JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs البشرية والحفاظ عليها في ثقافة مشتركة مع الخلايا العصبية القشرية المشتقة من iPSC من أجل دراسة الأسس الميكانيكية للتفاعلات المناعية العصبية باستخدام الخلايا العصبية البشرية والخلايا الدبقية الصغيرة.

Abstract

توفر القدرة على توليد الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) أدوات وطرقا جديدة للتحقيق في دور الخلايا الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض. علاوة على ذلك, يمكن الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC في الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية القشرية المشتقة من iPSC, التي تمكن من التحقيق في تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة التي يفترض أنها غير منظمة في عدد من الاضطرابات العصبية والنفسية. تم تمييز iPSCs البشرية لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نسخة معدلة من بروتوكول وضعت من قبل مجموعة Fossati, وتم التحقق من صحة الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC مع تحليل العلامات وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. كانت الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول إيجابية للعلامات CD11C و IBA1 و P2RY12 و TMEM119 ، وعبرت عن الجينات المرتبطة بالخلايا الدبقية الصغيرة AIF1 و CX3CR1 و ITGAM و ITAIGAX و P2RY12 و TMEM119. الخلايا العصبية القشرية المشتقة من iPSC البشرية التي تم تمييزها لمدة 30 أيام تم طلاؤها بالخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ عليها في الزراعة المشتركة حتى اليوم 60, عندما أجريت التجارب. تم تحديد كثافة العمود الفقري الشجيري في الخلايا العصبية القشرية في الزراعة المشتركة مع الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الأساسية وفي وجود السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. من أجل فحص كيفية تعديل الخلايا الدبقية الصغيرة لوظيفة الخلايا العصبية ، تم إجراء تجارب تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية القشرية باستخدام مؤشر الكالسيوم Fluo-4 AM. تم الحصول على نشاط الكالسيوم الحي للخلايا العصبية القشرية باستخدام مجهر متحد البؤر ، وتم قياس كثافة التألق باستخدام ImageJ. يصف هذا التقرير كيف توفر الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC البشرية والخلايا العصبية القشرية طرقا جديدة لاستجواب تأثيرات الخلايا الدبقية الصغيرة على الخلايا العصبية القشرية.

Introduction

في الدماغ البشري ، الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية الفطريةالأساسية 1. يتم تنظيم نمو الدماغ بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة عبر طريقين: إطلاق العوامل القابلة للانتشار والبلعمة1. تساعد العوامل القابلة للانتشار المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة في دعم تكوين النخاع ، وتكوين الخلايا العصبية ، والتكوين المشبكي ، والنضج ، وموت الخلايا ، وبقاء الخلايا1. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا على البلعمة عناصر مختلفة في نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ والمحاور وفي كل من الخلايا الحية والميتة2،3،4،5،6،7،8. تتعرف المستقبلات الموجودة على الخلايا الدبقية الصغيرة على علامات مثل الكالريتيكولين و ATP وحمض السياليك وتنظم البلعمة الخلوية9،10. في الحصين ، تحافظ الخلايا الدبقية الصغيرة على توازن تكوين الخلايا العصبية من خلال دورها البلعمي11.

ثبت أن البلعمة المشبكية في النواة الركبية الظهرية الجانبية (dLGN) لدماغ القوارض تنظمها الخلايا الدبقيةالصغيرة 1. في القوارض ، ثبت أن هناك فترتين أثناء التطور حيث لوحظ البلعمة المشبكية الدقيقة المكثفة. تحدث الفترة الأولى أثناء تكوين المشبك الأولي وتحدث الفترة الثانية عندما يتم ضبط الاتصالات وتقليمها12. العوامل الأخرى التي تشارك في التقليم المشبكي هي البروتينات الالتهابية ومركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC1 و H2-Kb و Db) 13،14. لقد تم اقتراح أن C1q (المكون التكميلي 1q) على الخلايا الدبقية الصغيرة يتساقط مع MHC1 ، مما يؤدي إلى التقليم المشبكي15. علاوة على ذلك ، تظهر دراسات الفئران أن الإنترلوكين -33 (IL-33) الذي تفرزه الخلايا النجمية ينظم توازن المشبك في المهاد والحبل الشوكي من خلال تأثيراته على الخلايا الدبقية الصغيرة ، على الرغم من أن هذا لم يتم التحقيق فيه بعد في البشر13. تفرز الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة متنوعة من السيتوكينات التي تساعد في الحفاظ على صحة الخلايا العصبية ، مثل عامل نخر الورم α (TNFα) و IL-1β و IL-6 و IL-10 و γ الإنترفيرون (IFN-γ) ويمكن لهذه السيتوكينات تعديل العمود الفقري المتغصني وتكوين المشابك16،17،18. هناك فجوات كبيرة في معرفتنا بالتفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الدماغ البشري. تأتي معظم معرفتنا من دراسات من نماذج القوارض ، في حين أن هناك ندرة في المعلومات حول الجوانب الزمنية والميكانيكية للتقليم المشبكي في القشرة البشرية. تدعم الخلايا الدبقية الصغيرة بقاء الخلايا العصبية في القشرة المخية الجديدة ، وتساهم أنواع الخلايا الأخرى أيضا1. ليس من الواضح كيف تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا الحفظ وما هو التفاعل بين الخلايا الدبقية الصغيرة وأنواع الخلايا الأخرى. تطلق الخلايا الدبقية الصغيرة العديد من السيتوكينات التي تؤثر على تطور الخلايا العصبية والمشبكية ولكن الأساس الميكانيكي لتأثيراتها على هذه السيتوكينات في الخلايا العصبية غير معروف إلى حد كبير19،20. من أجل تطوير فهم أكثر اكتمالا لوظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ البشري ، من الأهمية بمكان استكشاف تفاعلاتها مع أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في الدماغ البشري. يصف هذا التقرير طريقة للزراعة المشتركة للخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC والخلايا الدبقية الصغيرة المتولدة من نفس الفرد. سيمكن إنشاء هذه المنهجية إجراء تحقيقات محددة جيدا من استجواب طبيعة التفاعلات الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية وتطوير نماذج خلوية قوية في المختبر لدراسة الخلل الوظيفي المناعي العصبي في سياق الاضطرابات العصبية والنفسية المختلفة.

دور الخلايا الدبقية الصغيرة في مرض انفصام الشخصية
التقليم المشبكي هو عملية نمو عصبية رئيسية تحدث في دماغ المراهق21،22. تشير خطوط متعددة من الأدلة إلى أن التقليم المشبكي خلال هذه الفترة الحرجة غير طبيعي في مرض انفصام الشخصية (SCZ) 23،24،25،26. SCZ هو اضطراب مزمن ومنهك يتميز بالهلوسة والأوهام وعمليات التفكير المضطربة والعجز المعرفي23،24. تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة ، البلاعم المقيمة في الدماغ ، دورا مركزيا في التقليم المشبكي25،26. تظهر دراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) دليلا على خلل في نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة في SCZ25،26،27،28،29،30،31،32. تظهر أدمغة SCZ بعد الوفاة اختلافات مكررة جيدا ولكنها دقيقة في الدماغ - تظهر الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة القشرية الثالثة انخفاضا في كثافة العمود الفقري المتغصني وعددا أقل من نقاط الاشتباكالعصبي 33،34،35. التقليم المشبكي هو عملية يتم من خلالها التخلص من الوصلات المشبكية المثيرة الزائدة عن الحاجة بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة خلال فترة المراهقة ، عندما يكون لدى مرضى SCZ عادة أول استراحة ذهانية22،36. تظهر دراسات ما بعد الوفاة ارتباطا بين SCZ وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، مع زيادة كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة SCZ ، بالإضافة إلى زيادة التعبير عن الجينات المسببةللالتهابات 27. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر دراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للأدمغة البشرية باستخدام الروابط المشعة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة مستويات متزايدة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في القشرة25،26،27،28. تظهر دراسات الارتباط الحديثة على مستوى الجينوم (GWAS) أن أقوى ارتباط جيني ل SCZ يكمن في موضع مركب التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) ، وينتج هذا الارتباط عن أليلات جينات المكون التكميلي 4 (C4) التي تشارك في التوسط في التقليم المشبكي بعد الولادة في القوارض37. قدم هذا الارتباط دعما إضافيا للفرضية القائلة بأن التقليم الشاذ بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة قد يؤدي إلى انخفاض كثافة العمود الفقري الشجيري التي شوهدت في أدمغة SCZ بعد الوفاة. اقتصرت التحقيقات في تورط الخلايا الدبقية الصغيرة في التقليم المشبكي في SCZ حتى الآن على الدراسات غير المباشرة مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني أو الاستنتاجات من تحقيقات أدمغة ما بعد الوفاة.

توليد الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في المختبر
تم استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المزروعة بشكل متكرر في دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة ، على الرغم من وجود العديد من المؤشرات على أن الخلايا الدبقية الصغيرة للقوارض قد لا تكون ممثلة لتشريح الخلايا الدبقية المجهرية البشرية والتعبير الجيني (الجدول 1) 38. ميزت العديد من الدراسات أيضا الخلايا الدبقية الصغيرة مباشرة عن الخلايا الوحيدة في الدم من خلال التمايز39،40،41،42. تظهر الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الدبقية الأحادية في الدم اختلافات كبيرة عن الخلايا الدبقية البشرية في الاستجابات المؤيدة للالتهابات ، ويبدو أنها أكثر شبها بالبلاعم في بيولوجيتها43. تتيح التطورات المنهجية الحديثة الآن توليد الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، والتي توفر فرصا لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة الحية التي تشبه بشكل أكثر دقة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة في الدماغ البشري (الجدول 2). وقد ثبت أن هذه الخلايا الدبقية المجهرية المشتقة من iPSC تلخص النمط الظاهري, ملامح التعبير الجيني, والخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة البشريةالأولية 44,45,46,47,48. توفر هذه الورقة طريقة للزراعة المشتركة للخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC والخلايا الدبقية الصغيرة المتولدة من نفس الفرد من أجل تطوير نماذج مخصصة في المختبر لتفاعلات الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة. لهذا النموذج للثقافة المشتركة في المختبر ، تم تكييف بروتوكول تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من مجموعة Fossati (الجدول 3) وتم دمجه مع نسخة معدلة من بروتوكول توليد الخلايا العصبية القشرية من مجموعة Livesey (الجدول 4) 49،50.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إعادة برمجة iPSCs البشرية المستخدمة في هذه الدراسة من الخلايا الليفية التي تم الحصول عليها من خلال الموافقة المستنيرة من الأشخاص ذوي المراقبة الأصحاء, بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). إعادة برمجة وتوصيف iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) تم وصفه في دراسة سابقة51.

1. صيانة iPSCs

  1. قم بإعداد تخفيف بنسبة 1:50 من مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل النمو المختزل الخالية من LDV في DMEM / F12 بدون أحمر الفينول وقم بتغطية صفيحة من 6 آبار مسبقا مع 1 مل من المحلول المخفف لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل ذوبان مخزون الخلايا.
  2. قم بإذابة مخزون iPSC المحفوظ بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. أضف الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من DMEM / F12. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. قم بإزالة محلول الطلاء من لوحة مصفوفة الغشاء القاعدي الخالية من عامل النمو المخفض المطلي مسبقا وأضف 1 مل من وسط الخلايا الجذعية (SCM) مع مثبط الصخور 10 ميكرومتر (Y-27632).
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في SCM مع 10 ميكرومتر Y-27632 وأضفها إلى اللوحة المطلية مسبقا للحصول على حجم نهائي قدره 2 مل من SCM بالإضافة إلى Y-27632. الحفاظ على مزارع الخلايا iPSC في هذا الوسط ل 24 ساعة في 37 حاضنة درجة مئوية.
  5. استبدل الوسط ب 2 مل من SCM الطازج بدون Y-27632 بعد 24 ساعة من الذوبان.
  6. بعد iPSCs تصل إلى 80-90٪ التقاء, تمريرها إلى 75 مل قوارير المغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي لعامل النمو المنخفض خالية من LDEV.
    1. قم بتمرير الخلايا عن طريق شطف الخلايا أولا باستخدام HBSS وإزالتها بعد تركها لمدة 30 ثانية. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمي واحتضنه لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحضير اللوحة مع SCM التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632.
    2. قم بشفط كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمي وأضف 1 مل من SCM + 10 ميكرومتر Y-27632 إلى كل بئر. اكشط البئر برفق باستخدام رافع الخلايا واحصل على خلايا بماصة 1000 ميكرولتر.
    3. قم بإيداع الخلايا على قارورة غشاء أساسي مطلية بمصفوفة مقاس 75 مم خالية من عامل النمو المخفض الخالي من LDEV بحجم إجمالي قدره 8 مل من SCM + Y-27632.

2. تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: تم تصوير تخطيطي يحدد بروتوكول تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 1 أ. تم تسخين الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

  1. اليوم 0: قم بإجراء تغيير متوسط كامل باستخدام وسيط SCM المكمل ب 80 نانوغرام / مل BMP-4. قم بإجراء تغييرات متوسطة يومية بنفس الوسط خلال الأيام 1-3 ، دون أي غسيل بين التغييرات المتوسطة.
  2. اليوم 4: تحضير اليوم 4-5 متوسط: وسط مكونة للدم (HM) ، مكمل ب 25 نانوغرام / مل FGF ، و 100 نانوغرام / مل SCF ، و 80 نانوغرام / مل VEGF. قم بإزالة الوسيط واستبدله بوسط اليوم 4-5 الذي يحتوي على 5 ميكرومتر Y-27632.
    ملاحظة: تبدأ الخلايا في الطفو عند هذه المرحلة - حوالي نصف الخلايا تطفو ، والنصف الآخر ملتصق.
  3. اليوم 6: تحضير اليوم 6-13 متوسط: HM مكمل ب 50 نانوغرام / مل SCF ، 50 نانوغرام / مل IL-3 ، 5 نانوغرام / مل TPO ، 50 نانوغرام / مل m-CSF ، و 50 نانوغرام / مل Flt3-L. اجمع المادة الطافية ، وأضفها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بالدوران لأسفل لمدة 8 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الحبيبات في قارورة بها 8 مل من اليوم 6-13 المتوسطة مع 5 ميكرومتر Y-27632.
  4. اليوم 10: أضف 8 مل من اليوم 6-13 المتوسط فوق الوسط الموجود.
  5. اليوم 14: تحضير اليوم 14+ متوسط: HM مكمل ب 50 نانوغرام / مل m-CSF ، 50 نانوغرام / مل Flt3-L ، 50 نانوغرام / مل GM-CSF. اجمع المادة الطافية ، وأضفها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتدويرها لمدة 8 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الحبيبات في 8 مل من وسط اليوم 14+ الذي يحتوي على 5 ميكرومتر Y-27632 واستمر في الاستزراع في هذا الوسط.
  6. اليوم 18: أضف 8 مل من اليوم 14+ المتوسط.
  7. اليوم 22: أضف 8 مل من وسط Day14+ الطازج دون إزالة الوسط الموجود.
  8. اليوم 25: انقل الخلايا إلى الخطوة 2.9 أو استمر في الحفاظ عليها في اليوم 14+ المتوسط حتى اليوم 50 من التمايز.
  9. بعد اليوم 25 ، اجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتدويرها لمدة 8 دقائق عند 300 × جم.
    1. تحضير وسط ملتصق: RPMI مكمل ب 1٪ من 200 ملي مولار L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد في محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ ، و 25 نانوغرام / مل GM-SCF و 100 نانوغرام / مل IL-34.
    2. أعد تعليق الحبيبات في الوسط الملتصق الذي يحتوي على 5 ميكرومتر Y-27632.
    3. خلايا صفيحة بكثافة 50,000 خلية لكل سم2 على ألواح 24 بئرا لتجارب مختلفة: ألواح مصفوفة مغلفة بغشاء أساسي مخفضة لعامل النمو المخفض الخالي من LDEV للزراعة الأحادية الدبقية الدقيقة ، 10 ميكروغرام / مل بولي إل أورنيثين و 10 ميكروغرام / مل لوحات تصوير زجاجية مطلية باللامينين لتجارب التصوير.
    4. قم بتخفيف بولي إل أورنيثين واللامينين في DPBS وإضافة 250 ميكرولتر / بئر للوحة تصوير 24 بئر.
      ملاحظة: الخلايا الموجودة في الثقافة ملتصقة الآن بطبيعتها (الشكل 1 ج).
  10. حافظ على الخلايا في المزرعة لمدة 14 يوما على الأقل ، مع تغييرات متوسطة كل أسبوعين. بعد اليوم 14 بعد الالتزام ، وصلت الخلايا إلى مرحلة النضج ويمكن استخدامها للتجارب.

3. تمايز الخلايا العصبية القشرية

ملاحظة: تم تصوير تخطيطي يحدد بروتوكول تمايز الخلايا العصبية القشرية في الشكل 1G.

  1. اليوم 0:
    1. بمجرد أن تلتقي iPSCs على ألواح مصفوفة مغلفة بغشاء غشاء أساسي مخفضة من LDEV خالية من LDEV, التبديل من SCM إلى مزيج 50/50 من وسط N2/B27 مكمل مع 10 ميكرومتر SB431542, 1 ميكرومتر دورسومورفين, 100 نانومتر LDN193189.
      ملاحظة: يتكون وسط N2 من وسط قاعدي مكمل بمكمل N-2 بنسبة 1٪ ، و 1٪ 200 ملي من L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.85٪ ، و1٪ قلم / بكتيريا. يتكون وسط B27 من DMEM / F12 مكمل بمكمل B-27 بنسبة 2٪ ، و 1٪ 200 ملي مولار L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد في محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ ، 1٪ قلم / بكتيريا.
    2. قم بتغيير الوسيط مع إضافة المكملات المذكورة أعلاه يوميا لمدة 7 أيام.
  2. اليوم 7:
    1. ألواح الطلاء المسبق في مصفوفة غشاء أساسي لعامل النمو المخفضة الخالية من LDDEV لمدة 2 ساعة على الأقل.
    2. زنازين المرور 1: 1 على ألواح مطلية مسبقا. اشطف الخلايا ب 1 مل / بئر HBSS وقم بإزالتها بعد تركها لمدة 30 ثانية. أضف 1 مل / بئر من وسط انفصال الخلية (على سبيل المثال ، Accutase) واحتضنه لمدة 4-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنابيب مخروطية سعة 15 مل مع 5 مل من DMEM.
    3. قم بتعبئة عامل التفكك الأنزيمي الماصة برفق لإزالة الخلايا من اللوحة باستخدام ماصة P1000. اجمع عامل التفكك الأنزيمي وخليط الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل DMEM.
    4. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط N2 / B27 الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632. استمر في الرضاعة اليومية مع وسط N2 / B27 دون أي مكملات.
  3. اليوم 12: زنازين المرور 1: 1 باستخدام الطرق الموضحة في 3.2.2. استمر في الرضاعة اليومية باستخدام N2 / B27 متوسط.
  4. اليوم 15/16: زنزانات المرور 1: 2 باستخدام الطرق الموضحة في 3.2.2. استمر في الرضاعة اليومية باستخدام N2 / B27 متوسط.
  5. اليوم 18/19: زنازين المرور 1: 3 باستخدام الطرق الموضحة في 3.2.2. استمر في الرضاعة اليومية مع N2 / B27 متوسطة حتى اليوم 25.
  6. اليوم 25: تغذية الخلايا بوسط N2 / B27 مع 10 ميكرومتر من DAPT.
  7. اليوم 28: تغذية الخلايا بوسط N2 / B27 طازج غير معالج.
  8. اليوم 30: مرور الخلايا باستخدام الطرق الموضحة في 3.2 على لوحات زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ عليها في وسط BrainPhys مكمل ب 1٪ B-27.

4. الخلايا الدبقية الصغيرة / الثقافات المشتركة للخلايا العصبية

  1. يوم اللوحة 30 الخلايا العصبية القشرية فوق الثقافات الدبقية الصغيرة بكثافة 50,000 خلية لكل سم2. استكمل وسط مع اللامينين 1 ميكروغرام / مل لتحسين التصاق الخلايا.
  2. الحفاظ على المزارع في مزيج من 50٪ وسط ملتصق و 50٪ وسط Brainohys مكمل بمكمل B-27 1٪. قم بإجراء تغيير نصف متوسط كل أسبوعين حتى التجريب.
  3. قم بإجراء التجارب بعد وصول الخلايا العصبية إلى اليوم 60.

5. علاج γ الإنترفيرون

  1. تحضير وسط طازج مكمل ب 100 نانوغرام / مل IFN-γ. نضيف الوسط ونتركه يحتضن لمدة 24 ساعة. قم بإزالة الوسيط وانتقل إلى التجريب.

6. الكيمياء المناعية

  1. قم بتثبيت الخلايا في طبق الاستزراع ب 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. اشطف الخلايا في 1 مل من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  3. أضف 1 مل من PBST (PBS + 0.1٪ Triton X) لمدة 10 دقائق.
  4. أضف المخزن المؤقت للحظر: 1 مل من PBS بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز لمدة 1 ساعة.
  5. أضف الجسم المضاد الأولي المخفف في 100 ميكرولتر من مصل PBS + 1٪ من الماعز - طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تحسين جميع الأجسام المضادة الأولية وفقا لذلك.
  6. اشطف الخلايا في 1 مل من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  7. أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف في 100 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى مصل الماعز بنسبة 1٪ - لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

7. تحليل العمود الفقري

  1. احصل على الصور على مجهر متحد البؤر بتكبير 60x.
  2. استخدم دالة ImageJ NeuronJ52 لتحليل الصور.
  3. احصل على قياسات لطول العصبات وطول العمود الفقري وعدد العمود الفقري من خلال NeuronJ.

8. تصوير الكالسيوم

  1. تحضير وسط طازج بصبغة 3 ميكرومتر Fluo-4AM. احتضان المزارع المشتركة في هذه الوسط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم اشطف الخلايا باستخدام PBS ، وأضف محلول تصوير الخلايا الحية إلى الخلايا ، وانتقل إلى التصوير.
  2. باستخدام مجهر متحد البؤر مجهز لتصوير الخلايا الحية ، احصل على صور بفاصل زمني بمعدل 40 ضعفا لمدة دقيقتين. يمكن تسجيل النشاط عند خط الأساس ، مع التعرض ل 15 ملي مولار من الغلوتامات ، أو في وضع إزالة الاستقطاب باستخدام 5 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم.
  3. باستخدام ImageJ ، قم بقياس شدة التألق بمرور الوقت لأجسام الخلايا الفردية. باستخدام أداة التحديد، حدد منطقة الاهتمام الفردية (ROI) المحيطة بكل جسم خلية. افتح مدير عائد الاستثمار واضغط على إضافة للتحديد. استمر في إضافة تحديدات جديدة إلى مدير عائد الاستثمار.
  4. استخدم أداة Set Measurements لقياس متوسط المنطقة الرمادية. عند إضافة عدد أجسام الخلايا المطلوبة إلى مدير عائد الاستثمار، حددها جميعا ثم استخدم أداة القياس المتعدد . سيوفر هذا قراءة لمتوسط المنطقة الرمادية لكل منها على مدار الوقت لملف الفيديو. ستعطي البيانات المصدرة متوسط شدة التألق للمنطقة التي تهم كل إطار.
  5. حدد نسبة شدة التألق ، F / F0 ، حيث F هي شدة التألق في وقت معين و F0 هي شدة التألق الأولية. يمكن رسم F / F0 بمرور الوقت لفحص النشاط التلقائي في الخلايا العصبية أو فحصه بأقصى شدة فلورية في إعداد التحفيز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التحقق من صحة البروتوكول
تم إنشاء الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC من سبعة خطوط iPSC على ثلاث جولات مختلفة من التمايز. تم استخدام خطوط التحكم iPSC ML27 و ML56 و ML292 و ML364 وخطوط iPSC لمرض انفصام الشخصية ML40 و ML141 و ML250. وقد وصفت توصيف خطوط iPSC هذه سابقا51. تم ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

فتح تطوير طرق التمايز على طول مسارات مختلفة للخلايا الجذعية متعددة القدرات العديد من السبل للتحقيق في وظائف المخ وعمليات المرض53،54،55. ركزت الدراسات الأولية على تطوير أنواع معينة من الخلايا العصبية يفترض أنها مهمة في اض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعهد الوطني للصحة العقلية لأبحاث السلوك الحيوي للعلماء الجدد المبتكرين (BRAINS) R01MH113858 (إلى RK) ، وجائزة المعهد الوطني للصحة العقلية لتطوير العلماء السريريين K08MH086846 (إلى RK) ، وجائزة تطوير العالم السريري لمؤسسة دوريس ديوك الخيرية (إلى RK) ، ومؤسسة Ryan Licht Sang Bipolar (إلى RK) ، مؤسسة عائلة جين ماري لي أوسترهاوس وجائزة NARSAD للباحث الشاب من مؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (إلى AK) ، ومؤسسة فيليس وجيروم لايل رابابورت (إلى RK) ، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية (إلى RK) ، وستيف ويليس وإليسا فرويد (إلى RK). نود أن نشكر الدكتور بروس إم كوهين والدكتورة دونا ماكفي من كلية الطب بجامعة هارفارد ومستشفى ماكلين لتزويدنا بالخلايا الليفية المستخدمة في الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C antibodyBiolegend337207Dilution 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 antibodyAbcamab18465
CUTL1 monoclonal antibodyAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture FlasksNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Goat SerumSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 antibodyAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 antibodySynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 supplementGibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 antibodyBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 antibodyAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom PlateGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 antibodyAbcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris1254

References

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224(2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218(2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075(2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238(2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1(2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629(2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IPSCs ImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved