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요약

이 프로토콜은 인간 뉴런과 미세아교세포를 사용하여 신경면역 상호작용의 기계론적 토대를 연구하기 위해 미세아교세포를 인간 iPSC와 구별하고 iPSC 유래 피질 뉴런과 공동 배양에서 유지하는 방법론을 설명합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 미세아교세포를 생성하는 능력은 건강과 질병에서 미세아교세포의 역할을 조사하기 위한 새로운 도구와 방법을 제공합니다. 또한, iPSC 유래 미세아교세포는 iPSC 유래 피질 뉴런과 공동 배양에서 유지될 수 있으며, 이를 통해 여러 신경 정신 질환에서 조절 장애가 있는 것으로 추정되는 미세아교세포-뉴런 상호 작용에 대한 조사를 수행할 수 있습니다. Fossati 그룹이 개발한 프로토콜의 개조 버전을 사용하여 human iPSC를 분화하여 microglia를 생성하고, iPSC 유래 microglia는 marker 분석 및 real-time PCR을 통해 검증했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 인간 미세아교세포는 CD11C, IBA1, P2RY12 및 TMEM119 마커에 대해 양성이었으며 미세아교세포 관련 유전자 AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 및 TMEM119를 발현했습니다. 30일 동안 분화된 인간 iPSC 유래 피질 뉴런을 미세아교세포로 도금하고 실험이 수행된 60일까지 공동 배양으로 유지되었습니다. 미세아교세포와 공동 배양에서 피질 뉴런의 수지상 가시 밀도는 기준선 조건 하에서 그리고 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 존재 하에서 정량화되었습니다. 미세아교세포가 뉴런 기능을 조절하는 방법을 조사하기 위해 칼슘 지시자 Fluo-4 AM을 사용하여 피질 뉴런의 칼슘 이미징 실험을 수행했습니다. 대뇌피질 뉴런의 살아있는 칼슘 활성은 컨포칼 현미경을 사용하여 얻었고, 형광 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화했습니다. 이 보고서는 인간 iPSC 유래 미세아교세포와 피질 뉴런을 공동 배양하는 것이 어떻게 피질 뉴런에 대한 미세아교세포의 영향을 조사하는 새로운 접근 방식을 제공하는지 설명합니다.

서문

인간의 뇌에서 미세아교세포는 1차 선천면역세포입니다1. 뇌 발달은 두 가지 경로를 통해 미세아교세포에 의해 조절됩니다: 확산성 인자의 방출과 식세포작용1. 미세아교세포에서 유래한 확산성 인자는 수초화, 신경 발생, 시냅스 형성, 성숙, 세포 사멸 및 세포 생존을 지원하는 데 도움이 됩니다1. Microglia는 또한 뇌 시냅스, 축삭 및 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에서 다양한 요소를 식세포화합니다 2,3,4,5,6,7,8. 미세아교세포(microglia)의 수용체(receptor)는 칼레티큘린(calreticulin), ATP, 시알산(sialic acid)과 같은 태그를 인식하고 세포 식균작용(phagocytosis)을 조절합니다 9,10. 해마에서 미세아교세포는 식세포 역할을 통해 신경발생의 항상성을 유지한다11.

설치류 뇌의 배외측 생식핵(dLGN)에서 시냅스 식세포작용(synaptic phagocytosis)은 미세아교세포(microglia)1에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다. 설치류의 경우, 발달 기간 동안 강렬한 미세아교세포 시냅스 식세포작용(microglial synaptic phagocytosis)이 관찰되는 두 시기가 있는 것으로 나타났습니다. 첫 번째 기간은 초기 시냅스 형성 중에 발생하고 두 번째 기간은 연결이 미세 조정되고 정리될 때 발생합니다12. 시냅스 가지치기에 관여하는 다른 요인으로는 염증성 단백질과 Class I 주요 조직적합성 복합체(MHC1, H2-Kb 및 Db)가 있습니다13,14. 미세아교세포의 C1q(보체 성분 1q)는 MHC1과 공동 국소화되어 시냅스 가지치기15를 유발하는 것으로 제안되었습니다. 또한, 생쥐 연구에 따르면 성상세포에 의해 분비되는 인터루킨-33(IL-33)은 미세아교세포에 미치는 영향을 통해 시상과 척수의 시냅스 항상성을 조절하지만, 인간을 대상으로 한 연구는 아직 이루어지지 않았다13. 미세아교세포는 종양괴사인자α(TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 및 인터페론-γ(IFN-γ)과 같은 신경 건강을 유지하는 데 도움이 되는 다양한 사이토카인을 분비하며, 이러한 사이토카인은 수지상 척추와 시냅스 형성을 조절할 수 있습니다 16,17,18. 인간의 뇌 발달 중 뉴런-미세아교세포의 상호 작용에 대한 우리의 지식에는 상당한 격차가 있습니다. 우리 지식의 대부분은 설치류 모델의 연구에서 비롯된 반면, 인간 피질에서 시냅스 가지치기의 시간적, 기계론적 측면에 대한 정보는 부족합니다. 미세아교세포(Microglia)는 신피질(neo-cortex)에서 뉴런의 생존을 지원하며, 다른 세포 유형도 기여합니다1. 미세아교세포가 이러한 보존에 어떻게 기여하는지, 그리고 미세아교세포와 다른 세포 유형 사이의 상호 작용이 무엇인지는 명확하지 않습니다. 미세아교세포는 뉴런 및 시냅스 발달에 영향을 미치는 여러 사이토카인을 방출하지만, 뉴런에서 이러한 사이토카인의 효과에 대한 기계론적 근거는 대체로 알려져 있지 않습니다19,20. 인간 뇌에서 미세아교세포의 기능에 대한 보다 완전한 이해를 개발하기 위해서는 인간 뇌에서 발견되는 다양한 세포 유형과의 상호 작용을 탐구하는 것이 중요합니다. 이 보고서는 동일한 개체에서 생성된 인간 iPSC 유래 뉴런과 미세아교세포를 공동 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법론을 확립하면 미세아교세포-신경 세포 상호 작용의 특성을 조사하고 다양한 신경 발달 및 신경 정신 장애의 맥락에서 신경 면역 기능 장애를 연구하기 위한 강력한 체외 세포 모델을 개발하기 위한 잘 정의된 조사를 수행할 수 있습니다.

정신분열증에서 미세아교세포의 역할
시냅스 가지치기는 청소년의 뇌에서 일어나는 주요 신경 발달 과정입니다21,22. 여러 가지 증거에 따르면 이 결정적인 시기의 시냅스 가지치기는 정신분열증(SCZ)에서 비정상적이다 23,24,25,26. SCZ는 환각, 망상, 무질서한 사고 과정 및 인지 결핍을 특징으로 하는 만성적이고 쇠약해지는 정신 질환입니다23,24. 뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포(Microglia)는 시냅스 가지치기(synaptic pruning)에서 중심적인 역할을 합니다25,26. 사후 및 양전자 방출 단층 촬영(PET) 연구는 SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32에서 기능 장애의 미세아교세포 활성에 대한 증거를 보여줍니다. 사후 SCZ 뇌는 뇌에서 잘 복제되었지만 미묘한 차이를 보이며, 피질층 III의 피라미드 뉴런은 수지상 척추 밀도가 감소하고 시냅스가 감소합니다 33,34,35. 시냅스 가지치기(synaptic pruning)는 SCZ 환자가 일반적으로 첫 번째 정신병적 단절을 겪는 청소년기에 미세아교세포에 의해 불필요한 흥분성 시냅스 연결이 제거되는 과정입니다22,36. 사후 분석에 따르면 SCZ와 미세아교세포 활성화 사이의 연관성이 있으며, SCZ 뇌에서 미세아교세포의 밀도가 증가하고 전염증 유전자의 발현이 증가한다27. 또한, 미세아교세포 활성화를 위해 방사선 리간드를 사용하는 인간 뇌에 대한 PET 연구는 피질에서 활성화된 미세아교세포의 수치가 증가했음을 보여줍니다 25,26,27,28. 최근의 게놈 전체 연관 연구(GWAS)에 따르면 SCZ에 대한 가장 강력한 유전적 연관성은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 유전자 자리에 있으며, 이러한 연관성은 설치류의 출생 후 시냅스 가지치기를 매개하는 데 관여하는 보체 구성 요소 4(C4) 유전자의 대립유전자에서 비롯됩니다37. 이 연관성은 미세아교세포에 의한 비정상적인 가지치기가 SCZ 사후 뇌에서 볼 수 있는 수지상 척추 밀도 감소를 초래할 수 있다는 가설에 대한 추가 지원을 제공했습니다. SCZ의 시냅스 가지치기에 대한 미세아교세포 관여에 대한 조사는 지금까지 PET 이미징을 통한 간접 연구 또는 사후 뇌 조사에서 추론한 것으로 제한되었습니다.

실험실에서 인간 미세아교세포 생성
배양된 1차 마우스 미세아교세포는 미세아교세포를 연구하는 데 자주 사용되었지만, 설치류 미세아교세포가 인간 미세아교세포의 해부학적 구조와 유전자 발현을 대표하지 않을 수 있다는 몇 가지 징후가 있습니다(표 1)38. 여러 연구에서는 또한 transdifferentiation 39,40,41,42를 통해 혈액 단핵구에서 직접 미세아교세포를 구별했습니다. 혈액 단핵구 유래 미세아교세포(microglia-like cell)는 유전자 및 단백질 발현 프로필에서 인간 미세아교세포와 주요 차이점을 보이며, 생물학적으로 대식세포와 더 유사한 것으로 보인다43. 최근의 방법론적 발전으로 이제 인간 iPSC에서 미세아교세포를 생성할 수 있게 되었으며, 이는 인간의 뇌에서 발견되는 미세아교세포의 생물학과 더 정확하게 유사한 살아있는 미세아교세포를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다(표 2). 이러한 iPSC 유래 미세아교세포는 일차 인간 미세아교세포의 표현형, 유전자 발현 프로필 및 기능적 특성을 요약하는 것으로 나타났습니다 44,45,46,47,48. 이 논문은 뉴런-미세아교세포 상호 작용의 개인화된 체외 모델을 개발하기 위해 동일한 개체에서 생성된 인간 iPSC 유래 뉴런과 미세아교세포를 공동 배양하는 방법을 제공합니다. 이 체외 공동 배양 모델을 위해 Fossati 그룹의 미세아교세포 분화 프로토콜이 조정되고(표 3) Livesey 그룹(표 4)의 대뇌피질 신경 세포 생성 프로토콜의 적응된 버전과 결합되었습니다(표 4)49,50.

프로토콜

이 연구에 사용된 인간 iPSC는 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 건강한 대조군 피험자의 사전 동의를 통해 얻은 섬유아세포에서 재프로그래밍되었습니다. 본 연구에서 사용된 iPSC(ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292)의 재프로그래밍(reprogramming) 및 특성화는 선행 연구에서 설명되었다51.

1. iPSC의 유지 관리

  1. 페놀 레드가 없는 DMEM/F12에서 LDEV-free 감소된 성장 인자 기저막 매트릭스를 1:50 희석하여 준비하고 세포 스톡을 해동하기 전에 37°C에서 최소 2시간 동안 희석된 용액 1mL로 6웰 플레이트를 사전 코팅합니다.
  2. 37°C 수조에서 2분 동안 동결 보존된 iPSC 스톡을 해동합니다. 5mL의 DMEM/F12가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 세포를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다.
  3. 사전 코팅된 LDEV-free 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 플레이트에서 코팅 용액을 제거하고 10μM 암석 억제제(Y-27632)와 함께 줄기세포 배지(SCM) 1mL를 추가합니다.
  4. SCM에서 세포 펠릿을 10μM Y-27632로 재현탁하고 사전 코팅된 플레이트에 추가하여 2mL의 SCM과 Y-27632의 최종 부피를 얻습니다. 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 이 배지에서 iPSC 세포 배양을 유지합니다.
  5. 해동 후 24시간 후에 Y-27632 없이 배지를 2mL의 새 SCM으로 교체하십시오.
  6. iPSC가 80-90% 합류점에 도달한 후 LDEV-free 성장 인자 감소 기저막 매트릭스로 코팅된 75mL 플라스크에 전달합니다.
    1. 먼저 HBSS로 세포를 헹구어 세포를 계대하고 30초 동안 방치한 후 제거합니다. 1mL의 비효소 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 10μM Y-27632가 함유된 SCM으로 플레이트를 준비합니다.
    2. 비효소 세포 해리 시약을 흡인하고 각 웰에 1mL의 SCM + 10μM Y-27632를 추가합니다. cell lifter로 well을 부드럽게 긁어내고 1000μL 피펫으로 cell을 얻습니다.
    3. 총 8mL의 SCM + Y-27632 부피로 LDEV-free 감소 성장 인자 기저막 기저막 75mm 플라스크에 세포를 증착합니다.

2. 미세아교세포 분화

참고: 미세아교세포 분화 프로토콜을 개략적으로 설명하는 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다. 미디어를 사용하기 전에 실온으로 데웠습니다.

  1. 0일차: 80ng/mL BMP-4가 보충된 SCM 배지로 완전한 배지 변경을 수행합니다. 매체 변경 사이에 세척하지 않고 1-3일 동안 이 동일한 매체로 매일 매체 변경을 수행합니다.
  2. 4일차: 4-5일차 배지 준비: 25ng/mL FGF, 100ng/mL SCF 및 80ng/mL VEGF가 보충된 조혈 배지(HM). 배지를 제거하고 5μM Y-27632를 함유한 4-5일 배지로 교체합니다.
    참고: 이 시점에서 세포가 뜨기 시작합니다 - 약 절반의 세포가 떠 있고 절반은 부착되어 있습니다.
  3. 6일차: 6-13일차 배지 준비: HM에 50ng/mL SCF, 50ng/mL IL-3, 5ng/mL TPO, 50ng/mL m-CSF 및 50ng/mL Flt3-L을 보충합니다. 상층액을 수집하고 15mL 원추형 튜브에 추가한 다음 300 x g에서 8분 동안 스핀다운합니다. 5μM Y-27632가 보충된 8mL의 Day 6-13 배지가 있는 플라스크에 펠릿을 재현탁합니다.
  4. 10일차: 기존 배지 위에 6-13일차 배지 8mL를 추가합니다.
  5. 14일차: 14+ 준비배지: HM에 50ng/mL m-CSF, 50ng/mL Flt3-L, 50ng/mL GM-CSF를 보충합니다. 상층액을 모아 50mL 원추형 튜브에 넣고 300 x g에서 8분 동안 탈수합니다. 5 μM Y-27632를 함유한 8 mL의 Day 14+ 배지에 펠릿을 재현탁시키고 이 배지에서 배양을 계속합니다.
  6. 18일차: Day14+ 배지 8mL를 추가합니다.
  7. 22일차: 기존 배지를 제거하지 않고 새로운 Day14+ 배지 8mL를 추가합니다.
  8. 25일차: 세포를 2.9단계로 이동하거나 분화 50일차까지 Day14+ 매체를 계속 유지합니다.
  9. 25일째 후, 50mL 원뿔형 튜브에 상층액을 모으고 300 x g에서 8분 동안 탈수합니다.
    1. 부착 배지 준비: 0.85% NaCl 용액에 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 1%를 보충한 RPMI, 25ng/mL GM-SCF 및 100ng/mL IL-34.
    2. 펠릿을 5μM Y-27632를 함유하는 부착 배지에 재현탁시킵니다.
    3. 다양한 실험을 위한 24웰 플레이트에서cm2 당 50,000 세포의 밀도를 가진 플레이트 셀: 미세아교세포 단일배양을 위한 LDEV-free 감소 성장 인자 기저막 매트릭스 코팅 플레이트, 이미징 실험을 위한 10μg/mL 폴리-L-오르니틴 및 10μg/mL 라미닌 코팅 유리 이미징 플레이트.
    4. DPBS에서 폴리-L-오르니틴 및 라미닌을 희석하고 24웰 이미징 플레이트에 250μL/웰을 추가합니다.
      참고: 배양 중인 세포는 이제 자연에 부착됩니다(그림 1C).
  10. 최소 14일 동안 배양에서 세포를 유지하며 격주로 배지를 변경합니다. 순응 후 14일째 이후, 세포는 성숙에 도달했으며 실험에 사용할 수 있습니다.

3. 피질 뉴런 분화

참고: 피질 뉴런 분화 프로토콜을 개략적으로 설명하는 개략도가 그림 1G에 나와 있습니다.

  1. 0일차:
    1. iPSC가 LDEV-free reduced growth factor 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 융합되면 SCM에서 10μM SB431542, 1μM 도르소모르핀, 100nM LDN193189가 보충된 N2/B27 배지의 50/50 혼합으로 전환합니다.
      참고: N2 배지는 0.85% NaCl 용액에 1% N-2 보충제, 1% 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 보충된 기저 배지, 1% 펜/연쇄상구균으로 구성됩니다. B27 배지는 0.85% NaCl 용액에 2% B-27 보충제, 1% 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 보충된 DMEM/F12, 1% 펜/연쇄상구균으로 구성됩니다.
    2. 위의 보충제를 7일 동안 매일 첨가하여 배지를 바꾸십시오.
  2. 7일차:
    1. 최소 2시간 동안 LDEV-free 감소 성장 인자 기저막 매트릭스의 프리코트 플레이트.
    2. 계대 셀을 1:1로 사전 코팅된 플레이트에 접합합니다. 1mL/웰 HBSS로 세포를 헹구고 30초 동안 그대로 둔 후 제거합니다. 1mL/well의 세포 분리 배지(예: Accutase)를 추가하고 37°C에서 4-5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 5mL의 DMEM이 있는 15mL 코니컬 튜브를 준비합니다.
    3. 효소 해리제를 부드럽게 피펫팅하여 P1000 피펫터로 플레이트에서 세포를 제거합니다. 5mL DMEM이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 효소 해리제와 세포 혼합물을 수집합니다.
    4. 300 x g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 10μM Y-27632를 함유한 1mL의 N2/B27 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 보충제 없이 N2/B27 배지를 매일 계속 먹이십시오.
  3. 12일차: 3.2.2에 설명된 방법을 사용하여 세포 1:1 통과. N2/B27 배지로 매일 먹이를 계속하십시오.
  4. 15/16일차: 3.2.2에 설명된 방법을 사용하여 셀 1:2 통과. N2/B27 배지로 매일 먹이를 계속하십시오.
  5. 18/19일차: 3.2.2에 설명된 방법을 사용하여 셀 1:3 통과. 25일째까지 N2/B27 배지로 매일 수유를 계속하십시오.
  6. 25일차: 10μM의 DAPT가 보충된 N2/B27 배지를 세포에 공급합니다.
  7. 28일차: 처리되지 않은 신선한 N2/B27 배지를 세포에 공급합니다.
  8. 30일차: 3.2에 설명된 방법을 사용하여 세포를 미세아교세포(microglia culture plate)에 삽입하고 1% B-27 보충제가 보충된 BrainPhys 배지에서 유지합니다.

4. 미세아교세포/뉴런 공동 배양

  1. Plate Day 30 cm당 50,000 세포의 밀도로 미세아교세포 배양 위에 있는 피질 뉴런2. 세포 순응도를 향상시키기 위해 라미닌 1 μg/mL로 배지를 보충합니다.
  2. 50% 접착성 배지와 50% Brainohys 배지에 1% B-27 보충제를 보충하여 배양물을 유지하십시오. 실험할 때까지 격주로 반중간 변경을 수행합니다.
  3. 뉴런이 60일째에 도달한 후 실험을 수행합니다.

5. 인터페론γ 치료

  1. 100ng/mL IFN-γ가 보충된 신선한 배지를 준비합니다. 배지를 넣고 24시간 동안 배양합니다. 배지를 제거하고 실험을 진행합니다.

6. 면역세포화학(Immunocytochemistry)

  1. 100μL의 4% 파라포름알데히드로 배양 접시에 세포를 실온에서 20분 동안 고정합니다.
  2. PBS 1mL에 세포를 각각 5분씩 3회 헹굽니다.
  3. 1mL의 PBST(PBS + 0.1% Triton X)를 10분 동안 추가합니다.
  4. 블로킹 버퍼를 추가합니다: PBS 1mL와 5% 염소 세럼을 1시간 동안 투여합니다.
  5. 100 μL의 PBS + 1% 염소 혈청에 희석된 1차 항체를 4 °C에서 하룻밤 동안 추가합니다. 그에 따라 모든 1차 항체를 최적화합니다.
  6. PBS 1mL에 세포를 각각 5분씩 3회 헹굽니다.
  7. PBS 100μL와 염소 혈청 1%로 희석한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 추가합니다.

7. 척추 분석

  1. 컨포칼 현미경을 60x 배율로 촬영하여 이미지를 획득할 수 있습니다.
  2. ImageJ 함수 NeuronJ52 를 사용하여 이미지를 분석합니다.
  3. NeuronJ를 통해 신경돌기 길이, 척추 길이 및 척추 수에 대한 측정값을 얻을 수 있습니다.

8. 칼슘 이미징

  1. 3μM Fluo-4AM 염료로 새로운 배지를 준비합니다. 이 배지에서 37°C에서 30분 동안 공동 배양을 배양합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 헹구고 세포에 살아있는 세포 이미징 용액을 추가한 다음 이미징을 진행합니다.
  2. 라이브 셀 이미징을 위한 컨포칼 현미경을 사용하여 2분 동안 40x에서 타임 랩스 이미지를 획득합니다. 활성은 15mM 글루타메이트에 노출된 기준선 또는 5mM 염화칼륨으로 탈분극 설정에서 기록될 수 있습니다.
  3. ImageJ를 사용하여 개별 세포체에 대한 시간 경과에 따른 형광 강도를 측정합니다. 선택 도구를 사용하여 각 세포체를 둘러싼 개별 관심 영역(ROI)을 선택합니다. ROI Manager 를 열고 Add 를 눌러 선택합니다. ROI 관리자에 새 선택 항목을 계속 추가합니다.
  4. Set Measurements 도구를 사용하여 평균 회색 영역을 측정합니다. 원하는 세포체의 수가 ROI 관리자에 추가되면 모두 선택한 다음 Multi-Measure 도구를 사용합니다. 이것은 비디오 파일의 시간 경과에 따라 각각에 대한 평균 회색 영역의 판독값을 제공합니다. 내보낸 데이터는 각 프레임의 관심 영역에 대한 평균 형광 강도를 제공합니다.
  5. 형광 강도 비율 F/F0을 측정하며, 여기서 F는 주어진 시간에서의 형광 강도이고 F0 는 초기 형광 강도입니다. F/F0 는 뉴런의 자발적 활동을 검사하기 위해 시간 경과에 따른 그래프로 표시하거나 자극 설정에서 최대 형광 강도로 검사할 수 있습니다.

결과

프로토콜 검증
iPSC 유래 미세아교세포는 3차례의 분화 과정을 통해 7개의 iPSC 라인에서 생성되었습니다. 대조군 iPSC 계열 ML27, ML56, ML292 및 ML364와 정신분열증 iPSC 계열 ML40, ML141 및 ML250을 활용했습니다. 이러한 iPSC 라인의 특성화는 이전에 설명되었습니다51. 이러한 iPSC 유래 미세아교세포는 ICC 및 qPCR을 사용하여 검증되었습니다. 적응된 프?...

토론

만능 줄기세포에 대한 다양한 궤적을 따른 분화 방법의 개발은 뇌 기능 및 질병 과정을 조사하기 위한 많은 길을 열었습니다 53,54,55. 초기 연구는 특정 뇌 질환에 중요하다고 가정된 특정 신경 세포 유형의 발달에 초점을 맞췄다56,57. 최근에는 뇌 오가노이드...

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists(BRAINS) R01MH113858상(R.K.), 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 임상과학자개발상(K08MH086846, R.K.), 도리스 듀크 자선재단(Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award), 라이언 리히트 상 양극성 재단(Ryan Licht Sang Bipolar Foundation, R.K.), Jeanne Marie Lee-Osterhaus Family Foundation 및 Brain & Behavior Research Foundation (A.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (R.K.), Harvard Stem Cell Institute (R.K.), Steve Willis와 Elissa Freud (R.K.)가 수여하는 NARSAD Young Investigator Award. 연구에 사용된 섬유아세포를 제공해 주신 하버드 의과대학과 맥린 병원의 브루스 M. 코헨 박사와 도나 맥피 박사에게 감사의 말씀을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C antibodyBiolegend337207Dilution 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 antibodyAbcamab18465
CUTL1 monoclonal antibodyAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture FlasksNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Goat SerumSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 antibodyAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 antibodySynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 supplementGibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 antibodyBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 antibodyAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom PlateGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 antibodyAbcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris1254

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