JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

Abstract

מחלות ניווניות ברשתית הן הגורמים העיקריים לעיוורון בלתי הפיך ללא טיפול יעיל. תאי גזע פלוריפוטנטים בעלי פוטנציאל להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית, מחזיקים בהבטחות עצומות לחולים במחלות אלה ובהזדמנויות רבות במודל מחלות ובהקרנת תרופות. עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך וגוזל זמן רב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטב כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה, מתאים לתאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים. פרוטוקול זה מבוצע ללא תוספת של חומצה רטינואית, אשר מועיל העשרה של קולטני חרוט. היתרון של פרוטוקול זה הוא כימות גודל EB וצפיפות ציפוי כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות ואת יכולת החזרה של אינדוקציה רשתית. בשיטה זו, כל תאי הרשתית העיקריים מופיעים ברצף ומשיבים מחדש את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית. זה יקל על יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות וטיפול בתאים.

Introduction

מחלות ניווניות ברשתית (RDs), כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מאופיינות בתפקוד ובמותם של תאי פוטורצפטור ובדרך כלל מובילות לאובדן ראייה בלתי הפיך ללא דרכים יעילות לרפא1. המנגנון שבביסן מחלות אלה אינו ידוע במידה רבה חלקית בשל היעדר מודלים למחלות אנושיות2. בעשורים האחרונים הושגה התקדמות משמעותית ברפואה רגנרטיבית באמצעות טכנולוגיית תאי גזע. חוקרים רבים, כולל עצמנו, הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (hiPSCs), יכולים להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית באמצעות גישות שונות של בידול3,4,5,6,7,8,9,10, 11,מתן פוטנציאל עצום בדוגמנות מחלות וטיפולבתאים 12,13,14.

עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך מאוד זמן רב עם יכולת חזרה נמוכה, אשר דורש חוקרים עם ניסיון עשיר וכישורים גבוהים. במהלך תהליך האינדוקציה המורכב והדינמי, מספר גורמים ישפיעו על התשואה של רקמות הרשתית15,16,17. כמו כן, שיטות אינדוקציה שונות משתנות לעתים קרובות במידה ניכרת בתזמון ובביטוי חזק של סמני רשתית, אשר עשוי לבלבל את איסוף המדגם ואת פרשנות הנתונים3. לכן, פרוטוקול פשוט של בידול רשתית מ hPSCs עם הדרכה צעד אחר צעד יהיה ביקוש.

כאן, בהתבסס על המחקרים שפורסמו שלנו18,19,20,21, פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטבת כדי ליצור organoids רשתית (ROs) עם קולטני חרוט עשירים מן hPSCs מתואר, אשר אינו דורש תוספת של חומצה רטינואית (RA). פרוטוקול זה מתמקד בתיאור השיטה הרב-שלבים ליצירת רשתית עצבית ו- RPE. היווצרות EB היא החלק החיוני של שלב האינדוקציה המוקדמת. הן גודל וצפיפות ציפוי של EBs הם אופטימיזציה כמותית, אשר מדעית משפר את התשואה של רקמות רשתית ומקדם חזרה. בחלק השני של האינדוקציה, שלטי אופטיים (OVs) מתארגנים את עצמם בתרבות הדבקות ובצורת ROs בתרבות ההשעיה; קורסי הזמן והיעילות של חלק זה משתנים במידה ניכרת בשורות hPSC שונות. ההבשלה והמפרט של תאי הרשתית ב- ROs מתרחשים בעיקר בשלב האמצעי והמאוחר של האינדוקציה. ללא תוספת של RA, קולטני פוטו בוגרים עם קונוסים ומוטות עשירים יכולים להיות מיוצרים.

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר ולפרט כמותית כל שלב שחוקרים חסרי ניסיון יחזרו על עצמם. קווי hPSC שונים הושרו בהצלחה לתוך ROs על ידי פרוטוקול זה עם תשואה חזקה של רקמות רשתית עשירות חרוט ויכולת חזרה גבוהה. ROs שמקורם ב- HPSCs עם פרוטוקול זה יכולים לשחזר את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית ב- vivo, ולשרוד לטווח ארוך, המאפשר יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות, הקרנת תרופות וטיפול בתאים.

Protocol

1. תרבות והרחבה של hPSCs

  1. תרבות HPSC
    1. יש מעיל שתי בארות של צלחת 6-טוב עם מטריצה חוץ תאית (ECM, מטריצה מוסמכת hESC). הכן 50 מ"ל של פתרון ECM המכיל 8-12 מיקרוגרם / מ"ל של ECM במדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM). ב 49 מ"ל של DMEM, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מלאי ECM מופשר (50x). הוסף 1 מ"ל של פתרון ECM לכל באר של צלחת 6-טוב. לדגור אותו במשך 1 שעות באינקובטור ב 37 °C (5% CO2).
    2. הכן אמצעי תחזוקה hPSC (MM) בהתאם להוראת היצרן.
    3. MM חם מראש בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות.
    4. להפשיר בריון קריוגני של hPSCs (hiPSCs או hESCs) (כ 1 x 106) ממיכל חנקן נוזלי על ידי דגירה באמבט מים ב 37 °C (30 °F) עבור 30 s.
    5. מוציאים את הנקניקיון, ומחטאים אותו בזהירות באמצעות תרסיס אלכוהול חיטוי של 75%. שים את זה בארון בטיחות ביולוגית.
    6. העבר את ההשעיה התא מן המשחקון לצינור 15 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל של טיפת MM מחומם מראש טיפה על ידי טיפה לצינור באמצעות פיפטה 5 מ"ל. בינתיים, בעדינות לנער את הצינור כדי לערבב את hPSCs .
    7. צנטריפוגה הצינור ב 170 x g במשך 5 דקות. הסר את רוב supernatant באמצעות 1 מ"ל pipette בזהירות ולהשאיר מאחור על 50 μL של supernatant כדי למנוע לאבד את התאים.
    8. הוסף 1 מ"ל של MM לצינור, ו resuspend הכדור על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה פעם או פעמיים עם pipette 1 מ"ל.
      הערה: ההישרדות של תאים בודדים של hPSCs נמוכה. גושי תאים קטנים עם 3-5 תאים מועדפים לשמור על hPSCs גדל במושבות.
    9. הסר ECM מהבארות מצופות מראש (שלב 1.1.1), הוסף 1.5 מ"ל של MM לכל באר ולאחר מכן הפץ 0.5 מ"ל של השעיית תאים לבאר.
    10. לנער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את hPSCs באופן אחיד, ולשים את הצלחת באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO2. אין להזיז את הצלחת לפחות 24 שעות כדי לקדם דבקות בתא.
    11. לשנות MM כל יומיים ולעבר את hPSCs כאשר המפגש הגיע כ 80%.
  2. העברת hPSCs
    הערה: התחזוקה של המצב הלא מופשט ב- hPSCs היא קריטית למדי עבור יישומים נוספים. בתנאים החסידיים, hPSCs לגדול במושבות עם גבול מוגדר היטב. יש לעבור את התאים כאשר המפגש של hPSCs מגיע על 80%.
    1. שים לב לתאים מתחת למיקרוסקופ. סמן והסר באופן מכני את התאים המובחנים הנראים בבירור (<5%) לפני המעבר.
    2. הכן את הצלחת מצופה ECM כמתואר בשלב 1.1.1.
    3. MM חם מראש 1x תמיסת מלח פוספט (PBS) ללא Ca2+ ו מ"ג2 + ב- RT.
    4. לחמם מראש את 0.5 mM EDTA (ב 1x PBS) פתרון באמבט מים ב 37 °C (5 °F).
    5. הסר את המדיום מצלחת התרבות באמצעות מערכת שאיפת ואקום, להוסיף 1 מ"ל של 1x PBS בכל באר לשטוף את התאים באמצעות פיפטה 1 מ"ל ולחזור פעמיים.
    6. הוסף 1 מ"ל של פתרון EDTA לבאר כדי לנתק את hPSCs בחממה תרבית התא ב 37 °C (5% CO2) במשך 5 דקות. אין לחרוג מזמן הדגירה המומלץ על מנת למנוע ניתוק לתאים בודדים.
    7. מוציאים את הצלחת ובודקים אם יש ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ. hPSCs המצטבר להשתחרר וכל גבול תא ניתן לראות, אבל התאים לא יכולים בקלות לרדת על ידי ניעור בעדינות את צלחת התא.
    8. הסר את פתרון EDTA עם pipette 1 מ"ל, ולהוסיף 1 מ"ל של MM כדי לעצור את הניתוק. צנרת בעדינות את hPSCs פעם או פעמיים עם pipette 1 מ"ל כדי resuspend התאים. אין צורך לצנטריפוגה כדי לאסוף את התאים.
      הערה: אם רוב התאים יורדים מהצלחת לאחר הדגירה עם EDTA, תאים ניתן לאסוף על ידי צנטריפוגה.
    9. הסר ECM מהבארות מצופות מראש (שלב 1.2.2), ולהוסיף 1.5 מ"ל של MM לבאר.
    10. העבר 150-200 μL של גושי תאים לכל באר. בדרך כלל, hPSCs ניתן לעבור ביחס של 1:6. לדוגמה, תאים מבאר אחת של צלחת 6-באר ניתן להפיץ לשש בארות חדשות.
    11. לנער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את hPSCs באופן אחיד ותרבות hPSCs באינקובטור ב 37 °C (5% CO2 עבור לפחות 24 שעות מבלי לגעת בצלחת.
    12. החלף MM כל יומיים כמתואר בשלב 1.1.

2. הבחנה ברשתית מ- hPSCs

הערה: כאשר המושבות מגיעות למפגש של כ-80% (איור 1B),ניתן להנחות אותם להבדיל לאורגנואידים ברשתית בעקבות הפרוטוקול שנוקט באיור 1A. כדי להבטיח hPSCs יש איכות גבוהה ותפוקה טובה, באופן קבוע להעריך את pluripotency עם סמנים מולקולריים כגון OCT4 או NANOG באמצעות IFC או QPCR. יש למחוק מחשבי HPSCs אם תאים מובחנים מהווים יותר מ- 5% מכלל התאים. בדוק אם יש זיהום mycoplasma עם ערכת זיהוי mycoplasma על פי הוראות היצרן. השתמש רק hPSCs ללא mycoplasma כמו mycoplasma יכול לשנות את יכולת הבידול של hPSCs.

  1. הכנת מדיה ות reagents
    1. הכן מדיום אינדוקציה עצבית (NIM) על ידי ערבוב הדברים הבאים: 500 מ"ל של תערובת נשר בינוני/מינון F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 מ"ל של תוספת N2% 1%, 0.5 מ"ל של 0.1% הפרין (2 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS), ו-5 מ"ל של 1% חומצות אמינו לא חיוניות MEM (NEAA).
    2. הכן בינוני בידול רשתית (RDM) המכיל 300 מ"ל של DMEM / F-12, 200 מ"ל של DMEM בסיסי, 10 מ"ל של תוספת 2% B27, 5 מ"ל של 1% אנטי ממיקוטיקה אנטיביוטית, ו 5 מ"ל של 1% MEM NEAA.
      הערה: הן NIM והן RDM אינם מסוננים אך מתבצעת בדיקת סטריליות. מוציאים 1 מ"ל בינוני ומוסיפים אותו לצלחת 35 מ"מ, ותרבות במשך 3-7 ימים באינקובטור ב 37 °C (5%) ניתן לאחסן את המדיה ב 4 °C (50 °F) ויש להשתמש בה תוך שבועיים כדי להבטיח את פעילות הרכיבים.
    3. הכן 10 מ"מ Blebbistatin (1,000x) ב- DMSO. הוסף 1,710 μL של DMSO כדי להמיס 5 מ"ג של Blebbistatin כדי להשיג פתרון מלאי 10 mM (1,000x), aliquot ב 10 μL / tube, ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
      הערה: יש לחמם את כל המדיה והריגנטים ב- RT למשך 30 דקות לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת.
  2. היווצרות גוף עוברי (EB)
    1. ביום 0 (D0), ליזום את ההבחנה. הוציאו באר אחת של hPSCs מצלחת 6-well, אשר גדל ~ 80% מפגש. לאסוף את התאים עם פתרון דיסוציאציה EDTA כמתואר בשלבים 1.2.1 עד 1.2.6.
    2. הסר את פתרון EDTA, להוסיף 1 מ"ל של MM המכיל 10 μM Blebbistatin כדי לעצור את דיסוציאציה התא, ולאסוף את התאים עם pipette 1 מ"ל. גודל גושי התאים הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על התשואה של EBs. בערך, חמישה תאים לכל גוש עדיפים לייצר את הגודל הנכון של EBs על D5 עד D7.
      הערה: זהו שלב מפתח. אין pipette התאים יותר מדי פעמים מאז אגרגטים דמויי EB קשה ליצור מתאים בודדים של hPSCs.
    3. העבר את מתלה התא (כ 2 x 106 תאים) לצלחת פטרי מצורף אולטרה נמוך 100 מ"מ ולהוסיף 9 מ"ל של MM המכיל 10 μM Blebbistatin לצלחת.
    4. לנער בעדינות את המנה פעמיים כדי להפיץ את התאים באופן אחיד, ולשים את המנה באינקובטור ב 37 °C (5% CO2).
    5. ב- D1, לאחר התאים הם תרבית לפחות 24 שעות, להוציא את המנה ולצפות בו מתחת למיקרוסקופ. מספר גדול של צבירי התאים הקטנים ייווצרו באופן ספונטני בשלב זה (איור 1C).
    6. הכן 12 מ"ל של תערובת עם MM ו- NIM ביחס של 3:1 (9 מ"ל של MM ו- 3 מ"ל של NIM) בצינור 15 מ"ל.
    7. מעבירים את תרביות התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם פיפטה של 10 מ"ל בניצב, ומוסיפים 10 מ"ל מהתערובת החמימה מראש למנה.
    8. צנטריפוגות הצינור ב 60 x g במשך 3 דקות כדי לאסוף את האגרגטים, להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 5 מ"ל ולהשאיר מאחור על 500 μL כדי למנוע אובדן תאים.
    9. מוסיפים 2 מ"ל מהתערובת לצינור, ומעבירים את המתלים לאותה מנה (שלב 2.2.7).
    10. מנערים בעדינות את המנה כדי לפזר באופן אחיד את אגרגלי התא, ומחזירים את המנה לאינקובטור.
    11. על D2, להכין 12 מ"ל של תערובת חדשה עם MM ו- NIM ביחס 1:1 (6 מ"ל של MM ו 6 מ"ל של NIM) בצינור 15 מ"ל. לשנות את התא בינוני עם תערובת מוכן טרי על ידי חזרה על השלבים מ 2.2.5 ל 2.2.10.
    12. ב- D3, שנה את התא מדיום עם 15 מ"ל של NIM כמתואר לעיל. תרבית התאים לפחות 5 ימים בתנאי ההשעיה.
      הערה: במהלך D1 עד D3, המדיום צריך להיות שונה בכל יום, מתן תזונה מספקת. מאז D3, NIM ניתן לשנות כל יומיים. כמו כן, EBs ניתן לחלק למספר מנות כדי לספק תזונה בשפע.
  3. זרע את EBs
    הערה: ב- D5 עד D7, בחר נקודת זמן מתאימה לצלחת ה- EBs על הכלים מצופים ECM בהתאם לגודל ה- EBs. EBs עם קוטר משוער של 200 מיקרומטר מתאים לבידול הרשתית. באופן כללי, באר אחת של hPSCs בצלחת 6-באר יכול לייצר על 300 עד 1,000 EBs. השונות של תשואת EB משתנה על ידי קווי hPSC.
    1. ב-D4, הכינו מנות מצופות ECM לתרבות החסידות של EBs. מוסיפים 5 מ"ל של ECM לכל צלחת תרבית רקמות של 100 מ"מ (פני השטח מטופלים), ומכניסים אותם לאינקובטור למשך הלילה.
    2. ב- D5, הסירו את ECM מהמנות המצולפות מראש, והוסיפו 10 מ"ל של NIM מחומם מראש לכל מנה.
    3. מוציאים את המנה המכילה EBs. בדוק את האיכות של EBs מתחת למיקרוסקופ ולוודא שהם בהירים ועגולים למדי בצורתם. גודל ה- EBs הוא כ 200 מיקרומטר קוטר. לאסוף את כל EBs בצינור 15 מ"ל. מעבירים את ה- EBs מהמנות לצינור 15 מ"ל עם פיפטה של 5 מ"ל. תן EBs להתיישב במשך 5 דקות. הסר את רוב supernatant, משאיר מאחור על 2 מ"ל של בינוני.
    4. מחלקים את ה- EBs למנות המצולעות המכילות 10 מ"ל של ירידה אחר טיפה עם פיפטה של 1 מ"ל. זרע את EBs בצפיפות של כ 2-3 EBs לס"מ2. לדוגמה, להוסיף על 120-180 EBs לתוך צלחת 100 מ"מ. כדי לשפוט בערך את מספר EB, למקם טיפה אחת של השעיית EB על כיסוי, ולספור את מספר EBs תחת המיקרוסקופ.
      הערה: צפיפות ה ציפוי של EBs הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על היעילות של אינדוקציה רשתית. ניתן להתאים את הצפיפות גם על ידי כל קו hPSC.
    5. מנערים בעדינות את הכלים כדי להפיץ את ה- EBs באופן אחיד. שים אותם באינקובטור ב 37 °C (5% CO2).
      הערה: לא להזיז את הכלים לפחות 24 שעות כדי לשפר את הדבקות של EBs.
  4. אינדוקציה של שלטי ראייה אופטיים (OVs) ואפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בתנאים דבקים
    הערה: לאחר EBs הם זרעים על פני השטח מצופה ECM, hPSCs יכול לפתח מבנים דמויי OV, אשר ניתן לראות כבר D20 לאחר בידול. בפרוטוקול זה, גורמי גדילה ספציפיים או מולקולות איתות אינם נדרשים להנחות את hPSCs לתוך גורל הרשתית למעט תוספת של תוספי N2 ו- B27 במדיה.
    1. על D8-D9, להסיר את הכלים ולצפות EBs תחת המיקרוסקופ. כל ה-EBs יצורפו ויתפזרו על הכלים(איור 1D). הוסיפו 10 מ"ל של NIM טרי לכל צלחת 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של מדיום ישן. תחזיר אותם לאינקובטור.
      הערה: אין להסיר את המדיום הישן.
    2. ב- D12, החלף חצי מהמדיום עם NIM באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. שמור את התרבות באינקובטור.
    3. ב- D16, הסר את כל ה- NIM מהמנות באמצעות מערכת שאיפת ואקום. מוסיפים 20 מ"ל של RDM לכל מנה. שמור על פולחן ב- RDM ולשנות חצי מהמדיום כל יומיים.
    4. במהלך D10-D30, להתבונן בשינויים המורפולוגיים של התאים פעמיים בשבוע תחת מיקרוסקופ ולהעריך את היעילות של בידול רשתית.
      הערה: מאז D10, תחומי שדה עיניים (EF) מאורגנים באופן עצמאי באזורים ההיקפיים של EBs חסידים. המבנים דמויי OV מופיעים בין D20 ל-D25, בולטים בהדרגה מהמנה, ויוצרים באופן עצמי אופטית, המוקפת ב-RPE פיגמנטי (איור 1E). ניתן לזהות בקלות את ה-OVs באמצעות טבעת NR בהירה, שבירה ועבה.
  5. ניתוק ותרבות OVs ו- RPE בהשעיה כדי להשיג organoids רשתית (ROs)
    1. ב- D28-D35, רוב OVs מופיעים בכלים. השתמש מחט טונגסטן או מחט עם מזרק 1 מ"ל לנתק באופן מכני את OVs לזיהוי מורפולוגי יחד עם RPE הסמוך. תרבות אותם בהשעיה.
      הערה: המראה והתשואה של OVs ו- RPE משתנים במידה רבה בשורות hPSC שונות. לכן, נקודת הזמן של ניתוק OV ו- RPE היא גמישה. ניתן לנתק טלוויזיות OV ברורות עם RPE הסמוך ולאחר מכן להעביר לצלחת תרבות התקשרות נמוכה המכילה RDM. תמשיך לסרוק את שאר התאים עד שכל ה-OVS וה-RPEs יוסרו.
    2. הכניסו 50-60 טלוויזיות OV לכל מנת תרבות התקשרות נמוכה של 100 מ"מ המכילה 15 מ"ל של RDM להיווצרות ROs(איור 1F).
    3. שנה RDM כל 2-3 ימים עד D42, כאשר ROs הם בצורת עגולה היטב.

3. פיתוח רשתית והבשלה

הערה: בפרוטוקול זה, סרום נדרש כדי לשמור על ROs לגדול ולהבשיל לתרבות לטווח ארוך.

  1. למינציה רשתית ומפרט ב- ROs
    1. הכן 10 מ"ל של טאורין 100 מ"מ (1,000x) ב- PBS 1x. שוקלים 125 מ"ג טאורין, ומתמוססים ב-10 מ"ל של 1x PBS. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר. Aliquot ב 500 μL / צינור, ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
    2. הכן את תרבות הרשתית בינונית 1 (RC1). מערבבים את הרכיבים הבאים: 250 מ"ל של DMEM/F-12, 175 מ"ל של DMEM בסיסי, 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 10 מ"ל של תוספת B27 של 2%, 5 מ"ל של 1% אנטימיקוטי אנטיביוטי, 5 מ"ל של 1% MEM NEAA, 0.5 מ"ל של 100 מיקרומטר טאורין, ו-5 מ"ל של 2 מ"ל L-אלניל-L-גלוטמין.
    3. הכן את תרבות הרשתית בינונית 2 (RC2) המכילה 450 מ"ל של DMEM/F-12, 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 5 מ"ל של תוספת N2% 1%, 5 מ"ל של 1% אנטימיקוטי אנטיביוטי, 0.5 מ"ל של 100 מיקרומטר טאורין, 5 מ"ל של 1% MEM NEAA, ו-5 מ"ל של 2 מ"מ L-alnyl-L-גלוטמין.
      הערה: RC1 ו- RC2 אינם מסוננים, אלא עוברים בדיקת סטריליות. מוציאים 1 מ"ל בינוני, מוסיפים אותו לצלחת 35 מ"מ, ותרבות במשך 3-7 ימים בחממה ב 37 °C (5% CO2),כדי להבטיח סטריליות לפני השימוש. המדיום יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (50 °F) ויש להשתמש בו בתוך 2 שבועות כדי להבטיח את הפעילות של הרכיבים. יש לחמם מראש את כל המדיה והריגנטים ב-RT למשך 30 דקות לפני השימוש.
    4. ב- D42, עבור את מדיום התרבות מ- RDM ל- RC1.
    5. הטה את הכלים בערך 30 מעלות ולתת ROs להתיישב במשך 30 s. הסר את RDM הישן עם פיפטה 10 מ"ל משאיר מאחור על 1 מ"ל של בינוני כדי למנוע לאבד ROs. הוסיפו 15 מ"ל של RC1 טרי לכל מנה.
    6. מנערים בעדינות את הכלים כדי להפיץ את ה-ROs באופן אחיד. תחזיר את הכלים לאינקובטור. לשנות את המדיום כולו פעמיים בשבוע לאחר מכן.
    7. במהלך D50-D90, בחר איכות גבוהה של ROs לתרבות ארוכת טווח, אשר בצורת עגול עם NR עבה ובהיר. מניחים 30-40 ROs בצלחת התקשרות נמוכה של 100 מ"מ עם 20 מ"ל של RC1, ומשנים את כל המדיום פעמיים בשבוע.
    8. עבור תרבות ההשעיה ארוכת הטווח של ROs, pipette ROs כדי למנוע RO-RO חיבור מחדש באמצעות pipette. העבר ROs למנות תרבות חדשות פעם בחודש כדי למנוע ROs דבק על פני השטח של הכלים.
      הערה: בתנאי תרבות המתלים, ROs הם בצורת סיבוב, עם טבעת NR בהירה ועבה המחוברת עם פחות או יותר RPE בצד אחד. רשתית עצבית למינציה לפתח תת-סוגים של תאי רשתית מופיעים ברצף עם תאי גנגליון רשתית שנוצרו לראשונה, ואחריו תאים פוטורצפטור, תאי אמקרין, ותאים דו קוטביים.
  2. התבגרות קולטני אור אנושית עם העשרת קונוסים ב- ROs
    1. לאחר D90, להעביר את המדיום מ RC1 ל RC2, אשר מתאים להבשלת photoreceptor.
    2. שנה את המדיום כמתואר בשלבים 3.1.7-3.1.8.
      הערה: במצב תרבות זה, ROs יכול לגדול לטווח ארוך (איור 1G), עד D300 נבדק. תאי רשתית ב- ROs הופכים בוגרים, וכל תתי-הסוגים של הרשתית העצבית, כולל תאי גליה מולר, מוטות וקונוסים נרכשים גם הם. ללא כל תוספת של RA, קולטני חרוט עשירים גם ב- ROs.

תוצאות

תהליך האינדוקציה ברשתית בפרוטוקול זה מחקה את התפתחות הרשתית העוברית האנושית. כדי ליזום את בידול הרשתית, hPSCs היו מנותקים לגושים קטנים ותרבות בהשעיה כדי לגרום להיווצרות של EBs. ב- D1 נוצרו צבירה של תאים במדים או EBs (איור 1C). מדיום התרבות הועבר בהדרגה ל- NIM. ב- D5, EBs היו מצופים על מנות ...

Discussion

בפרוטוקול אינדוקציה רב-שלבי רשתית זה, hPSCs הונחו צעד אחר צעד כדי להשיג את גורל הרשתית, וארגנו את עצמם לאורגנואידים ברשתית המכילים NR למינציה ו- RPE. במהלך ההבחנה, hPSCs recapitulated כל השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית האנושית vivo, מ EF, OV, ו- RPE, כדי למינציה ברשתית, יצירת כל תת סוגים של תאים רשתית, כולל ...

Disclosures

שיופנג ז'ונג הוא ממציא הפטנטים הקשורים ליצירת תאי רשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), קרן פרויקט המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (201803010078), פרויקט המדע והטכנולוגיה של מחוז גואנגדונג (2017B020230003), הקרן למדעי הטבע (NSF) של סין (81570874, 81970842), מאה כישרונות של אוניברסיטת סון יאט-סן (PT1001010), וקרנות המחקר הבסיסיות של מעבדת מפתח המדינה של רפואת עיניים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(−)-BlebbistatinSigmaB0560-5mgROCK-inhibitor
1 ml tipsKirgenKG13131 ml
10 ml pipetteSorfa3141001Pipette
100 mm Tissue cultureBIOFILTCD000100100 mm Petri dish
100 mm Tissue cultureFalcon353003100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011150Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishesFalcon35300135 mm Petri dish
5 ml pipetteSorfa313000Pipette
50 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011500Centrifuge tubes
6 wells tissue culture platesCostar3516Culture plates
Anti-AP2α AntibodyDSHB3b5Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100XGibco15240062Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 AntibodyBosterBM4446Primary antibody
Anti-Ki67 AntibodyAbcamab15580Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibodygift from Dr. jeremy/Primary antibody
Anti-PAX6 AntibodyDSHBpax6Primary antibody
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin AntibodyMilliporeab5585Primary antibody
Anti-Rhodopsin AntibodyAbcamab5417Primary antibody
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 AntibodyAbclonalA19710Primary antibody
Anti-VSX2 AntibodyMilliporeab9016Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Supplement
Cryotube vialThermo scientific-NUNC3754181.8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLMultiple suppliers
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200.5 M PH 8.0
FBSNATOCORSFBESerum
FilterMilliporeSLGP033RB0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparinSigmaH31492 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100xCorning354277Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1STEM CELL85850hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplementGibco17502048Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) bufferGNMGNM10010Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
TaurineSigmaT0625Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachmentCorningCLS3262-20EAPetri dish

References

  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved