JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

Özet

Retina dejeneratif hastalıklar etkili bir tedavi olmadan geri dönüşü olmayan körlüğün başlıca nedenleridir. Her türlü retina hücresine, hatta mini retina dokularına farklılaşma potansiyeline sahip pluripotent kök hücreler, bu hastalıklara sahip hastalar ve hastalık modelleme ve ilaç taramasında birçok fırsat için büyük vaatlerde bulunmaktadır. Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücreleri için uygun, yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilik ile retina dokuları oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, koni fotoreceptörlerinin zenginleştirilmesine fayda sağlayan retinoik asit eklenmeden gerçekleştirilir. Bu protokolün avantajı, retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir. Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Hastalık modellemesi ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıracaktır.

Giriş

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retina dejeneratif hastalıklar (RD), fotoreceptör hücrelerinin işlev bozukluğu ve ölümü ile karakterizedir ve tipik olarak tedavi etmenin etkili yolları olmadan geri dönüşü olmayan görme kaybına yol açar1. Bu hastalıkların altında kalan mekanizma, insan hastalığı modellerinin eksikliği nedeniyle kısmen bilinmemektedir2. Son on yılda kök hücre teknolojisi ile rejeneratif tıpta önemli ilerlemeler kaydedildi. Biz de dahil olmak üzere birçok araştırmacı, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler), çeşitli farklılaşma yaklaşımları3 , 4 ,5,6,7,8,9,10, 11, hastalık modelleme ve hücre tedavisi büyük potansiyel sağlayan12,13,14.

Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci, zengin deneyime ve yüksek becerilere sahip araştırmacılar gerektiren düşük tekrarlanabilirlik ile oldukça karmaşık ve zaman alıcıdır. Karmaşık ve dinamik indüksiyon işlemi sırasında, bir dizi faktör retina dokularının verimini etkileyecektir15,16,17. Ayrıca, farklı indüksiyon yöntemleri genellikle retina işaretleyicilerinin zamanlaması ve sağlam ifadesi açısından önemli ölçüde değişir, bu da örnek toplama ve veri yorumlamayı şaşırtabilir3. Bu nedenle, adım adım rehberlik ile hPSC'lerden retina farklılaşması için basit bir protokol talep edilecektir.

Burada, yayınlanan çalışmalarımıza dayanarak18,19,20,21 , hPSC'lerden zengin koni fotoreseptörleri ile retinal organoidler (ROs) oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolü tanımlanmıştır, bu da retinoik asit (RA) takviyesi gerektirmez. Bu protokol, nöral retina ve RPE oluşturmak için çok adımlı yöntemin açıklamasına odaklanır. EB oluşumu erken indüksiyon aşamasının önemli bir parçasıdır. EBs'nin hem boyutu hem de kaplama yoğunluğu, retina dokularının verimini bilimsel olarak artıran ve tekrarlanabilirliği teşvik eden nicel olarak optimize edilmiştir. İndüksiyonun ikinci bölümünde, optik veziklinler (OV'ler) yapışma kültüründe kendi kendine organize olur ve süspansiyon kültüründe ROs formu; bu kısmın zaman kursları ve verimlilikleri farklı hPSC hatlarında önemli ölçüde farklılık gösterir. RO'lardaki retina hücrelerinin olgunlaşması ve spesifikasyonu esas olarak indüksiyonun orta ve geç aşamasında ortaya çıkar. RA ilavesi olmadan, hem zengin konilere hem de çubuklara sahip olgun fotoreceptörler üretilebilir.

Bu protokolün amacı, deneyimsiz araştırmacıların tekrar etmesi için her adımı nicel olarak tanımlamak ve detaylandırmaktır. Koni bakımından zengin retina dokularının sağlam verimi ve yüksek tekrarlanabilirlik ile çeşitli hPSC hatları bu protokol ile ROs'a başarıyla indüklenmiştir. Bu protokole sahip HPSC'lerden türetilmiş RO'lar, retinagelişiminin ana adımlarını in vivo olarak yeniden özetleyebilir ve hastalık modelleme, ilaç taraması ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıran uzun süreli hayatta kalabilir.

Protokol

1. HPSC'lerin kültürü ve genişlemesi

  1. HPSC kültürü
    1. Hücre dışı matris (ECM, hESC nitelikli matris) ile 6 kuyulu bir plakanın iki kuyusunu kapleyin. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) 8-12 μg/mL ECM içeren bir ECM çözümünün 50 mL'sini hazırlayın. 49 mL DMEM'de, çözülmüş ECM stok çözeltisinin 1 mL'si (50x) ekleyin. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 mL ECM çözeltisi ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'debir inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatır.
    2. HPSC bakım ortamını (MM) üreticinin talimatına göre hazırlayın.
    3. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca önceden ılık MM.
    4. 30 sn boyunca 37 °C'de bir su banyosunda inkübasyon yaparak sıvı nitrojen tankından kriyojenik bir hPSC şişesi (hiPSC veya hESC) (yaklaşık 1 x 106)çözün.
    5. Şişeyi çıkar ve% 75 dezenfeksiyon alkol spreyi kullanarak dikkatlice dezenfekte edin. Biyogüvenlik dolabına koy.
    6. Hücre süspansiyonu şişeden 15 mL'lik bir tüpe aktarın, 5 mL pipet kullanarak tüpe damla damla 5 mL önceden ısıtılmış MM ekleyin. Bu arada, hPSC'leri karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.
    7. Tüpü 5 dakika boyunca 170 x g'da santrifüj edin. 1 mL pipet kullanarak süpernatantların çoğunu dikkatlice çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 50 μL süpernatant bırakın.
    8. Tüpe 1 mL MM ekleyin ve peleti 1 mL pipetle bir veya iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle yeniden ıslatın.
      NOT: Tek hücreli hPSC'lerin sağkalım oranı düşüktür. HPSC'lerin kolonilerde büyümesini sağlamak için 3-5 hücreli küçük hücre kümeleri tercih edilir.
    9. ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın (adım 1.1.1), her kuyuya 1,5 mL MM ekleyin ve ardından kuyu başına 0,5 mL hücre süspansiyonu dağıtın.
    10. HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve plakayı 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatöre koyun. Hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı en az 24 saat hareket ettirmeyin.
    11. mm'yi her gün değiştirin ve izdiham yaklaşık% 80'e ulaştığında HPSC'leri geçiştirin.
  2. HPSC'lerin geçişi
    NOT: HPSC'lerde farklılaşmamış halin sürdürülmesi, diğer uygulamalar için oldukça önemlidir. Uygun koşullar altında, hPSC'ler iyi tanımlanmış bir sınıra sahip kolonilerde büyür. HPSC'lerin birleşmesi yaklaşık% 80'e ulaştığında hücreler geçilmelidir.
    1. Mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Açıkça görülebilen farklılaştırılmış hücreleri (%<5) geçirmeden önce işaretleyin ve mekanik olarak çıkarın.
    2. ECM kaplı plakayı 1.1.1 adımında açıklandığı gibi hazırlayın.
    3. RT'de Ca 2+ ve Mg2+ olmadan önceden ılık MM ve1x fosfat tampon salin (PBS).
    4. 0,5 mM EDTA (1x PBS olarak) çözeltisini 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.
    5. Bir vakum aspirasyon sistemi kullanarak ortamı kültür plakasından çıkarın, hücreleri 1 mL pipet kullanarak yıkamak için her kuyuya 1 mL 1x PBS ekleyin ve iki kez tekrarlayın.
    6. HPSC'leri 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatöründe ayrıştırmak için kuyu başına 1 mL EDTA çözeltisi ve 5 dakika boyunca% 5 CO2 ekleyin. Tek hücrelere dağılmayı önlemek için önerilen kuluçka süresini aşmayın.
    7. Plakayı çıkar ve mikroskop altında hücrelerin müfrezesini kontrol et. Birleşen hPSC'ler gevşer ve her hücre kenarlığı görülebilir, ancak hücreler hücre plakasını hafifçe sallayarak kolayca çıkarılamaz.
    8. EDTA çözeltisini 1 mL pipetle çıkarın ve ayrışmayı durdurmak için 1 mL MM ekleyin. Hücreleri yeniden çıkarmak için hPSC'leri 1 mL pipetle bir veya iki kez hafifçe pipetlayın. Hücreleri toplamak için santrifüje gerek yoktur.
      NOT: Hücrelerin çoğu EDTA ile inkübasyondan sonra plakadan çıkarsa, hücreler santrifüj ile toplanabilir.
    9. ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın (adım 1.2.2) ve kuyu başına 1,5 mL MM ekleyin.
    10. Her kuyuya 150-200 μL hücre topaklarını aktarın. Genellikle, hPSC'ler 1:6 oranında geçiş yapılabilir. Örneğin, 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusundan hücreler altı yeni kuyuya dağıtılabilir.
    11. HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve hPSC'leri 37 °C'de inkübatörde ve% 5 CO2'de plakaya dokunmadan en az 24 saat boyunca kültüre edin.
    12. 1.1. adımda açıklandığı gibi MM'i her gün değiştirin.

2. HPSC'lerden retinal farklılaşma

NOT: Koloniler ~% 80 izdihama ulaştığında (Şekil 1B), Şekil 1A'daşematize edilen protokolü takiben retina organoidlerine farklılaşmak için yönlendirilebilirler. HPSC'lerin yüksek kaliteye ve iyi verime sahip olmasını sağlamak için, PLURIPOTENCY'yi IFC veya QPCR kullanarak OCT4 veya NANOG gibi moleküler belirteçlerle düzenli olarak değerlendirin. Farklılaştırılmış hücreler toplam hücrelerin %5'inden fazlasını oluşturuyorsa HPSC'ler atılmalıdır. Üreticinin talimatlarına göre mikoplazma tespit kiti ile mikoplazma kontaminasyon olup olmadığını kontrol edin. Mikoplazma hPSC'lerin farklılaşma yeteneğini değiştirebileceğinden, yalnızca mikoplazma içermeyen hPSC'leri kullanın.

  1. Ortam ve reaktifleri hazırlama
    1. Aşağıdakileri karıştırarak sinirsel indüksiyon ortamı (NIM) hazırlayın: 500 mL Dulbecco Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12, 1:1), %1 N2 takviyesinin 5 mL'si, %0,1 heparinin 0,5 mL'si (1x PBS'de 2 mg/mL) ve %1 MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin (NEAA) 5 mL'si.
    2. 300 mL DMEM/F-12, 200 mL DMEM basic, 10 mL %2 B27 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic ve %1 MEM NEAA'nın 5 mL'sini içeren retina farklılaşma ortamını (RDM) hazırlayın.
      NOT: Hem NIM hem de RDM filtrelendirilmez, ancak sterilite testi yapılır. 1 mL orta alın ve 35 mm'lik bir yemeğe ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'debir inkübatörde 3-7 gün boyunca kültür ekleyin. Ortam 4 °C'de saklanabilir ve bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2 hafta içinde kullanılmalıdır.
    3. DMSO'da 10 mM Blebbistatin (1.000x) hazırlayın. 10 mM stok çözeltisi (1.000x), 10 μL / tüpte aliquot elde etmek için 5 mg Blebbistatin'i çözmek için 1.710 μL DMSO ekleyin ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar ve reaktifler kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'de ısıtılmalıdır.
  2. Embriyoid vücut (EB) oluşumu
    1. 0.günde (D0), farklılaşmayı başlatın. ~%80 izdihama kadar büyüyen 6 kuyulu bir plakadan bir kuyu hPSC alın. 1.2.1 ile 1.2.6 arasında açıklanan adımlarda açıklandığı gibi EDTA ayrışma çözümüne sahip hücreleri toplayın.
    2. EDTA çözeltisini çıkarın, hücre ayrışmasını durdurmak için 10 μM Blebbistatin içeren 1 mL MM ekleyin ve hücreleri 1 mL pipetle toplayın. Hücre kümelerinin büyüklüğü, EBs verimini etkileyen temel faktörlerden biridir. D5 ila D7'de doğru boyutta EBs üretmek için yaklaşık olarak, küme başına beş hücre tercih edilir.
      NOT: Bu önemli bir adımdır. EB benzeri agregaların tek bir hPSC hücresinden oluşması zor olduğundan, hücreleri çok fazla boruya bindirmeyin.
    3. Hücre süspansiyonunu (yaklaşık 2 x 106 hücre) 100 mm ultra düşük ek Petri kabına aktarın ve yemeğe 10 μM Blebbistatin içeren 9 mL MM ekleyin.
    4. Hücreleri düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği iki kez hafifçe sallayın ve kabı 37 °C ve% 5 CO2'deinkübatöre koyun.
    5. D1'de, hücreler en az 24 saat kültüre edildikten sonra, yemeği çıkar ve mikroskop altında gözlemleyin. Küçük hücre agregalarının büyük bir kısmı bu zamana kadar kendiliğinden oluşacaktır (Şekil 1C).
    6. 15 mL'lik bir tüpte 3:1 oranında (9 mL MM ve 3 mL NIM) MM ve NIM ile 12 mL karışım hazırlayın.
    7. Hücre kültürlerini dik olarak 10 mL pipetli 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden ısıtılmış karışımın 10 mL'lik kısmını yemeğe ekleyin.
    8. Agregaları toplamak için tüpü 3 dakika boyunca 60 x g'da santrifüjlayın, 5 mL pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 500 μL bırakın.
    9. Karışımın 2 mL'yi tüpe ekleyin ve süspansiyonu aynı yemeğe aktarın (adım 2.2.7).
    10. Hücre agregalarını düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği hafifçe sallayın ve tabağı inkübatöre geri koyun.
    11. D2'de, 15 mL'lik bir tüpte 1:1 oranında (6 mL MM ve 6 mL NIM) MM ve NIM ile 12 mL yeni bir karışım hazırlayın. 2.2.5'ten 2.2.10'a kadar olan adımları tekrarlayarak taze hazırlanmış karışımla hücre ortamını değiştirin.
    12. D3'te, yukarıda açıklandığı gibi 15 mL NIM ile hücre ortamını değiştirin. Askıya alma koşulları altında hücreleri en az 5 gün kültüre edin.
      NOT: D1 ila D3 sırasında, ortam her gün değiştirilerek yeterli beslenme sağlanmalıdır. D3'ten bu yana, NIM her gün değiştirilebilir. Ayrıca, EBs bol beslenme sağlamak için çeşitli yemeklere ayrılabilir.
  3. EB'leri tohumla
    NOT: D5 ila D7'de, ECM kaplı tabaklardaki EB'leri EB'lerin boyutuna göre kaplamak için uygun bir zaman noktası seçin. Yaklaşık çapı 200 μm olan EBs retina farklılaşması için uygundur. Genel olarak, 6 kuyulu bir plakadaki bir kuyu hPSC yaklaşık 300 ila 1.000 EBs üretebilir. EB veriminin varyasyonu hPSC hatları ile değişir.
    1. D4'te, EBs yapışmış kültürü için ECM kaplı yemekler hazırlayın. Her 100 mm doku kültürü kabına (yüzey işlem görmüş) 5 mL ECM ekleyin ve bir gecede inkübatöre koyun.
    2. D5'te ECM'yi önceden kaplanmış tabaklardan çıkarın ve her yemeğe önceden ısıtılmış 10 mL NIM ekleyin.
    3. EBs içeren tabağı çıkar. Mikroskop altında EBs kalitesini kontrol edin ve oldukça parlak ve yuvarlak olduklarından emin olun. EBs'nin büyüklüğü yaklaşık 200 μm çapındadır. Tüm EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın. EB'leri bulaşıklardan 5 mL pipetli 15 mL'lik bir tüpe aktarın. ED'lerin 5 dakika yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 2 mL orta bırakarak süpernatant çoğunu çıkarın.
    4. 10 mL NIM içeren kaplamalı yemeklere 1 mL pipet ile damla damla ES dağıtın. EB'leri cm başına yaklaşık 2-3 EB yoğunluğunda tohumla2. Örneğin, 100 mm'lik bir tabağa yaklaşık 120-180 EBs ekleyin. EB sayısını kabaca değerlendirmek için, bir kapak parçasına bir damla EB süspansiyonu yerleştirin ve mikroskop altındaki EB sayısını sayın.
      NOT: EBs'nin kaplama yoğunluğu retina indüksiyonunun verimliliğini etkileyen önemli faktörlerden biridir. Yoğunluk her hPSC hattı tarafından da ayarlanabilir.
    5. EBs'yi düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın. Bunları 37 °C ve%5 CO2'deinkübatöre koyun.
      NOT: EBs'nin yapışmasını artırmak için bulaşıkları en az 24 saat hareket ettirmeyin.
  4. Optik veziklinlerin (OV' ler) ve retina pigment epitelinin (RPE) yapışma koşullarında indüksiyonu
    NOT: EB'ler ECM kaplı yüzeye tohumlandıktan sonra, hPSC'ler farklılaşmadan sonra D20 kadar erken gözlemlenebilen OV benzeri yapılar geliştirebilir. Bu protokolde, medyada N2 ve B27 takviyelerinin eklenmesi dışında hPSC'leri retina kaderine yönlendirmek için spesifik büyüme faktörleri veya sinyal molekülleri gerekli değildir.
    1. D8-D9'da bulaşıkları çıkarın ve EB'leri mikroskop altında gözlemleyin. Tüm ED'ler eklenecek ve yemeklere yayılacaktır (Şekil 1D). 10 mL eski ortam içeren her 100 mm'lik yemeğe 10 mL taze NIM ekleyin. Onları inkübatöre geri koy.
      NOT: Eski ortamı çıkarmayın.
    2. D12'de, 10 mL pipet kullanarak NIM ile ortamın yarısını değiştirin. Kültürü inkübatörde tut.
    3. D16'da, vakum aspirasyon sistemi kullanarak tüm NIM'leri bulaşıklardan çıkarın. Her yemeğe 20 mL RDM ekleyin. RDM'de kültlük yapmaya devam edin ve ortamın yarısını her gün değiştirin.
    4. D10-D30 sırasında, mikroskop altında haftada iki kez hücrelerin morfolojik değişikliklerini gözlemleyin ve retina farklılaşmanın verimliliğini değerlendirin.
      NOT: D10'dan bu yana, göz alanı (EF) etki alanları, bağlı EB'lerin çevre bölgelerinde kendi kendine organize edilir. OV benzeri yapılar D20 ila D25 arasında görünür, yavaş yavaş tabaktan çıkıntılanır ve pigmentli RPE (Şekil 1E)ile çevrili bir optik bardak oluşturur. TV'ler parlak, kırılma ve kalın NR halkası ile kolayca tanınabilir.
  5. Retinal organoidler (ROs) elde etmek için süspansiyonda RPE ve RPE'leri ayır ve kültür edin
    1. D28-D35'te, TV'lerin çoğu yemeklerde görünür. Morfolojik olarak tanımlanabilir TV'leri bitişik RPE ile birlikte mekanik olarak ayırmak için bir Tungsten iğnesi veya 1 mL şırıngalı bir iğne kullanın. Askıya almada kültür edin.
      NOT: OV'lerin ve RPE'lerin görünümü ve verimi farklı hPSC çizgilerinde büyük ölçüde değişir. Böylece, OV ve RPE'yi ayırmanın zaman noktası esnektir. Bitişik RPE'ye sahip bariz TV'ler ayrılabilir ve daha sonra RDM içeren düşük bir bağlantı kültür çanağından taşınabilir. Tüm RP'ler ve RP'ler kaldırılana kadar hücrelerin geri kalanını kültlemeye devam edin.
    2. ROs oluşumu için 15 mL RDM içeren her 100 mm düşük ek kültür kabına 50-60 TV koyun (Şekil 1F).
    3. RMO'lar iyi yuvarlak şekilli olduğunda, D42'ye kadar RDM'yi her 2-3 günde bir değiştirin.

3. Retina gelişimi ve olgunlaşması

NOT: Bu protokolde, uzun vadeli kültür için RO'ların büyümesini ve olgunlaşmasını sağlamak için serum gereklidir.

  1. RO'larda retina laminasyonu ve spesifikasyonu
    1. 1x PBS'de 10 mL 100 mM taurin (1.000x) hazırlayın. 125 mg taurin tartın ve 1x PBS'nin 10 mL'sinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm şırındıcı filtre ile filtreleyin. 500 μL/ tüpte aliquot ve -20 °C'de saklayın.
    2. Retina kültürü orta 1 (RC1) hazırlayın. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın: 250 mL DMEM/F-12, 175 mL DMEM temel, 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL%2 B27 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic, 5 mL %1 MEM NEAA, 0,5 mL 100 μM taurin ve 5 mL 2 mM L-alanil-L-glutamin.
    3. 450 mL DMEM/F-12 içeren retina kültürü ortamı 2 (RC2) hazırlayın, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL%1 N2 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic, 0,5 mL 100 μM taurin, 5 mL %1 MEM NEAA ve 5 mL 2 mM L-alnyl-L-glutamin.
      NOT: RC1 ve RC2 filtrelendirilmez, ancak sterilite testinden geçirilmez. 1 mL orta alın, 35 mm'lik bir yemeğe ekleyin ve kullanmadan önce steriliteyi sağlamak için 37 °C ve% 5 CO 2'de inkübatörde3-7gün boyunca kültür ekleyin. Ortam 4 °C'de saklanabilir ve bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Tüm ortamlar ve reaktifler kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'de önceden ısıtılmalıdır.
    4. D42'de kültür ortamını RDM'den RC1'e geçirin.
    5. Bulaşıkları yaklaşık 30 ° 'de eğin ve ROs'un 30 sn yerleşmesine izin verin. ESKI RDM'yi, ROS'ları kaybetmemek için yaklaşık 1 mL orta geride bırakan 10 mL pipetle çıkarın. Her yemeğe 15 mL taze RC1 ekleyin.
    6. ROs'ları düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın. Bulaşıkları inkübatöre geri koy. Bundan sonra tüm ortamı haftada iki kez değiştirin.
    7. D50-D90 sırasında, kalın ve parlak bir NR ile yuvarlak şekilli uzun vadeli kültür için yüksek kaliteli RO'lar seçin. 30-40 ROs'u 20 mL RC1 ile 100 mm düşük ek kabına yerleştirin ve tüm ortamı haftada iki kez değiştirin.
    8. ROs'un uzun süreli süspansiyon kültürü için, BIR pipet kullanarak RO-RO'nun yeniden dikimini önlemek için RO'ları pipetle. ROs'ların yemeklerin yüzeyine yapışmasını önlemek için AYDA bir kez yeni kültür yemeklerine AKTARıN.
      NOT: Süspansiyon kültürü koşullarında, RO'lar yuvarlak şekilli olup, bir tarafta az çok RPE ile tutturulmuş parlak ve kalın bir NR halkası vardır. Lamine nöral retina gelişir ve retina hücre alt tipleri ilk olarak oluşturulan retina ganglion hücreleri, ardından fotoreceptör hücreler, amakrin hücreler ve bipolar hücreler ile ardışık olarak ortaya çıkar.
  2. ROs'ta konilerin zenginleştirilmesi ile insan fotoreceptör olgunlaşması
    1. D90'dan sonra, ortamı fotoreceptör olgunlaşması için uygun olan RC1'den RC2'ye geçirin.
    2. Ortamı 3.1.7-3.1.8 adımlarında açıklandığı gibi değiştirin.
      NOT: Bu kültür koşulu altında, ROs uzun vadeli büyüyebilir (Şekil 1G), D300'e kadar test edilir. RO'lardaki retina hücreleri olgunlaşır ve muller glial hücreler, çubuklar ve koniler de dahil olmak üzere sinir retinasının tüm hücre alt tipleri de elde edilir. RA ilavesi olmadan, koni fotoreceptörleri de ROs bakımından zengindir.

Sonuçlar

Bu protokoldeki retina indüksiyon süreci insan fetal retina gelişimini taklit eder. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve EBs oluşumunu teşvik etmek için süspansiyonda kültürlendi. D1'de, tekdüze hücre toplamları veya EBs oluştu (Şekil 1C). Kültür ortamı yavaş yavaş NIM'ye geçirildi. D5'te, EBs ECM kaplı kültür yemeklerine kaplandı. Hücreler yavaş yavaş EBs dışına taşındı (Şekil 1D

Tartışmalar

Bu çok adımlı retina indüksiyon protokolünde, hPSC'ler retina kaderini kazanmak için adım adım yönlendirildi ve lamine NR ve RPE içeren retina organoidleri halinde kendi kendine organize edildi. Farklılaşma sırasında, hPSC'ler,ef, OV ve RPE'den retina laminasyonuna kadar insan retina gelişiminin tüm önemli adımlarını yeniden bir araya getiren, retina ganglion hücreleri, amakrin hücreleri, bipolar hücreler, çubuk ve koni fotoreceptörleri ve muller glial hücreler de dahil olmak üzere ret...

Açıklamalar

Xiufeng Zhong, insan pluripotent kök hücrelerinden retina hücrelerinin üretimi ile ilgili patent mucididir.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFC110103, 2017YFA0104101), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Proje Fonu (201803010078), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Projesi (2017B02020230003), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (NSF) (81570874, 81970842), Sun Yat-sen Üniversitesi'nin (PT1001010) Yüz yetenek programı ve Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı Temel Araştırma Fonları.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
(−)-BlebbistatinSigmaB0560-5mgROCK-inhibitor
1 ml tipsKirgenKG13131 ml
10 ml pipetteSorfa3141001Pipette
100 mm Tissue cultureBIOFILTCD000100100 mm Petri dish
100 mm Tissue cultureFalcon353003100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011150Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishesFalcon35300135 mm Petri dish
5 ml pipetteSorfa313000Pipette
50 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011500Centrifuge tubes
6 wells tissue culture platesCostar3516Culture plates
Anti-AP2α AntibodyDSHB3b5Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100XGibco15240062Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 AntibodyBosterBM4446Primary antibody
Anti-Ki67 AntibodyAbcamab15580Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibodygift from Dr. jeremy/Primary antibody
Anti-PAX6 AntibodyDSHBpax6Primary antibody
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin AntibodyMilliporeab5585Primary antibody
Anti-Rhodopsin AntibodyAbcamab5417Primary antibody
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 AntibodyAbclonalA19710Primary antibody
Anti-VSX2 AntibodyMilliporeab9016Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Supplement
Cryotube vialThermo scientific-NUNC3754181.8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLMultiple suppliers
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200.5 M PH 8.0
FBSNATOCORSFBESerum
FilterMilliporeSLGP033RB0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparinSigmaH31492 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100xCorning354277Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1STEM CELL85850hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplementGibco17502048Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) bufferGNMGNM10010Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
TaurineSigmaT0625Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachmentCorningCLS3262-20EAPetri dish

Referanslar

  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır