JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan nöronları ve mikroglia kullanarak nöroimmün etkileşimlerin mekanik temellerini incelemek için mikrogliaları insan iPSC'lerinden ayırmak ve bunları iPSC'den türetilmiş kortikal nöronlarla ko-kültürde tutmak için bir metodolojiyi açıklar.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) mikroglia üretme yeteneği, mikroglia'nın sağlık ve hastalıktaki rolünü araştırmak için yeni araçlar ve yollar sağlar. Ayrıca, iPSC'den türetilmiş mikroglia, iPSC'den türetilmiş kortikal nöronlarla ko-kültürde korunabilir, bu da bir dizi nöropsikiyatrik bozuklukta düzensiz olduğu varsayılan mikroglia-nöron etkileşimlerinin araştırılmasını sağlar. İnsan iPSC'leri, Fossati grubu tarafından geliştirilen bir protokolün uyarlanmış bir versiyonu kullanılarak mikroglia oluşturmak üzere farklılaştırıldı ve iPSC'den türetilen mikroglia, belirteç analizi ve gerçek zamanlı PCR ile doğrulandı. Bu protokol kullanılarak üretilen insan mikrogliası, CD11C, IBA1, P2RY12 ve TMEM119 belirteçleri için pozitifti ve mikroglial ile ilişkili genler AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 ve TMEM119'yi ifade etti. 30 gün boyunca farklılaşmış olan insan iPSC'den türetilmiş kortikal nöronlar, mikroglia ile kaplandı ve deneylerin yapıldığı 60. güne kadar ko-kültürde tutuldu. Mikroglia ile ko-kültürde kortikal nöronlardaki dendritik dikenlerin yoğunluğu, başlangıç koşulları altında ve pro-inflamatuar sitokinlerin varlığında ölçüldü. Mikroglia'nın nöronal fonksiyonu nasıl modüle ettiğini incelemek için, kortikal nöronların kalsiyum görüntüleme deneyleri, kalsiyum indikatörü Fluo-4 kullanılarak gerçekleştirildi. Kortikal nöronların canlı kalsiyum aktivitesi konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi ve floresan yoğunluğu ImageJ kullanılarak ölçüldü. Bu rapor, insan iPSC'den türetilen mikroglia ve kortikal nöronların birlikte kültürlenmesinin, mikroglia'nın kortikal nöronlar üzerindeki etkilerini sorgulamak için nasıl yeni yaklaşımlar sağladığını açıklamaktadır.

Giriş

İnsan beyninde, mikroglia birincil doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir1. Beyin gelişimi, mikroglia tarafından iki yolla düzenlenir: yayılabilir faktörlerin salınımı ve fagositoz1. Mikrogliadan türetilmiş yayılabilir faktörler miyelinasyon, nörojenez, sinaptik oluşum, olgunlaşma, hücre ölümü ve hücre sağkalımını desteklemeye yardımcı olur1. Mikroglia ayrıca beyin sinapslarında, aksonlarda ve hem canlı hem de ölü hücrelerdeçeşitli elementleri fagositleştirir 2,3,4,5,6,7,8. Mikroglia üzerindeki reseptörler, kalretikülin, ATP ve sialik asit gibi etiketleri tanır ve hücresel fagositozu düzenler 9,10. Hipokampusta, mikroglia, fagositik rolü11 ile nörojenezin homeostazını sürdürür.

Kemirgen beyninin dorsolateral genikülat çekirdeğindeki (dLGN) sinaptik fagositozun mikroglia1 tarafından düzenlendiği gösterilmiştir. Kemirgenlerde, gelişim sırasında yoğun mikroglial sinaptik fagositozun gözlendiği iki dönem olduğu gösterilmiştir. İlk periyot ilk sinaps oluşumu sırasında meydana gelir ve ikinci periyot, bağlantılar ince ayar yapılırken ve budanırken meydana gelir12. Sinaptik budamada rol oynayan diğer faktörler, inflamatuar proteinler ve Sınıf I majör histouyumluluk kompleksidir (MHC1, H2-Kb ve Db)13,14. Mikroglia üzerindeki C1q'nun (kompleman bileşeni 1q) MHC1 ile kolokalize olduğu ve bunun da sinaptik budamayıtetiklediği öne sürülmüştür 15. Ayrıca, fare çalışmaları, astrositler tarafından salgılanan interlökin-33'ün (IL-33), mikroglia üzerindeki etkileri yoluyla talamus ve omurilikteki sinaps homeostazını düzenlediğini göstermektedir, ancak bu henüz insanlarda araştırılmamıştır13. Mikroglia, tümör nekroz faktör α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 ve interferon-γ (IFN-γ) gibi nöronal sağlığın korunmasına yardımcı olan çeşitli sitokinler salgılar ve bu sitokinler dendritik omurgayı ve sinaps oluşumunu modüle edebilir 16,17,18. İnsan beyninin gelişimi sırasında nöron-mikroglia etkileşimleri hakkındaki bilgilerimizde önemli boşluklar vardır. Bilgimizin çoğu kemirgen modellerinden yapılan çalışmalardan gelirken, insan korteksinde sinaptik budamanın zamansal ve mekanik yönleri hakkında bilgi eksikliği vardır. Mikroglia, neo-kortekste nöronal sağkalımı destekler ve diğer hücre tipleri de katkıda bulunur1. Mikroglia'nın bu korumaya nasıl katkıda bulunduğu ve mikroglia ile diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimin ne olduğu açık değildir. Mikroglia, nöronal ve sinaptik gelişimi etkileyen birkaç sitokin salgılar, ancak bu sitokinlerin nöronlardaki etkilerinin mekanik temeli büyük ölçüde bilinmemektedir19,20. Mikroglia'nın insan beynindeki işlevi hakkında daha eksiksiz bir anlayış geliştirmek için, insan beyninde bulunan farklı hücre tipleriyle etkileşimlerini araştırmak çok önemlidir. Bu rapor, aynı bireyden üretilen insan iPSC'den türetilmiş nöronları ve mikrogliaları birlikte kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu metodolojinin oluşturulması, mikroglia-nöronal etkileşimlerin doğasını sorgulamak ve farklı nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik bozukluklar bağlamında nöroimmün disfonksiyonu incelemek için sağlam in vitro hücresel modeller geliştirmek için iyi tanımlanmış araştırmaları mümkün kılacaktır.

Şizofrenide mikroglia'nın rolü
Sinaptik budama, ergen beyninde meydana gelen önemli bir nörogelişimsel süreçtir21,22. Çok sayıda kanıt, bu kritik dönemde sinaptik budamanın şizofrenide (SCZ) anormal olduğunu göstermektedir23,24,25,26. SCZ, halüsinasyonlar, sanrılar, düzensiz düşünce süreçleri ve bilişsel eksiklikler ile karakterize kronik, zayıflatıcı bir psikiyatrik bozukluktur23,24. Beyindeki yerleşik makrofajlar olan mikroglia, sinaptik budamada merkezi bir rol oynar25,26. Postmortem ve pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmaları, SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32'de disfonksiyonel mikroglial aktivite için kanıt göstermektedir. Ölüm sonrası SCZ beyinleri, beyinde iyi kopyalanmış ancak ince farklılıklar gösterir - kortikal tabaka III'teki piramidal nöronlar, azalmış dendritik omurga yoğunluğu ve daha az sinaps gösterir 33,34,35. Sinaptik budama, SCZ hastalarının genellikle ilk psikotik kırılmalarına sahip oldukları ergenlik döneminde gereksiz uyarıcı sinaptik bağlantıların mikroglia tarafından elimine edildiği bir süreçtir22,36. Ölüm sonrası çalışmalar, SCZ beyinlerinde artan mikroglia yoğunluğunun yanı sıra proinflamatuar genlerin ekspresyonunun artması ile SCZ ve mikroglial aktivasyon arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir27. Ek olarak, mikroglial aktivasyon için radyoligandları kullanan insan beyinlerinin PET çalışmaları, kortekste 25,26,27,28 aktif mikroglia seviyelerinin arttığını göstermektedir. Son genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), SCZ için en güçlü genetik ilişkinin majör histouyumluluk kompleksi (MHC) lokusunda bulunduğunu ve bu ilişkinin, kemirgenlerde doğum sonrası sinaptik budamaya aracılık eden kompleman bileşeni 4 (C4) genlerinin alellerinden kaynaklandığını göstermektedir37. Bu ilişki, mikroglia ile anormal budamanın SCZ postmortem beyinlerinde görülen dendritik omurga yoğunluğunun azalmasına neden olabileceği hipotezi için ek destek sağlamıştır. SCZ'de sinaptik budamada mikroglial tutulumun araştırılması şimdiye kadar PET görüntüleme ile yapılan dolaylı çalışmalarla veya postmortem beyin araştırmalarından elde edilen çıkarımlarla sınırlı kalmıştır.

Laboratuvarda insan mikrogliasının üretilmesi
Kültürlenmiş birincil fare mikrogliası, mikroglia çalışmasında sıklıkla kullanılmıştır, ancak kemirgen mikrogliasının insan mikroglial anatomisini ve gen ekspresyonunu temsil etmeyebileceğine dair çeşitli göstergeler vardır (Tablo 1)38. Birkaç çalışma ayrıca mikroglia'yı transdiferansiyasyon yoluyla doğrudan kan monositlerinden farklılaştırmıştır 39,40,41,42. Kan monositinden türetilmiş mikroglia benzeri hücreler, gen ve protein ekspresyon profili proinflamatuar yanıtlarında insan mikrogliasından büyük farklılıklar gösterir ve biyolojilerinde daha makrofaj benzeri görünmektedirler43. Son metodolojik ilerlemeler artık insan beyninde bulunan mikroglia biyolojisine daha doğru bir şekilde benzeyen canlı mikrogliaları incelemek için fırsatlar sağlayan insan iPSC'lerinden mikroglia üretilmesini mümkün kılmaktadır (Tablo 2). Bu iPSC'den türetilmiş mikroglial hücrelerin, birincil insan mikrogliasının fenotipini, gen ekspresyon profillerini ve fonksiyonel özelliklerini özetlediği gösterilmiştir 44,45,46,47,48. Bu makale, nöron-mikroglia etkileşimlerinin kişiselleştirilmiş in vitro modellerini geliştirmek için aynı bireyden üretilen insan iPSC'den türetilmiş nöronları ve mikrogliaları birlikte kültürlemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu in vitro ko-kültür modeli için, Fossati grubundan bir mikroglial farklılaşma protokolü uyarlandı (Tablo 3) ve Livesey grubundan bir kortikal nöronal nesil protokolünün uyarlanmış bir versiyonu ile birleştirildi (Tablo 4)49,50.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan insan iPSC'leri, kurumsal inceleme kurulunun (IRB) onayı ile sağlıklı kontrol deneklerinden bilgilendirilmiş onam yoluyla elde edilen fibroblastlardan yeniden programlandı. Bu çalışmada kullanılan iPSC'lerin (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) yeniden programlanması ve karakterizasyonu önceki bir çalışmada açıklanmıştır51.

1. iPSC'lerin bakımı

  1. Fenol kırmızısı içermeyen DMEM / F12'de LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisinin 1:50 oranında seyreltilmesini hazırlayın ve hücre stoklarını çözmeden önce 37 ° C'de en az 2 saat boyunca 1 mL seyreltilmiş çözelti ile 6 oyuklu bir plakayı ön kaplama.
  2. Dondurularak saklanmış iPSC stoklarını 37 °C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca çözdürün. Hücreleri 5 mL DMEM / F12 içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  3. Kaplama solüsyonunu önceden kaplanmış LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matris plakasından çıkarın ve 10 μM Kaya inhibitörü (Y-27632) ile 1 mL kök hücre ortamı (SCM) ekleyin.
  4. Hücre peletini SCM'de 10 μM Y-27632 ile yeniden süspanse edin ve 2 mL SCM artı Y-27632'lik bir son hacim için önceden kaplanmış plakaya ekleyin. iPSC hücre kültürlerini bu ortamda 37 ° C'lik bir inkübatörde 24 saat boyunca koruyun.
  5. Çözüldükten 2 saat sonra ortamı Y-27632 olmadan 24 mL taze SCM ile değiştirin.
  6. iPSC'ler %80-90 birleşmeye ulaştıktan sonra, bunları LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi ile kaplanmış 75 mL'lik şişelere geçirin.
    1. Hücreleri önce HBSS ile durulayarak hücreleri geçin ve 30 saniye beklettikten sonra çıkarın. 1 mL enzimatik olmayan hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 °C'de 4 dakika inkübe edin. 10 μM Y-27632 içeren SCM ile plakayı hazırlayın.
    2. Enzimatik olmayan hücre ayrışma reaktifini aspire edin ve her oyuğa 1 mL SCM + 10 μM Y-27632 ekleyin. Kuyucuğu bir hücre kaldırıcı ile nazikçe kazıyın ve 1000 μL'lik bir pipetle hücreler elde edin.
    3. Hücreleri, toplam 8 mL SCM + Y-27632 hacminde LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi kaplı 75 mm'lik şişe üzerine biriktirin.

2. Mikroglia farklılaşması

NOT: Mikroglia farklılaşma protokolünü özetleyen bir şema Şekil 1A'da gösterilmiştir. Besiyeri kullanılmadan önce oda sıcaklığına ısıtıldı.

  1. 0. Gün: 80 ng/mL BMP-4 ile desteklenmiş SCM besiyeri ile tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin. 1-3. Günler boyunca, ortam değişiklikleri arasında herhangi bir yıkama yapmadan aynı ortamla günlük ortam değişiklikleri yapın.
  2. 4. Gün: 4-5. Gün ortamını hazırlayın: 25 ng/mL FGF, 100 ng/mL SCF ve 80 ng/mL VEGF ile desteklenmiş hematopoietik ortam (HM). Ortamı çıkarın ve 5 μM Y-27632 içeren Gün 4-5 ortamı ile değiştirin.
    NOT: Hücreler bu noktada yüzmeye başlar - hücrelerin yaklaşık yarısı yüzer ve yarısı yapışır.
  3. 6. Gün: 6-13. günü hazırlayın orta: 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL IL-3, 5 ng/mL TPO, 50 ng/mL m-CSF ve 50 ng/mL Flt3-L ile desteklenmiş HM. Süpernatanı toplayın, 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin ve 300 x g'da 8 dakika aşağı döndürün. Peletleri, 5 μM Y-27632 ile desteklenmiş 8 mL Gün 6-13 ortamı ile bir şişede yeniden süspanse edin.
  4. 10. Gün: Mevcut ortamın üzerine 8 mL 6-13. gün ortamı ekleyin.
  5. 14. Gün: 14. Gün + orta: 50 ng/mL m-CSF, 50 ng/mL Flt3-L, 50 ng/mL GM-CSF ile desteklenmiş HM. Süpernatanı toplayın, 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin ve 300 x g'da 8 dakika döndürün. Pelet, 5 μM Y-27632 içeren 14+ Günün 8 mL'sinde yeniden süspanse edin ve bu ortamda kültüre devam edin.
  6. 18. Gün: 8 mL Day14+ medium ekleyin.
  7. 22. Gün: Mevcut ortamı çıkarmadan 8 mL taze Day14+ ortamı ekleyin.
  8. 25. Gün: Hücreleri adım 2.9'a taşıyın veya farklılaşmanın 50. gününe kadar Day14+ ortamında tutmaya devam edin.
  9. 25. günden sonra, süpernatanı 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve 300 x g'da 8 dakika döndürün.
    1. Yapışkan ortam hazırlayın: % 0.85 NaCl çözeltisinde% 1 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid, 25 ng / mL GM-SCF ve 100 ng / mL IL-34 ile desteklenmiş RPMI.
    2. Peletleri 5 μM Y-27632 içeren yapışkan ortamda yeniden süspanse edin.
    3. Farklı deneyler için 24 oyuklu plakalar üzerindecm2 başına 50.000 hücre yoğunluğunda plaka hücreleri: Mikroglial monokültür için LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matris kaplı plakalar, görüntüleme deneyleri için 10 μg/mL poli-L-ornitin ve 10 μg/mL laminin kaplı cam görüntüleme plakaları.
    4. Poli-L-ornitin ve laminini DPBS'de seyreltin ve 24 kuyulu bir görüntüleme plakası için 250 μL / kuyu ekleyin.
      NOT: Kültürdeki hücreler artık doğada yapışıktır (Şekil 1C).
  10. Hücreleri kültürde en az 14 gün boyunca tutun ve iki haftada bir ortam değişiklikleri yapın. Yapışma sonrası 14. günden sonra hücreler olgunlaşmaya ulaşmıştır ve deneyler için kullanılabilir.

3. Kortikal nöron farklılaşması

NOT: Kortikal nöron farklılaşma protokolünü özetleyen bir şema Şekil 1G'de gösterilmiştir.

  1. Gün 0:
    1. iPSC'ler LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörlü bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde birleştiğinde, SCM'den 10 μM SB431542, 1 μM dorsomorfin, 100 nM LDN193189 ile desteklenmiş 50/50 N2/B27 ortamı karışımına geçin.
      NOT: N2 besiyeri, %1 N-2 takviyesi, %0.85 NaCl çözeltisi içinde %1 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptit, %1 kalem/streptokok ile desteklenmiş bazal besiyerinden oluşur. B27 besiyeri, %2 B-27 takviyesi, %0.85 NaCl çözeltisi içinde %1 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid, %1 pen/strep ile desteklenmiş DMEM/F12'den oluşur.
    2. Ortamı, 7 gün boyunca günlük olarak eklenen yukarıdaki takviyelerle değiştirin.
  2. 7. Gün:
    1. Plakaları LDEV içermeyen indirgenmiş büyüme faktörlü bazal membran matrisinde en az 2 saat ön kaplama.
    2. Hücreleri 1:1 oranında önceden kaplanmış plakalara geçirin. Hücreleri 1 mL / kuyucuk HBSS ile durulayın ve 30 saniye beklettikten sonra çıkarın. 1 mL / kuyucuk hücre ayırma ortamı (örneğin, Accutase) ekleyin ve 37 ° C'de 4-5 dakika inkübe edin. İnkübe ederken, 5 mL DMEM ile 15 mL konik tüpler hazırlayın.
    3. Hücreleri plakadan çıkarmak için enzimatik ayrışma maddesini bir P1000 pipetleyici ile nazikçe pipetleyin. Enzimatik ayrışma ajanı ve hücre karışımını 5 mL DMEM içeren 15 mL konik tüpte toplayın.
    4. Tüpleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Pelet, 10 μM Y-27632 içeren 1 mL N2/B27 ortamında yeniden süspanse edin. Herhangi bir takviye olmadan N2 / B27 ortamı ile günlük beslemelere devam edin.
  3. 12. Gün: 3.2.2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri 1:1 geçin. N2 / B27 ortamı ile günlük beslemelere devam edin.
  4. 15/16. Gün: 3.2.2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri 1:2 pasaj. N2 / B27 ortamı ile günlük beslemelere devam edin.
  5. 18/19. Gün: 3.2.2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri 1:3 pasaj. 25. güne kadar N2 / B27 ortamı ile günlük beslemelere devam edin.
  6. 25. Gün: 10 μM DAPT ile desteklenmiş N2 / B27 ortamlı besleme hücreleri.
  7. 28. Gün: Hücreleri taze, işlenmemiş N2 / B27 ortamı ile besleyin.
  8. 30. Gün: 3.2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri mikroglia kültür plakalarına geçirin ve %1 B-27 takviyesi ile takviye edilmiş BrainPhys ortamında muhafaza edin.

4. Mikroglia/nöron ko-kültürleri

  1. Plaka Günü:cm2'de 50.000 hücre yoğunluğunda mikroglial kültürlerin üstünde 30 kortikal nöron. Hücre yapışmasını iyileştirmek için ortamı laminin 1 μg/mL ile destekleyin.
  2. Kültürleri% 1 B-27 takviyesi ile desteklenmiş% 50 yapışkan ortam ve% 50 Brainohys ortamı karışımında koruyun. Deney yapılana kadar iki haftada bir yarı-orta değişim yapın.
  3. Nöronlar 60. güne ulaştıktan sonra deneyler yapın.

5. İnterferon γ tedavisi

  1. 100 ng / mL IFN-γ ile desteklenmiş taze ortam hazırlayın. Ortamı ekleyin ve 24 saat inkübe etmesine izin verin. Ortamı çıkarın ve denemeye devam edin.

6. İmmünositokimya

  1. Hücreleri 100 μL% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kültür kabına sabitleyin.
  2. Hücreleri 1 mL PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
  3. 10 dakika boyunca 1 mL PBST (PBS +% 0.1 Triton X) ekleyin.
  4. Bloke edici tampon ekleyin: 1 mL PBS artı 1 saat boyunca% 5 keçi serumu.
  5. 100 μL PBS +% 1 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor ekleyin - gece boyunca 4 ° C'de. Tüm primer antikorları buna göre optimize edin.
  6. Hücreleri 1 mL PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
  7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL PBS ve% 1 keçi serumu ile seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.

7. Omurga analizi

  1. Konfokal mikroskopta 60x büyütmede görüntüler elde edin.
  2. Görüntüleri analiz etmek için ImageJ işlevi NeuronJ52'yi kullanın.
  3. NeuronJ aracılığıyla nörit uzunluğu, omurga uzunluğu ve omurga sayısı için ölçümler elde edin.

8. Kalsiyum görüntüleme

  1. 3 μM Fluo-4AM boya ile taze ortam hazırlayın. Ko-kültürleri bu ortamda 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile durulayın, hücrelere canlı hücre görüntüleme solüsyonu ekleyin ve görüntülemeye devam edin.
  2. Canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, 2 dakika boyunca 40x'te hızlandırılmış görüntüler elde edin. Aktivite, başlangıçta, 15 mM glutamata maruz kalma ile veya 5 mM potasyum klorür ile depolarizasyon ortamında kaydedilebilir.
  3. ImageJ'yi kullanarak, tek tek hücre gövdeleri için zaman içindeki floresan yoğunluğunu ölçün. Seçim aracını kullanarak, her hücre gövdesini çevreleyen ayrı bir ilgi alanı (ROI) seçin. ROI Yöneticisi'ni açın ve seçmek için Ekle'ye basın. ROI yöneticisine yeni seçimler eklemeye devam edin.
  4. Ortalama Gri Alanı ölçmek için Ölçümleri Ayarla aracını kullanın. İstenen hücre gövdelerinin sayısı ROI yöneticisine eklendiğinde, hepsini seçin ve ardından Çoklu Ölçüm aracını kullanın. Bu, video dosyasının zaman boyunca her biri için ortalama gri alanın bir okumasını sağlayacaktır. Dışa aktarılan veriler, her kare için ilgilenilen bölge için ortalama floresan yoğunluğunu verecektir.
  5. Floresan yoğunluk oranını, F / F0'ı belirleyin, burada F belirli bir zamandaki floresan yoğunluğu ve F0 ilk floresan yoğunluğudur. F / F0 , nöronlardaki spontan aktiviteyi incelemek için zaman içinde grafiklendirilebilir veya stimülasyon ortamında maksimum floresan yoğunluğunda incelenebilir.

Sonuçlar

Protokol Doğrulama
iPSC'den türetilen mikroglia, üç farklı farklılaşma turu boyunca yedi iPSC hattından üretildi. ML27, ML56, ML292 ve ML364 kontrol iPSC hatları ve ML40, ML141 ve ML250 şizofreni iPSC hatları kullanıldı. Bu iPSC hatlarının karakterizasyonu daha önce açıklanmıştır51. Bu iPSC'den türetilen mikroglia, ICC ve qPCR kullanılarak doğrulandı. Uyarlanmış protokolden üretilen mikroglia, tipik dallanmış mikr...

Tartışmalar

Pluripotent kök hücreler için farklı yörüngeler boyunca farklılaşma yöntemlerinin geliştirilmesi, beyin fonksiyonu ve hastalık süreçlerinin araştırılması için birçok yol açmıştır 53,54,55. İlk çalışmalar, belirli beyin bozukluklarında önemli olduğu varsayılan belirli nöronal hücre tiplerinin geliştirilmesine odaklanmıştı56,57

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Yenilikçi Yeni Bilim İnsanları için Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Biyodavranışsal Araştırma Ödülleri (BRAINS) Ödülü R01MH113858 (R.K.'ye), Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Klinik Bilim İnsanı Geliştirme Ödülü K08MH086846 (R.K.'ye), Doris Duke Charitable Foundation Klinik Bilim İnsanı Geliştirme Ödülü (R.K.'ye), Ryan Licht Sang Bipolar Vakfı (R.K.'ye), Jeanne Marie Lee-Osterhaus Aile Vakfı ve NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı (A.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Vakfı (R.K.), Harvard Kök Hücre Enstitüsü (R.K.) ve Steve Willis ve Elissa Freud (R.K.). Harvard Tıp Fakültesi ve McLean Hastanesi'nden Dr. Bruce M. Cohen ve Dr. Donna McPhie'ye çalışmada kullanılan fibroblastları bize sağladıkları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C antibodyBiolegend337207Dilution 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 antibodyAbcamab18465
CUTL1 monoclonal antibodyAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture FlasksNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Goat SerumSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 antibodyAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 antibodySynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 supplementGibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 antibodyBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 antibodyAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom PlateGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 antibodyAbcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris1254

Referanslar

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698 (2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224 (2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -. H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218 (2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075 (2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238 (2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1 (2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629 (2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Birlikte k lt rlemeMikrogliaKortikal N ronlarnsan Kaynakl Pluripotent K k H crelerIPSC lerN ropsikiyatrik BozukluklarBelirte AnaliziGer ek Zamanl PCRDendritik DikenlerProinflamatuar SitokinlerKalsiyum G r nt lemeFloresan Yo unlu uImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır