A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להבדיל בין מיקרוגליה ל-iPSCs אנושיים ולשמור אותם בתרבית משותפת עם נוירונים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC על מנת לחקור את היסודות המכאניסטיים של אינטראקציות נוירו-אימוניות באמצעות נוירונים אנושיים ומיקרוגליה.
היכולת לייצר מיקרוגליה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מספקת כלים ודרכים חדשים לחקירת תפקיד המיקרוגליה בבריאות ובמחלות. יתר על כן, ניתן לשמור על מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC בתרבית משותפת עם נוירונים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC, המאפשרים חקירה של אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים המשוערות כלא מווסתות במספר הפרעות נוירו-פסיכיאטריות. iPSCs אנושיים התמיינו ליצירת מיקרוגליה באמצעות גרסה מותאמת של פרוטוקול שפותח על ידי קבוצת Fossati, והמיקרוגליה שמקורה ב-iPSC אומתה באמצעות ניתוח סמנים ו-PCR בזמן אמת. מיקרוגליה אנושית שנוצרה באמצעות פרוטוקול זה הייתה חיובית לסמנים CD11C, IBA1, P2RY12 ו-TMEM119, וביטאה את הגנים הקשורים למיקרוגליה AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 ו-TMEM119. נוירונים אנושיים בקליפת המוח שמקורם ב-iPSC שהיו מובחנים במשך 30 יום צופו במיקרוגליה ונשמרו בתרבית משותפת עד היום ה-60, אז נערכו ניסויים. צפיפות הקוצים הדנדריטיים בתאי עצב בקליפת המוח בתרבית משותפת עם מיקרוגליה כומתה בתנאי בסיס ובנוכחות ציטוקינים פרו-דלקתיים. על מנת לבחון כיצד מיקרוגליה מווסתת את תפקוד העצבים, נערכו ניסויי הדמיית סידן של תאי העצב בקליפת המוח באמצעות אינדיקטור הסידן Fluo-4 AM. פעילות סידן חיה של נוירונים בקליפת המוח הושגה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ועוצמת הקרינה כומתה באמצעות ImageJ. דוח זה מתאר כיצד תרבית משותפת של מיקרוגליה ותאי עצב בקליפת המוח שמקורם ב-iPSC מספקים גישות חדשות לחקירת ההשפעות של מיקרוגליה על נוירונים בקליפת המוח.
במוח האנושי, מיקרוגליה הם תאי החיסון המולדים העיקריים1. התפתחות המוח מווסתת על ידי מיקרוגליה בשני מסלולים: שחרור גורמים דיפוזיים ופגוציטוזיס1. גורמים מפוזרים שמקורם במיקרוגליה מסייעים בתמיכה במיאלינציה, נוירוגנזה, היווצרות סינפטית, התבגרות, מוות תאים והישרדות תאים1. מיקרוגליה גם פוגוציטים אלמנטים שונים בסינפסות המוח, באקסונים ובתאים חיים ומתיםכאחד 2,3,4,5,6,7,8. קולטנים על מיקרוגליה מזהים תגים כגון קלרטיקולין, ATP וחומצה סיאלית ומווסתים את הפגוציטוזיס התאי 9,10. בהיפוקמפוס, מיקרוגליה שומרת על ההומאוסטזיס של נוירוגנזה באמצעות תפקידה הפגוציטי11.
הוכח כי פגוציטוזיס סינפטי בגרעין הגניקולט האחורי (dLGN) של מוח המכרסם מווסת על ידי מיקרוגליה1. במכרסמים הוכח כי ישנן שתי תקופות במהלך ההתפתחות בהן נצפתה פגוציטוזיס סינפטי אינטנסיבי של מיקרוגליה. התקופה הראשונה מתרחשת במהלך היווצרות הסינפסות הראשונית והתקופה השנייה מתרחשת כאשר החיבורים מכווננים וגוזמים12. גורמים נוספים המעורבים בגיזום סינפטי הם חלבונים דלקתיים וקומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרי Class I (MHC1, H2-Kb ו-Db)13,14. הוצע כי C1q (רכיב משלים 1q) על המיקרוגליה משתלב עם MHC1, מה שמפעיל גיזום סינפטי15. יתר על כן, מחקרים בעכברים מראים כי אינטרלוקין-33 (IL-33) המופרש על ידי אסטרוציטים מווסת הומאוסטזיס סינפסה בתלמוס ובחוט השדרה באמצעות השפעותיו על מיקרוגליה, אם כי זה עדיין לא נחקר בבני אדם13. מיקרוגליה מפרישה מגוון ציטוקינים המסייעים בשמירה על בריאות העצבים, כגון גורם נמק גידול α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 ואינטרפרון-γ (IFN-γ) וציטוקינים אלה יכולים לווסת את עמוד השדרה הדנדריטי ואת היווצרות הסינפסות 16,17,18. ישנם פערים משמעותיים בידע שלנו על אינטראקציות עצב-מיקרוגליה במהלך התפתחות המוח האנושי. רוב הידע שלנו מגיע ממחקרים ממודלים של מכרסמים, בעוד שיש מחסור במידע על ההיבטים הטמפורליים והמכניסטיים של גיזום סינפטי בקליפת המוח האנושית. מיקרוגליה תומכת בהישרדות עצבית בניאו-קורטקס, וסוגי תאים אחרים תורמים גם הם1. לא ברור כיצד מיקרוגליה תורמת לשימור זה ומה יחסי הגומלין בין מיקרוגליה לסוגי התאים האחרים. מיקרוגליה משחררת מספר ציטוקינים המשפיעים על התפתחות עצבית וסינפטית, אך הבסיס המכניסטי של השפעותיהם של ציטוקינים אלה בתאי עצב אינו ידוע ברובו19,20. על מנת לפתח הבנה מלאה יותר של תפקוד המיקרוגליה במוח האנושי, חיוני לחקור את האינטראקציות שלה עם סוגי תאים שונים שנמצאים במוח האנושי. דוח זה מתאר שיטה לתרבית משותפת של נוירונים אנושיים שמקורם ב-iPSC ומיקרוגליה שנוצרו מאותו אדם. ביסוס מתודולוגיה זו יאפשר חקירות מוגדרות היטב לחקור את אופי האינטראקציות בין מיקרוגליה-עצב ולפתח מודלים תאיים חזקים במבחנה לחקר תפקוד נוירו-אימוני בהקשר של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות שונות.
תפקיד המיקרוגליה בסכיזופרניה
גיזום סינפטי הוא תהליך נוירו-התפתחותי מרכזי המתרחש במוח המתבגר21,22. קווי ראיות מרובים מצביעים על כך שגיזום סינפטי בתקופה קריטית זו אינו תקין בסכיזופרניה (SCZ)23,24,25,26. SCZ היא הפרעה פסיכיאטרית כרונית ומתישה המאופיינת בהזיות, אשליות, תהליכי חשיבה מופרעים וליקויים קוגניטיביים23,24. מיקרוגליה, המקרופאגים השוכנים במוח, ממלאים תפקיד מרכזי בגיזום סינפטי25,26. מחקרי טומוגרפיה לאחר המוות ופליטת פוזיטרונים (PET) מראים עדויות לפעילות מיקרוגליאלית לא מתפקדת ב-SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. מוחות SCZ לאחר המוות מראים הבדלים משוכפלים היטב אך עדינים במוח - נוירונים פירמידליים בשכבה הקורטיקלית III מראים ירידה בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטית ופחות סינפסות 33,34,35. גיזום סינפטי הוא תהליך שבו קשרים סינפטיים מעוררים מיותרים מסולקים על ידי מיקרוגליה במהלך גיל ההתבגרות, כאשר חולי SCZ בדרך כלל חווים את ההפסקה הפסיכוטית הראשונה שלהם22,36. מחקרים שלאחר המוות מראים קשר בין SCZ להפעלת מיקרוגליה, עם צפיפות מוגברת של מיקרוגליה במוח SCZ, כמו גם ביטוי מוגבר של גנים פרו-דלקתיים27. בנוסף, מחקרי PET של מוחות אנושיים המשתמשים ברדיוליגנדים להפעלת מיקרוגליה מראים רמות מוגברות של מיקרוגליה מופעלת בקליפת המוח 25,26,27,28. מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים אחרונים (GWAS) מראים כי הקשר הגנטי החזק ביותר ל-SCZ שוכן בלוקוס קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרי (MHC), וקשר זה נובע מאללים של הגנים המשלימים מרכיב 4 (C4) המעורבים בתיווך גיזום סינפטי לאחר הלידה במכרסמים37. קשר זה סיפק תמיכה נוספת להשערה כי גיזום חריג על ידי מיקרוגליה עלול לגרום לירידה בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטית הנראית במוח SCZ לאחר המוות. חקירות של מעורבות מיקרוגליה בגיזום סינפטי ב-SCZ הוגבלו עד כה למחקרים עקיפים עם הדמיית PET או מסקנות מחקירות של מוחות לאחר המוות.
יצירת מיקרוגליה אנושית במעבדה
מיקרוגליה ראשונית של עכבר מתורבת שימשה לעתים קרובות בחקר מיקרוגליה, אם כי ישנן מספר אינדיקציות לכך שמיקרוגליה של מכרסמים עשויה שלא לייצג את האנטומיה של המיקרוגליה האנושית ואת ביטוי הגנים (טבלה 1)38. מספר מחקרים גם הבדילו בין מיקרוגליה ישירות למונוציטים בדם באמצעות טרנסדיפרנציאציה 39,40,41,42. תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם במונוציטים בדם מציגים הבדלים גדולים ממיקרוגליה אנושית בפרופיל ביטוי גנים וחלבונים בתגובות פרו-דלקתיות, ונראה שהם דומים יותר למקרופאגים בביולוגיה שלהם43. ההתקדמות המתודולוגית האחרונה מאפשרת כעת יצירת מיקרוגליה מ-iPSCs אנושיים, המספקים הזדמנויות לחקור מיקרוגליה חיה הדומה יותר לביולוגיה של מיקרוגליה הנמצאת במוח האנושי (טבלה 2). תאי מיקרוגליה אלה שמקורם ב-iPSC הוכחו כמסכמים את הפנוטיפ, פרופילי ביטוי הגנים והתכונות התפקודיות של מיקרוגליה אנושית ראשונית 44,45,46,47,48. מאמר זה מספק שיטה לתרבית משותפת של נוירונים אנושיים שמקורם ב-iPSC ומיקרוגליה שנוצרו מאותו אדם על מנת לפתח מודלים מותאמים אישית במבחנה של אינטראקציות עצב-מיקרוגליה. עבור מודל זה של תרבית משותפת במבחנה, הותאם פרוטוקול התמיינות מיקרוגליאלית מקבוצת פוסאטי (טבלה 3) ושולב עם גרסה מותאמת של פרוטוקול יצירת עצבים בקליפת המוח מקבוצת ליבסי (טבלה 4)49,50.
תאי ה-iPSC האנושיים ששימשו במחקר זה תוכנתו מחדש מפיברובלסטים שהושגו באמצעות הסכמה מדעת של נבדקי ביקורת בריאים, באישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB). התכנות מחדש והאפיון של iPSCs ששימשו במחקר זה (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) תוארו במחקר קודם51.
1. תחזוקה של iPSCs
2. התמיינות מיקרוגליה
הערה: סכמטית המתארת את פרוטוקול התמיינות המיקרוגליה מתוארת באיור 1A. המדיה חוממה לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. התמיינות נוירונים בקליפת המוח
הערה: סכמטי המתאר את פרוטוקול התמיינות הנוירונים בקליפת המוח מתואר באיור 1G.
4. תרבויות משותפות של מיקרוגליה/נוירונים
5. טיפול באינטרפרון-γ
6. אימונוציטוכימיה
7. ניתוח עמוד שדרה
8. הדמיית סידן
אימות פרוטוקול
המיקרוגליה שמקורה ב-iPSC נוצרה משבעה קווי iPSC בשלושה סבבים שונים של התמיינות. נעשה שימוש בקווי iPSC בקרה ML27, ML56, ML292 ו-ML364 וסכיזופרניה קווי iPSC ML40, ML141 ו-ML250. אפיון קווי iPSC אלה תואר בעבר51. מיקרוגליה זו שמקורה ב-iPSC אומתה באמצעות ICC ו-qPCR. מיקרוגלי...
הפיתוח של שיטות התמיינות לאורך מסלולים שונים לתאי גזע פלוריפוטנטיים פתח אפיקים רבים לחקר תפקוד המוח ותהליכי מחלה 53,54,55. מחקרים ראשוניים התמקדו בהתפתחות של סוגי תאים עצביים ספציפיים המשוערים כחשובים בהפרעות מוח ספציפי?...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי פרס המכון הלאומי למחקר ביו-התנהגותי לבריאות הנפש למדענים חדשים חדשים (BRAINS) R01MH113858 (ל-R.K.), פרס פיתוח מדענים קליניים של המכון הלאומי לבריאות הנפש K08MH086846 (ל-R.K.), פרס פיתוח המדענים הקליניים של קרן הצדקה דוריס דיוק (ל-R.K.), הקרן הדו-קוטבית של ריאן ליכט סאנג (ל-R.K.), קרן משפחת ז'אן מארי לי-אוסטרהאוס ופרס החוקר הצעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (ל-A.K.), קרן פיליס וג'רום לייל רפפורט (ל-R.K.), מכון תאי הגזע של הרווארד (ל-R.K.) ועל ידי סטיב וויליס ואליסה פרויד (ל-R.K). אנו רוצים להודות לד"ר ברוס מ. כהן ולד"ר דונה מקפי מבית הספר לרפואה של הרווארד ובית החולים מקלין על שסיפקו לנו את הפיברובלסטים ששימשו במחקר.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504044 | |
b-FGF | Peprotech | 100-18B | |
BMP-4 | Peprotech | 120-05ET | |
Brainphys | StemCell Technologies | 5790 | |
CD11C antibody | Biolegend | 337207 | Dilution 1:200 |
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 07-200-83 | |
Ctip2 antibody | Abcam | ab18465 | |
CUTL1 monoclonal antibody | Abnova | H00001523-M01 | |
DMEM/F-12, no phenol red | Gibco | 21041025 | |
dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6421 | |
EasYFlask Cell Culture Flasks | Nunc | 156499 | |
Fisherbrand Cell Lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
Flt3-Ligand | Peprotech | 300-19 | |
Fluo4-AM | Life Technologies | F-14201 | |
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 ML | ThermoFisher Scientific | A1413201 | |
Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution 1:1000 |
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Invitrogen | A-11004 | Dilution 1:1000 |
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405) | Abcam | ab175670 | Dilution 1:1000 |
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405) | Abcam | ab175678 | Dilution 1:1000 |
Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
HBSS | Invitrogen | 14170120 | |
IBA1 antibody | Abcam | ab5076 | Dilution 1:500 |
IL-34 | Peprotech | 200-34 | |
INF-y | Peprotech | 300-02 | |
KiCqStart SYBR Green Primers | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0599 | |
Live Cell Imaging Solution | Invitrogen | A14291DJ | |
MAP2 antibody | Synaptic Systems | 188 004 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502001 | |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
NutriStem hPSC XF Medium | Biological Industries | 01-0005 | |
P2RY12 antibody | Biolegend | 848002 | |
Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-488 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Poly-L-Orthinine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
SATB2 antibody | Abcam | ab51502 | |
SB431542 | Sigma-Aldrich | S4317 | |
SCF | Stemcell Technologies | 78062 | |
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom Plate | Greiner-Bio | 662892 | |
StemPro-34 SFM (1X) | Gibco | 10639011 | |
TMEM119 antibody | Abcam | ab185333 | Dilution 1:1000 |
TPO | Peprotech | 300-18 | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
VEGF | Peprotech | 100-20 | |
Versene | ThermoFisher Scientific | 15040066 | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris | 1254 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved