Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Résumé

Les maladies dégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité irréversible sans traitement efficace. Les cellules souches pluripotentes qui ont le potentiel de se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens, sont très prometteuses pour les patients atteints de ces maladies et offrent de nombreuses possibilités dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Nous décrivons ici un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées, adaptés à diverses cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole est réalisé sans ajout d’acide rétinoïque, ce qui profite à l’enrichissement des photorécepteurs coniques. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne. Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera les applications en aval, telles que la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire.

Introduction

Les maladies dégénératives de la rétine (MR), telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinite pigmentaire (RP), sont caractérisées par le dysfonctionnement et la mort des cellules photoréceptrices et entraînent généralement une perte de vision irréversible sans moyens efficaces de guérir¹. Le mécanisme sous-jacent à ces maladies est largement inconnu en partie en raison de l’absence de modèles de maladies humaines². Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés en médecine régénérative grâce à la technologie des cellules souches. De nombreux chercheurs, y compris nous....

Protocole

1. Culture et expansion des CSEh

1. Culture HPSC
   1. Recouvrir deux puits d’une plaque de 6 puits avec matrice extracellulaire (ECM, matrice qualifiée hESC). Préparer 50 mL d’une solution ECM contenant 8-12 μg/mL d’ECM dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Dans 49 mL de DMEM, ajouter 1 mL de la solution mère ECM décongelée (50x). Ajouter 1 mL de la solution ECM à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C et 5% de_CO2.
   2. Préparez le support d’entretien hPSC (MM) conformément aux instructions du fabricant.
   3. Préchauffer MM à température ambiante (RT) pendant....

Résultats

Le processus d’induction rétinienne dans ce protocole imite le développement de la rétine fœtale humaine. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension pour induire la formation d’EBs. Sur D1, les agrégats cellulaires uniformes ou EBs se sont formés (Figure 1C). Le milieu de culture a été progressivement transféré en NIM. Sur D5, les ÉBs ont été plaqués sur les plats de culture enrobés d’ECM. Les.......

Discussion

Dans ce protocole d’induction rétinienne en plusieurs étapes, les CSEh ont été guidés étape par étape pour gagner le destin rétinien et auto-organisés en organoïdes rétiniens contenant des NR et des EPR stratifiés. Au cours de la différenciation, les CSEh ont récapitulé toutes les principales étapes du développement rétinien humain in vivo,de l’EF, de l’OV et de l’EPR à la stratification rétinienne, générant tous les sous-types de cellules rétiniennes, y compris les cellules gangli.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Blebbistatin	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibitor
1 ml tips	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipette	Sorfa	3141001	Pipette
100 mm Tissue culture	BIOFIL	TCD000100	100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture	Falcon	353003	100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150	Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes	Falcon	353001	35 mm Petri dish
5 ml pipette	Sorfa	313000	Pipette
50 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500	Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates	Costar	3516	Culture plates
Anti-AP2α Antibody	DSHB	3b5	Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X	Gibco	15240062	Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody	Boster	BM4446	Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody	Abcam	ab15580	Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody	gift from Dr. jeremy	/	Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody	DSHB	pax6	Primary antibody
Anti-rabbit 555	Invitrogen	A31572	Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody	Millipore	ab5585	Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody	Abcam	ab5417	Primary antibody
Anti-sheep 555	Invitrogen	A21436	Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody	Abclonal	A19710	Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody	Millipore	ab9016	Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Supplement
Cryotube vial	Thermo scientific-NUNC	375418	1.8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Multiple suppliers
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medium
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medium
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Serum
Filter	Millipore	SLGP033RB	0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine
Heparin	Sigma	H3149	2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement	Gibco	17502048	Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer	GNM	GNM10010	Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine	Sigma	T0625	Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment	Corning	CLS3262-20EA	Petri dish