JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن نصف نظام التعريفي الجهازي الشبكية الأمثل، والتي هي مناسبة لمختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لتوليد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية والكفاءة.

Abstract

أمراض الشبكية التنكسية هي الأسباب الرئيسية للعمى لا رجعة فيه دون علاج فعال. الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي لديها القدرة على التفريق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى أنسجة الشبكية المصغرة، تحمل وعودا ضخمة للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض والعديد من الفرص في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية. ومع ذلك، فإن عملية الحث من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا، نقوم بوصف بروتوكول تحريض شبكية العين الأمثل لتوليد أنسجة الشبكية مع إعادة إنتاج عالية والكفاءة، ومناسبة لمختلف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. يتم تنفيذ هذا البروتوكول دون إضافة حمض الريتينويك ، والذي يفيد إثراء مستقبلات ضوئية مخروطية. ميزة هذا البروتوكول هو تحديد حجم EB وكثافة الطلاء لتعزيز كفاءة وتكرار تحريض الشبكية بشكل كبير. مع هذه الطريقة، تظهر جميع خلايا الشبكية الرئيسية بشكل تسلسلي وتلخص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية. وسوف يسهل تطبيقات المصب، مثل نمذجة الأمراض والعلاج بالخلايا.

Introduction

تتميز الأمراض التنكسية الشبكية (RDs) ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) والتهاب الشبكية الصباغي (RP) ، بضعف ووفاة خلايا المستقبل الضوئي وتؤدي عادة إلى فقدان البصر الذي لا رجعة فيه دون طرق فعالة لعلاج1. الآلية الكامنة وراء هذه الأمراض غير معروفة إلى حد كبير ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج الأمراض البشرية2. على مدى العقود الماضية، تم تحقيق تقدم كبير في الطب التجديدي من خلال تكنولوجيا الخلايا الجذعية. وقد أظهرت العديد من الباحثين، بما في ذلك أنفسنا، أن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs)، يمكن أن تفرق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى الأنسجة الشبكية المصغرة من خلال نهج التمايز المختلفة3،4،5،6،7،8،9،10، 11, توفير إمكانات هائلة في نمذجة المرض والعلاج الخلوي12,13,14.

ومع ذلك ، فإن عملية التعريفي من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة للغاية وتستغرق وقتا طويلا مع تكرار منخفض ، مما يتطلب باحثين ذوي خبرة غنية ومهارات عالية. خلال عملية التعريفي المعقدة والديناميكية ، سيؤثر عدد من العوامل على غلة أنسجة الشبكية15،16،17. أيضا، تختلف أساليب التعريف المختلفة في كثير من الأحيان اختلافا كبيرا في التوقيت والتعبير القوي عن علامات الشبكية، والتي قد تربك جمع العينات وتفسير البيانات3. ولذلك، سيكون هناك طلب على بروتوكول مباشر لتمايز الشبكية عن مركبات الكربون الهيدروفلورية مع توجيه خطوة بخطوة.

هنا، استنادا إلى دراساتنا المنشورة18،19،20،21، يتم وصف بروتوكول تحريض الشبكية الأمثل لتوليد أعضاء الشبكية (ROs) مع مستقبلات ضوئية مخروطية غنية من hPSCs ، والتي لا تتطلب تكملة حمض الريتينويك (RA). يركز هذا البروتوكول على وصف الأسلوب متعدد الخطوات لتوليد الشبكية العصبية وRPE. تشكيل EB هو الجزء الأساسي من مرحلة التعريفي المبكر. يتم تحسين كل من حجم وكثافة الطلاء من EBs كميا، مما يعزز علميا غلة أنسجة الشبكية ويعزز التكرار. في الجزء الثاني من الحث ، تنظم الحويصلات البصرية (OVs) نفسها في ثقافة الالتزام وشكل ROs في ثقافة التعليق ؛ دورات الوقت والكفاءة من هذا الجزء تختلف اختلافا كبيرا في خطوط hPSC مختلفة. نضوج ومواصفات خلايا الشبكية في ROs تحدث أساسا في المرحلة الوسطى والمتأخرة من التعريفي. دون إضافة RA، يمكن إنتاج مستقبلات ضوئية ناضجة مع كل من المخاريط الغنية وقضبان.

الغرض من هذا البروتوكول هو وصف تفاصيل كل خطوة من خطوات الباحثين عديمي الخبرة لتكرارها. وقد تم حث مختلف خطوط hPSC بنجاح في ROs من خلال هذا البروتوكول مع غلة قوية من أنسجة الشبكية الغنية بالمخروط وقابلية التكرار العالية. يمكن لمنظمات المجتمع المدني المشتقة من HPSCs مع هذا البروتوكول تلخيص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية في الجسم الحي، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل ، مما يسهل تطبيقات المصب ، مثل نمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاج بالخلايا.

Protocol

1. ثقافة وتوسيع hPSCs

  1. ثقافة HPSC
    1. معطف اثنين من الآبار من لوحة 6-جيدا مع مصفوفة خارج الخلية (ECM، مصفوفة المؤهلين hESC). إعداد 50 مل من محلول ECM يحتوي على 8-12 ميكروغرام / مل من ECM في متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM). في 49 مل من DMEM، أضف 1 مل من محلول مخزون ECM المذاب (50x). أضف 1 مل من محلول ECM إلى كل بئر من اللوحة ذات 6 آبار. احتضانه لمدة ساعة واحدة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. إعداد صيانة hPSC المتوسطة (MM) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. فترة ما قبل الدفء MM في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    4. إذابة قارورة مبردة من hPSCs (hiPSCs أو hESCs) (حوالي 1 × 106)من خزان النيتروجين السائل عن طريق الحضانة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    5. أخرج القارورة، وطهرها بعناية باستخدام رذاذ الكحول التطهير 75٪. ضعه في خزانة السلامة الحيوية.
    6. نقل تعليق الخلية من القارورة إلى أنبوب 15 مل, إضافة 5 مل من قبل الدافئة MM قطرة قطرة إلى الأنبوب باستخدام ماصة 5 مل. وفي الوقت نفسه، يهز بلطف أنبوب لمزج hPSCs .
    7. الطرد المركزي الأنبوب في 170 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة معظم supernatant باستخدام ماصة 1 مل بعناية وترك وراءه حوالي 50 ميكرولتر من supernatant لتجنب فقدان الخلايا.
    8. إضافة 1 مل من MM إلى الأنبوب، وإعادة إنفاق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا مرة أو مرتين مع ماصة 1 مل.
      ملاحظة: بقاء خلايا مفردة من hPSCs منخفضة. ويفضل كتل الخلايا الصغيرة مع 3-5 خلايا للحفاظ على hPSCs المتنامية في المستعمرات.
    9. إزالة ECM من الآبار المغلفة مسبقا (الخطوة 1.1.1)، إضافة 1.5 مل من MM إلى كل بئر، ومن ثم توزيع 0.5 مل من تعليق الخلية لكل بئر.
    10. هز بلطف لوحة لتوزيع hPSCs بشكل موحد، ووضع لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. لا تحرك لوحة لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز الالتزام الخلية.
    11. تغيير MM كل يومين والمرور hPSCs عندما وصل الالتقاء حوالي 80٪.
  2. تمرير hPSCs
    ملاحظة: صيانة الحالة غير المتمايزة في hPSCs أمر بالغ الأهمية للتطبيقات الأخرى. وفي ظل الظروف الملتصقة، تنمو مركبات الكربون الهيدروفلورية في مستعمرات ذات حدود محددة جيدا. يجب أن يتم تمرير الخلايا عندما يصل التقاء hPSCs إلى حوالي 80٪.
    1. مراقبة الخلايا تحت المجهر. وضع علامة على الخلايا المتمايزة المرئية بوضوح (<5٪)
    2. إعداد لوحة ECM المغلفة كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    3. ما قبل الدافئة MM و 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) دون Ca2 + و Mg2 + في RT.
    4. قبل الحارة 0.5 mM EDTA (في 1x PBS) الحل في حمام مائي في 37 °C.
    5. إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة باستخدام نظام فراغ الطموح، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x في كل بئر لغسل الخلايا باستخدام ماصة 1 مل وكرر مرتين.
    6. إضافة 1 مل من محلول EDTA لكل بئر لتفكيك hPSCs في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق. لا تتجاوز وقت الحضانة الموصى به لتجنب الانفصال عن الخلايا المفردة.
    7. أخرج اللوحة وتحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر. ترخي hPSCs الملتخمة ويمكن رؤية كل حد خلية ، ولكن لا يمكن للخلايا أن تخرج بسهولة عن طريق هز لوحة الخلية بلطف.
    8. إزالة الحل EDTA مع ماصة 1 مل، وإضافة 1 مل من MM لوقف الانفصال. ماصة بلطف hPSCs مرة أو مرتين مع ماصة 1 مل لإعادة إنفاق الخلايا. ليست هناك حاجة إلى الطرد المركزي لجمع الخلايا.
      ملاحظة: إذا كانت معظم الخلايا تأتي من لوحة بعد الحضانة مع EDTA، يمكن جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
    9. إزالة ECM من الآبار المغلفة مسبقا (الخطوة 1.2.2)، وإضافة 1.5 مل من MM لكل بئر.
    10. نقل 150-200 ميكرولتر من كتل الخلية إلى كل بئر. عموما، يمكن تمرير hPSCs بنسبة 1:6. على سبيل المثال، يمكن توزيع خلايا من بئر واحد من لوحة من 6 آبار على ست آبار جديدة.
    11. هز بلطف لوحة لتوزيع hPSCs بشكل موحد والثقافة hPSCs في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة على الأقل دون لمس لوحة.
    12. تغيير MM كل يومين كما هو موضح في الخطوة 1.1.

2. تمايز الشبكية من hPSCs

ملاحظة: عندما تصل المستعمرات ~ 80٪ التقاء (الشكل 1B), يمكن توجيهها للتمييز في organoids الشبكية بعد البروتوكول المخطط في الشكل 1A. لضمان أن تكون مركبات hPSCs ذات جودة عالية وغلة جيدة ، قم بتقييم متعدد المؤشرات بانتظام باستخدام علامات جزيئية مثل OCT4 أو NANOG باستخدام مؤسسة التمويل الدولية أو QPCR. يجب التخلص من مركبات الكربون الهيدروفلورية إذا كانت الخلايا المتمايزة تمثل أكثر من 5٪ من إجمالي الخلايا. تحقق من تلوث الميكوبلازما مع عدة الكشف عن الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام hPSCs خالية من الميكوبلازما فقط كما يمكن أن تغير الميكوبلازما القدرة على التمايز من hPSCs.

  1. إعداد الوسائط والكواشف
    1. إعداد وسيطة التعريفي العصبي (NIM) عن طريق خلط ما يلي: 500 مل من Dulbecco النسر المعدلة المتوسطة / خليط المغذيات F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 مل من 1٪ N2 الملحق, 0.5 مل من 0.1٪ الهيبارين (2 ملغم/مل في 1x PBS), و 5 مل من 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
    2. إعداد وسط تمايز الشبكية (RDM) يحتوي على 300 مل من DMEM/F-12، 200 مل من DMEM الأساسية، 10 مل من 2٪ B27 الملحق، 5 مل من 1٪ مضاد المضادات الحيوية، و 5 مل من 1٪ MEM NEAA.
      ملاحظة: لا تتم تصفية كل من NIM و RDM ولكن يتم إجراء اختبار العقم. أخرج 1 مل من المتوسط وأضفه إلى طبق 35 مم، وثقافة لمدة 3-7 أيام في حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2. يمكن تخزين الوسائط عند درجة حرارة 4 درجات مئوية وينبغي استخدامها في غضون أسبوعين لضمان نشاط المكونات.
    3. إعداد 10 m M Blebbistatin (1000x) في DMSO. إضافة 1,710 ميكرولتر من DMSO لإذابة 5 ملغ من Blebbistatin للحصول على 10 مل محلول المخزون (1,000x), aliquot في 10 ميكرولتر / أنبوب, وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط والكواشف في RT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام، ما لم يذكر خلاف ذلك.
  2. تكوين الجسم الجنيني (EB)
    1. في اليوم 0 (D0)، ابدأ التمايز. إخراج بئر واحد من hPSCs من لوحة 6-جيدا، والتي نمت إلى ~ 80٪ التقاء. جمع الخلايا مع حل الفصام EDTA كما هو موضح في الخطوات 1.2.1 إلى 1.2.6.
    2. إزالة الحل EDTA، إضافة 1 مل من MM تحتوي على 10 ميكرومتر Blebbistatin لوقف تفكك الخلايا، وجمع الخلايا مع ماصة 1 مل. حجم كتل الخلية هو واحد من العوامل الرئيسية التي تؤثر على غلة EBs. ويفضل تقريبا خمس خلايا لكل كتلة لإنتاج الحجم الصحيح من EBs على D5 إلى D7.
      ملاحظة: هذه خطوة أساسية. لا ماصة الخلايا مرات عديدة جدا منذ المجاميع EB مثل من الصعب تشكيل من خلايا واحدة من hPSCs.
    3. نقل تعليق الخلية (حوالي 2 × 106 خلايا) إلى 100 مم فائقة منخفضة مرفق طبق بيتري وإضافة 9 مل من MM تحتوي على 10 ميكرومتر Blebbistatin إلى الطبق.
    4. يهز الطبق برفق مرتين لتوزيع الخلايا بشكل موحد، ووضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2.
    5. على D1، بعد أن يتم استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل، أخرج الطبق ولاحظه تحت المجهر. سيتم تشكيل عدد كبير من مجاميع الخلايا الصغيرة تلقائيا بحلول هذا الوقت(الشكل 1C).
    6. إعداد 12 مل من خليط مع MM و NIM في نسبة 3:1 (9 مل من MM و 3 مل من NIM) في أنبوب 15 مل.
    7. نقل ثقافات الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مع ماصة 10 مل عموديا، وإضافة 10 مل من خليط ما قبل الدفء إلى الطبق.
    8. الطرد المركزي الأنبوب في 60 س ز لمدة 3 دقائق لجمع المجاميع، وإزالة supernatant باستخدام ماصة 5 مل وترك وراءه حوالي 500 ميكرولتر لتجنب فقدان الخلايا.
    9. أضف 2 مل من الخليط إلى الأنبوب، ونقل التعليق إلى نفس الطبق (الخطوة 2.2.7).
    10. يهز الطبق برفق لتوزيع مجاميع الخلية بشكل موحد ، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
    11. على D2، وإعداد 12 مل من خليط جديد مع MM وNIM بنسبة 1:1 (6 مل من MM و 6 مل من NIM) في أنبوب 15 مل. تغيير متوسط الخلية مع خليط الطازجة المعدة عن طريق تكرار الخطوات من 2.2.5 إلى 2.2.10.
    12. على D3، تغيير متوسط الخلية مع 15 مل من NIM كما هو موضح أعلاه. زراعة الخلايا لمدة 5 أيام على الأقل في ظل ظروف التعليق.
      ملاحظة: أثناء D1 إلى D3، يجب تغيير الوسيط كل يوم، وتوفير التغذية الكافية. منذ D3، يمكن تغيير NIM كل يومين. أيضا، يمكن تقسيم EBs إلى عدة أطباق لتوفير التغذية وفيرة.
  3. البذور وEBs
    ملاحظة: في D5 إلى D7، اختر نقطة زمنية مناسبة للوحة EBs على الأطباق المغلفة ب ECM وفقا لحجم EBs. EBs مع قطر تقريبي من 200 ميكرومتر مناسب لتمايز الشبكية. بشكل عام، يمكن أن ينتج بئر واحد من مركبات الكربون الهيدروفلورية في طبق من 6 آبار حوالي 300 إلى 1000 EBs. يختلف اختلاف عائد EB حسب خطوط hPSC.
    1. في D4، قم بإعداد الأطباق المغلفة ب ECM لثقافة أتباع EBs. أضف 5 مل من ECM إلى كل طبق زراعة أنسجة 100 مم (معالج سطحي) ، ووضعها في الحاضنة بين عشية وضحاها.
    2. على D5، قم بإزالة ECM من الأطباق المغلفة مسبقا، وأضف 10 مل من NIM الدافئة مسبقا إلى كل طبق.
    3. أخرج الطبق الذي يحتوي على EBs. تحقق من جودة EBs تحت المجهر وتأكد من أنها مشرقة جدا وجولة في الشكل. يبلغ قطر ال EBs حوالي 200 ميكرومتر. جمع جميع EBs في أنبوب 15 مل. نقل EBs من الأطباق إلى أنبوب 15 مل مع ماصة 5 مل. دع EBs تستقر لمدة 5 دقائق. إزالة معظم supernatant، تاركا وراءه حوالي 2 مل من المتوسطة.
    4. توزيع EBs في الأطباق المغلفة التي تحتوي على 10 مل من NIM قطرة قطرة مع ماصة 1 مل. البذور EBs في كثافة ما يقرب من 2-3 EBs لكل سم2. على سبيل المثال، أضف حوالي 120-180 EBs إلى طبق 100 مم. للحكم تقريبا على رقم EB ، ضع قطرة واحدة من تعليق EB على غطاء ، واحصاء عدد EBs تحت المجهر.
      ملاحظة: كثافة الطلاء من EBs هي واحدة من العوامل الرئيسية التي تؤثر على كفاءة تحريض الشبكية. ويمكن أيضا تعديل الكثافة من قبل كل خط hPSC.
    5. يهز بلطف الأطباق لتوزيع EBs بشكل موحد. وضعها في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: لا تحرك الأطباق لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز التزام EBs.
  4. تحريض الحويصلات البصرية (OVs) وظهارة صبغة الشبكية (RPE) في ظروف التمسك
    ملاحظة: بعد أن يتم بذر EBs على سطح ECM المغلفة، يمكن تطوير hPSCs هياكل تشبه OV، والتي يمكن ملاحظتها في وقت مبكر من D20 بعد التمايز. في هذا البروتوكول, عوامل النمو محددة أو جزيئات الإشارات ليست مطلوبة لتوجيه hPSCs في مصير الشبكية باستثناء إضافة N2 و B27 ملاحق في وسائل الإعلام.
    1. على D8-D9، قم بإزالة الأطباق ومراقبة EBs تحت المجهر. سيتم إرفاق جميع EBs ونشرها على الأطباق(الشكل 1D). أضف 10 مل من NIM الطازجة إلى كل طبق 100 مم يحتوي على 10 مل من المتوسط القديم. أعيدهم إلى الحاضنة
      ملاحظة: لا تقم بإزالة الوسيطة القديمة.
    2. على D12، تغيير نصف المتوسط مع NIM باستخدام ماصة 10 مل. الحفاظ على الثقافة في الحاضنة.
    3. على D16، قم بإزالة جميع NIM من الأطباق باستخدام نظام فراغ الطموح. أضف 20 مل من RDM إلى كل طبق. الحفاظ على زراعة في RDM وتغيير نصف المتوسطة كل يومين.
    4. خلال D10-D30، لاحظ التغيرات المورفولوجية للخلايا مرتين في الأسبوع تحت المجهر وتقييم كفاءة التمايز الشبكي.
      ملاحظة: منذ D10، مجالات مجال العين (EF) هي ذاتية التنظيم في المناطق الطرفية من EBs المنضمة. تظهر الهياكل الشبيهة بOV بين D20 إلى D25 ، تبرز تدريجيا من الطبق ، وتشكل كوبا بطيا ذاتيا ، وهو محاط ب RPE المصطبغ (الشكل 1E). يمكن التعرف على OVs بسهولة مع حلقة NR الساطعة الانكسارية والسميكة.
  5. فصل وثقافة OVs وRPE في تعليق للحصول على organoids الشبكية (ROs)
    1. على D28-D35، تظهر معظم OVs في الأطباق. استخدام إبرة التنغستن أو إبرة مع حقنة 1 مل لفصل ميكانيكيا OVs التعرف عليها شكليا جنبا إلى جنب مع RPE المجاورة. ثقافة لهم في التعليق.
      ملاحظة: مظهر و إنتاجية OVs و RPE تختلف بشكل كبير في خطوط hPSC مختلفة. وبالتالي، فإن النقطة الزمنية لفصل OV و RPE مرنة. يمكن فصل OVs الواضحة مع RPE المجاورة ، ثم نقلها إلى طبق ثقافة مرفق منخفض يحتوي على RDM. استمر في زراعة بقية الخلايا حتى يتم رفع جميع المركبات OVs وRPEs.
    2. وضع 50-60 OVs في كل 100 مم طبق ثقافة مرفق منخفض يحتوي على 15 مل من RDM لتشكيل ROs (الشكل 1F).
    3. تغيير RDM كل 2-3 أيام حتى D42، عندما تكون ROs بشكل جيد مستدير الشكل.

3. نمو الشبكية ونضوجها

ملاحظة: في هذا البروتوكول، مطلوب مصل للحفاظ على ROs تنمو وتنضج للثقافة على المدى الطويل.

  1. صفح الشبكية ومواصفاتها في ROs
    1. إعداد 10 مل من 100 متر تورين (1000x) في برنامج تلفزيوني 1x. وزن 125 ملغ من التورين، وتذوب في 10 مل من 1x برنامج تلفزيوني. تصفية الحل مع مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. Aliquot في 500 ميكرولتر / أنبوب، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. إعداد متوسطة زراعة الشبكية 1 (RC1). خلط المكونات التالية: 250 مل من DMEM/F-12، 175 مل من DMEM الأساسية, 50 مل من مصل الأبقار الجنينية,10 مل من 2٪ ملحق B27, 5 مل من 1٪ مضاد المضادات الحيوية, 5 مل من 1٪ MEM NEAA, 0.5 مل من 100 ميكرومتر تورين, و 5 مل من 2 MM L-alanyl-L-glutamine.
    3. إعداد زراعة الشبكية المتوسطة 2 (RC2) التي تحتوي على 450 مل من DMEM/F-12، 50 مل من مصل الأبقار الجنيني، 5 مل من 1٪ ملحق N2، 5 مل من 1٪ مضاد حيوي مضاد للميكون، 0.5 مل من 100 ميكرومتر تورين، 5 مل من 1٪ MEM NEAA، و 5 مل من 2 mM L-alnyl-L-glutamine.
      ملاحظة: لا تتم تصفية RC1 و RC2، ولكن الخضوع لاختبار العقم. أخرج 1 مل من المتوسط، وأضفه إلى طبق 35 مم، وثقافة لمدة 3-7 أيام في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2،لضمان العقم قبل الاستخدام. يمكن تخزين الوسيط عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، وينبغي استخدامه في غضون أسبوعين لضمان نشاط المكونات. يجب تسخين جميع الوسائط والكواشف مسبقا في RT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    4. على D42، قم بتبديل وسيط الثقافة من RDM إلى RC1.
    5. إمالة الأطباق في حوالي 30 درجة والسماح للROs يستقر لمدة 30 s. إزالة RDM القديمة مع ماصة 10 مل تاركا وراءه حوالي 1 مل من المتوسطة لتجنب فقدان ROs. أضف 15 مل من RC1 الطازج إلى كل طبق.
    6. يهز بلطف الأطباق لتوزيع ROs بشكل موحد. ضع الأطباق في الحاضنة تغيير المتوسط كله مرتين في الأسبوع بعد ذلك.
    7. خلال D50-D90، اختر جودة عالية من ROs للثقافة على المدى الطويل، والتي هي على شكل دائري مع NR سميكة ومشرقة. ضع 30-40 ROs في طبق مرفق منخفض 100 مم مع 20 مل من RC1 ، وغير الوسط بأكمله مرتين في الأسبوع.
    8. لثقافة التعليق على المدى الطويل من ROs، ماصة ROs لتجنب RO-RO إعادة ربط باستخدام ماصة. نقل ROs إلى أطباق الثقافة الجديدة مرة واحدة في الشهر لتجنب ROs التمسك سطح الأطباق.
      ملاحظة: في ظل ظروف ثقافة التعليق، تكون ROs مستديرة الشكل، مع حلقة NR مشرقة وسميكة مرفقة ب RPE أكثر أو أقل على جانب واحد. تتطور شبكية العين العصبية المغلفة وتظهر الأنواع الفرعية لخلايا الشبكية بشكل متسلسل مع خلايا العقدة الشبكية التي تم إنشاؤها لأول مرة ، تليها خلايا المستقبلات الضوئية وخلايا الأماكرين والخلايا ثنائية القطب.
  2. نضوج المستقبل الضوئي البشري مع إثراء المخاريط في ROs
    1. بعد D90، قم بتبديل الوسيط من RC1 إلى RC2، وهو مناسب لنضوج المستقبل الضوئي.
    2. تغيير الوسيطة كما هو موضح في الخطوات 3.1.7-3.1.8.
      ملاحظة: تحت هذه الحالة الثقافة، يمكن أن تنمو ROs على المدى الطويل(الشكل 1G)،حتى D300 اختبارها. خلايا الشبكية في ROs تصبح ناضجة، ويتم أيضا الحصول على جميع الأنواع الفرعية من الخلايا من شبكية العين العصبية، بما في ذلك الخلايا الدبقية مولر، قضبان والمخاريط. دون أي إضافة من RA، مستقبلات ضوئية مخروط غنية أيضا في ROs.

النتائج

عملية تحريض الشبكية في هذا البروتوكول تحاكي تطور شبكية العين الجنينية البشرية. لبدء التمايز الشبكي، تم فصل hPSCs إلى كتل صغيرة ومثقفة في تعليق للحث على تشكيل EBs. على D1، المجاميع الخلية الموحدة أو EBs شكلت(الشكل 1C). تم نقل الوسط الثقافي تدريجيا إلى NIM. على D5 ، كانت مطلية EBs على أطبا...

Discussion

في هذا البروتوكول التعريفي الشبكي متعدد الخطوات، تم توجيه hPSCs خطوة بخطوة للحصول على مصير الشبكية، ونظمت ذاتيا في organoids الشبكية التي تحتوي على NR مغلفة وRPE. خلال التمايز، قامت hPSCs بتلخيص جميع الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية البشرية في الجسم الحي، من EF و OV و RPE ، إلى صفح الشبكية ، مما أدى إل?...

Disclosures

Xiufeng تشونغ هو مخترع براءات الاختراع المتعلقة بتوليد خلايا الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFC1101103، 2017YFA0104101)، وصندوق مشروع العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (201803010078)، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (2017B020230003)، ومؤسسة العلوم الطبيعية (NSF) في الصين (81570874، 81970842)، وبرنامج مائة موهبة من جامعة صن يات صن (PT1001010)، وصناديق البحوث الأساسية في المختبر الرئيسي للدولة لطب العيون.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(−)-BlebbistatinSigmaB0560-5mgROCK-inhibitor
1 ml tipsKirgenKG13131 ml
10 ml pipetteSorfa3141001Pipette
100 mm Tissue cultureBIOFILTCD000100100 mm Petri dish
100 mm Tissue cultureFalcon353003100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011150Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishesFalcon35300135 mm Petri dish
5 ml pipetteSorfa313000Pipette
50 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011500Centrifuge tubes
6 wells tissue culture platesCostar3516Culture plates
Anti-AP2α AntibodyDSHB3b5Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100XGibco15240062Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 AntibodyBosterBM4446Primary antibody
Anti-Ki67 AntibodyAbcamab15580Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibodygift from Dr. jeremy/Primary antibody
Anti-PAX6 AntibodyDSHBpax6Primary antibody
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin AntibodyMilliporeab5585Primary antibody
Anti-Rhodopsin AntibodyAbcamab5417Primary antibody
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 AntibodyAbclonalA19710Primary antibody
Anti-VSX2 AntibodyMilliporeab9016Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Supplement
Cryotube vialThermo scientific-NUNC3754181.8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLMultiple suppliers
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200.5 M PH 8.0
FBSNATOCORSFBESerum
FilterMilliporeSLGP033RB0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparinSigmaH31492 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100xCorning354277Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1STEM CELL85850hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplementGibco17502048Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) bufferGNMGNM10010Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
TaurineSigmaT0625Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachmentCorningCLS3262-20EAPetri dish

References

  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved