mas sim desequilibrar a atividade cardíaca para que ondas elétricas erráticas possam ser geradas, o que facilita uma arritmia....

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Discussão

Um tratamento bem-sucedido das taquiarritmias cardíacas é fundamental para a terapia cardíaca. No entanto, os mecanismos biofísicos subjacentes ao início, perpetuação e término da arritmia não são totalmente compreendidos. Portanto, a pesquisa cardíaca visa otimizar a terapia de choque elétrico para uma terminação mais suave das arritmias, aumentando assim a qualidade de vida dos pacientes 28,29,30,31.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical Components
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM stock solution
BSA/Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Carbogen	Westfalen		50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	Dye for Optical Mapping
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	C6H12O6
Heparin	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid	Merck	1.09057.1000	HCl, 1 M stock solution
Isoflurane	CP Pharma		1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride	Merck	8.14733.0500	MgCl2
Monopotassium Phosphate	Sigma-Aldrich	30407	KH2PO4
Pinacidil monohydrate	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM stock solution
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
Sodium Hydroxide	Merck	1.09137.1000	NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable	RMS Heating System	HK-5,0-12	Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply	Thorlabs	KPS101	15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver	Thorlabs	LEDD1B	T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG	Agilent Instruments	A-2230	Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator	Agilent Instruments	A-2230	AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	Two component epoxy
Fluoropolymer	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist	Merck KGaA	AZ 5214E	Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	Blue micro-LED
Photoresist	Merck KGaA	AZ 9260	Thick Positive Photoresists
Polyimide	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	Polyimide Solution
Silicone	NuSil Technology LLC	MED-6215	Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	Blue excitation filter
Camera	Photometrics	Cascade 128+	High performance EMCCD Camera
Camera Objective	Navitar	DO-5095	Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter	Thorlabs	S120VC	Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter	Thorlabs	PM100D	Compact Power and Energy Meter
Red Filter	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® single-band bandpass filter