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要約

このプロトコルは、ヒトの神経細胞とミクログリアを用いた神経免疫相互作用の機構的基盤を研究するために、ミクログリアをヒトiPS細胞と区別し、それらをiPS細胞由来皮質ニューロンと共培養する方法論を説明しています。

要約

ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からミクログリアを作製する能力は、健康と疾患におけるミクログリアの役割を調査するための新しいツールと手段を提供します。さらに、iPS細胞由来のミクログリアは、iPS細胞由来の皮質ニューロンと共培養することで維持できるため、多くの精神神経疾患において調節不全とされるミクログリアとニューロンの相互作用を調べることができます。ヒトiPS細胞は、Fossatiグループが開発したプロトコルの適応バージョンを使用してミクログリアを生成するように分化され、iPS細胞由来のミクログリアはマーカー分析とリアルタイムPCRによって検証されました。このプロトコルを使用して生成されたヒトミクログリアは、マーカーCD11C、IBA1、P2RY12、およびTMEM119に対して陽性であり、ミクログリア関連遺伝子AIF1、CX3CR1、ITGAM、ITGAX、P2RY12、およびTMEM119を発現しました。30日間分化させたヒトiPS細胞由来皮質ニューロンにミクログリアを播種し、実験を行う60日目まで共培養で維持しました。ミクログリアとの共培養における皮質ニューロンの樹状突起スパインの密度は、ベースライン条件下で、および炎症誘発性サイトカインの存在下で定量化されました。ミクログリアが神経細胞の機能をどのように調節するかを調べるために、カルシウムインジケーターFluo-4 AMを用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング実験を行った。皮質ニューロンの生きたカルシウム活性を共焦点顕微鏡を用いて取得し、蛍光強度をImageJを用いて定量化した。本報告では、ヒトiPS細胞由来のミクログリアと皮質ニューロンを共培養することで、ミクログリアが皮質ニューロンに及ぼす影響を調べるための新しいアプローチがどのように提供されるかについて説明します。

概要

ヒトの脳では、ミクログリアが主要な自然免疫細胞です1。脳の発達は、拡散性因子の放出と食作用1の2つの経路を介してミクログリアによって調節されています。ミクログリア由来の拡散因子は、髄鞘形成、神経新生、シナプス形成、成熟、細胞死、細胞生存をサポートします1。ミクログリアはまた、脳のシナプス、軸索、および生細胞と死細胞の両方のさまざまな要素を食作用します2,3,4,5,6,7,8。ミクログリア上の受容体は、カルレティキュリン、ATP、シアル酸などのタグを認識し、細胞の食作用を調節します9,10。海馬では、ミクログリアはその食作用的役割を通じて神経新生の恒常性を維持している11。

げっ歯類の脳の背外側膝状核(dLGN)のシナプス食作用は、ミクログリア1によって制御されていることが示されています。げっ歯類では、発達中に激しいミクログリアシナプス食作用が観察される2つの期間があることが示されています。第1の期間は最初のシナプス形成中に発生し、第2の期間は接続が微調整され、剪定されているときに発生する12。シナプス刈り込みに関与する他の因子は、炎症性タンパク質とクラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC1、H2-KbおよびDb)13,14である。ミクログリア上のC1q(補体成分1q)はMHC1と共局在し、それがシナプス刈り込みを引き起こすことが示唆されている15。さらに、マウスの研究により、アストロサイトから分泌されるインターロイキン-33(IL-33)は、ミクログリアへの影響を通じて視床と脊髄のシナプス恒常性を調節することが示されているが、これはヒトではまだ調査されていない13。ミクログリアは、腫瘍壊死因子α(TNFα)、IL-1β、IL-6、IL-10、インターフェロンγ(IFN-γ)など、ニューロンの健康維持に役立つさまざまなサイトカインを分泌し、これらのサイトカインは樹状突起スパインとシナプス形成を調節することができる16,17,18。ヒトの脳の発達におけるニューロンとミクログリアの相互作用に関する知識には、大きなギャップがあります。私たちの知識のほとんどはげっ歯類モデルからの研究から来ていますが、人間の皮質におけるシナプス刈り込みの時間的および機構的側面に関する情報は不足しています。ミクログリアは新皮質のニューロンの生存をサポートし、他の細胞タイプも同様に寄与しています1。ミクログリアがこの保存にどのように寄与しているのか、またミクログリアと他の細胞種との相互作用がどのようなものなのかは明らかではありません。ミクログリアは、ニューロンおよびシナプスの発達に影響を与えるいくつかのサイトカインを放出しますが、ニューロンにおけるこれらのサイトカインの影響のメカニズム的基礎はほとんど不明です19,20。ヒトの脳におけるミクログリアの機能をより完全に理解するためには、ヒトの脳に見られるさまざまな細胞タイプとの相互作用を調査することが重要です。本報告では、ヒトiPS細胞由来の神経細胞と同一個体から作製したミクログリアを共培養する方法について述べる。この方法論を確立することで、ミクログリアとニューロンの相互作用の性質を調査するための明確な研究が可能になり、さまざまな神経発達障害や神経精神障害の文脈で神経免疫機能障害を研究するための堅牢なin vitro細胞モデルを開発することができます。

統合失調症におけるミクログリアの役割
シナプス刈り込みは、思春期の脳で起こる主要な神経発達過程である21,22。この臨界期のシナプス剪定が統合失調症(SCZ)では異常であることを示唆する複数の証拠がある23,24,25,26。SCZは、幻覚、妄想、思考プロセスの障害、認知障害を特徴とする慢性の衰弱性精神障害である23,24。脳内に常在するマクロファージであるミクログリアは、シナプスの剪定において中心的な役割を果たしている25,26。死後および陽電子放出断層撮影法(PET)研究は、SCZ25、26、27、28、29、30、31、32における機能不全のミクログリア活動の証拠を示しています。死後SCZ脳は、脳内でよく再現されたが微妙な違いを示している - 皮質層IIIの錐体ニューロンは、樹状突起スパイン密度の減少とシナプスの減少を示している33,34,35。シナプス剪定は、SCZ患者が通常最初の精神病の休憩を経験する青年期に、過剰な興奮性シナプス結合がミクログリアによって排除されるプロセスです22,36。死後研究では、SCZとミクログリアの活性化との関連が示されており、SCZ脳内のミクログリアの密度が増加し、炎症誘発性遺伝子の発現が増加しています27。さらに、ミクログリアの活性化に放射性リガンドを使用したヒトの脳のPET研究では、皮質25,26,27,28の活性化されたミクログリアのレベルが増加していることが示されています。最近のゲノムワイド関連解析(GWAS)は、SCZの最も強い遺伝的関連が主要組織適合遺伝子複合体(MHC)遺伝子座に存在することを示しており、この関連は、げっ歯類の出生後のシナプス剪定の媒介に関与する補体成分4(C4)遺伝子の対立遺伝子から生じている37。この関連性は、ミクログリアによる異常な刈り込みがSCZの死後脳に見られる樹状突起スパイン密度の低下をもたらす可能性があるという仮説をさらに支持しています。SCZにおけるシナプス刈り込みにおけるミクログリアの関与に関する調査は、これまでPETイメージングによる間接的な研究または死後脳の研究からの推論に限定されてきた。

実験室でのヒトミクログリアの生成
培養された初代マウスミクログリアは、ミクログリアの研究に頻繁に使用されてきたが、げっ歯類のミクログリアがヒトのミクログリアの解剖学的構造および遺伝子発現を代表していない可能性があるといういくつかの兆候がある(表1)38。いくつかの研究では、ミクログリアを分化転換を通じて血液単球から直接区別することも行われています39,40,41,42。血液単球由来のミクログリア様細胞は、遺伝子およびタンパク質発現プロファイルの炎症誘発性応答においてヒトミクログリアと大きな違いを示し、生物学ではよりマクロファージ様であるように見えます43。近年の方法論の進歩により、ヒトiPS細胞からのミクログリアの作製が可能になり、ヒトの脳に見られるミクログリアの生物学により正確に類似した生きたミクログリアを研究する機会が提供されています(表2)。これらのiPS細胞由来ミクログリア細胞は、初代ヒトミクログリア44,45,46,47,48の表現型、遺伝子発現プロファイル、および機能特性を再現することが示されています。この論文では、ヒトiPS細胞由来のニューロンと、同じ個体から生成されたミクログリアを共培養する方法を提供し、ニューロンとミクログリアの相互作用のパーソナライズされたin vitroモデルを開発します。このin vitro共培養モデルでは、Fossatiグループからのミクログリア分化プロトコルを適応させ(表3)、Liveseyグループからの皮質ニューロン生成プロトコルの適応バージョンと組み合わせた(表4)49,50。

プロトコル

この研究で使用されたヒトiPS細胞は、健康な対照被験者からのインフォームドコンセントを通じて得られた線維芽細胞から再プログラムされ、施設内審査委員会(IRB)の承認を得ました。この研究で使用されたiPS細胞(ML15、ML27、ML40、ML56、ML141、ML 250、ML292)のリプログラミングと特性評価は、以前の研究51で説明されています。

1. iPS細胞のメンテナンス

  1. フェノールレッドを含まないDMEM/F12中のLDEVフリーの還元成長因子基底膜マトリックスを1:50に希釈し、6ウェルプレートに1 mLの希釈溶液をプレコートしてから、細胞ストックを解凍する前に37°Cで少なくとも2時間プレコートします。
  2. 凍結保存したiPS細胞ストックを37°Cのウォーターバスで2分間解凍します。5 mLのDMEM/F12が入った15 mLの遠心チューブに細胞を添加します。細胞を300 x g で5分間スピンダウンします。
  3. プレコートされたLDEVフリーの低成長因子基底膜マトリックスプレートからコーティング溶液を取り出し、10 μMのRock阻害剤(Y-27632)を含む幹細胞培地(SCM)1 mLを加えます。
  4. 細胞ペレットを10 μM Y-27632でSCMに再懸濁し、プレコートプレートに加えて、最終容量2 mLのSCMとY-27632を加えます。この培地でiPS細胞培養液を37°Cのインキュベーターで24時間保持します。
  5. 解凍後24時間後に、Y-27632を含まない2mLの新鮮なSCMと培地を交換します。
  6. iPS細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、LDEVフリーの低成長因子基底膜マトリックスでコーティングした75 mLフラスコにiPS細胞を継ぎます。
    1. 最初にHBSSで細胞をすすぎ、30秒間放置した後に細胞を分離して細胞を継代します。1 mLの非酵素的細胞解離試薬を添加し、37°Cで4分間インキュベートします。 10 μM Y-27632を含むSCMでプレートを調製します。
    2. 非酵素的細胞解離試薬を吸引し、各ウェルに1 mLのSCM + 10 μM Y-27632を添加します。セルリフターでウェルを優しくこすり落とし、1000μLのピペットで細胞を採取します。
    3. LSEVフリーの低成長因子基底膜マトリックスコーティング75 mmフラスコに細胞を、総容量8 mLのSCM + Y-27632で沈着させます。

2. ミクログリアの分化

注:ミクログリア分化プロトコルの概要を示す概略図を 図1Aに示します。メディアは使用前に室温まで温めました。

  1. 0日目:80 ng / mL BMP-4を補充したSCM培地で完全な培地交換を行います。1日目から3日目まで、この同じ培地で毎日培地交換を行い、培地交換の合間に洗浄する必要はありません。
  2. 4日目:4〜5日目の培地を調製します:造血培地(HM)、25 ng / mL FGF、100 ng / mL SCF、および80 ng / mL VEGFを補充します。培地を取り出し、5 μM Y-27632 を含む 4-5 日目の培地と交換します。
    注:この時点で細胞は浮き始めます-細胞の約半分が浮いており、半分が接着しています。
  3. 6日目:6-13日目の培地を調製する:HMに50 ng/mL SCF、50 ng/mL IL-3、5 ng/mL TPO、50 ng/mL m-CSF、および50 ng/mL Flt3-Lを添加します。上清を収集し、15 mLコニカルチューブに加え、300 x gで8分間スピンダウンします。ペレットをフラスコに再懸濁し、5 μM Y-27632 を添加した Day 6-13 培地 8 mL を入れます。
  4. 10日目:既存の培地の上に8mLのDay 6-13培地を追加します。
  5. 14日目:14日目+培地を調製:HMに50 ng/mL m-CSF、50 ng/mL Flt3-L、50 ng/mL GM-CSF。上清を採取し、50 mLのコニカルチューブに加え、300 x gで8分間スピンダウンします。5 μM Y-27632を含むDay 14+培地8 mLにペレットを再懸濁し、この培地で培養を続けます。
  6. 18日目:Day14+培地8mLを加えます。
  7. 22日目:既存の培地を取り出さずに、新鮮なDay14+培地8mLを追加します。
  8. 25日目:細胞をステップ2.9に移動するか、分化の50日目までDay14+培地で維持し続けます。
  9. 25日目以降、上清を50 mLの円錐チューブに集め、300 x gで8分間スピンダウンします。
    1. 接着培地を調製する:RPMIに200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドの1%を0.85% NaCl溶液、25 ng/mL GM-SCF、および100 ng/mL IL-34で添加。
    2. ペレットを5 μM Y-27632を含む付着培地に再懸濁します。
    3. さまざまな実験用の24ウェルプレート上の50,000細胞/cm2 の密度のプレート細胞:ミクログリアモノカルチャー用のLDEVフリーの低成長因子基底膜マトリックスコーティングプレート、イメージング実験用の10μg/mLポリL-オルニチンおよび10μg/mLラミニンコーティングガラスイメージングプレート。
    4. ポリ-L-オルニチンとラミニンをDPBSで希釈し、250 μL/ウェルを添加して24ウェルイメージングプレートにします。
      注:培養中の細胞は、現在、自然界に付着しています(図1C)。
  10. 細胞を少なくとも14日間培養し、隔週で培地を交換します。接着後14日目以降、細胞は成熟に達し、実験に使用できます。

3. 皮質ニューロンの分化

注:皮質ニューロン分化プロトコルを概説する概略図を 図1Gに示します。

  1. 0日目:
    1. iPSCがLDEVフリーの低成長因子基底膜マトリックスコーティングプレート上でコンフルエントになったら、SCMからN2/B27培地の50/50混合物に10 μM SB431542、1 μMドルソモルフィン、100 nM LDN193189を添加したN2/B27培地に切り替えます。
      注:N2培地は、1%N-2サプリメント、1%200mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、0.85%NaCl溶液、1%ペン/連鎖球菌を添加した基礎培地で構成されています。B27培地は、DMEM/F12に2%B-27サプリメント、1% 200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを0.85% NaCl溶液に添加したもの、1%ペン/連鎖球菌で構成されています。
    2. 上記のサプリメントを7日間毎日追加して培地を変更します。
  2. 7日目:
    1. LDEVフリーの還元成長因子基底膜マトリックスにプレートを少なくとも2時間プレコートします。
    2. プレコートされたプレートにセルを1:1で継代します。細胞を1 mL/well HBSSですすぎ、30秒間放置した後、細胞を取り出します。細胞剥離培地(Accutaseなど)を1 mL/ウェル加え、37°Cで4〜5分間インキュベートします。 インキュベート中に、5 mLのDMEMを含む15 mLのコニカルチューブを調製します。
    3. 酵素解離剤を静かにピペットで動かし、P1000ピペッターでプレートから細胞を除去します。酵素解離剤と細胞混合物を、5 mL DMEMを含む15 mLコニカルチューブに集めます。
    4. チューブを300 x gで5分間遠心分離します。10 μM Y-27632を含むN2/B27培地1 mLにペレットを再懸濁します。N2/B27培地をサプリメントなしで毎日摂取してください。
  3. 12日目:3.2.2で説明されている方法を使用して、セルを1:1で継ぎます。N2/B27培地で毎日給餌を続けます。
  4. 15/16日目:3.2.2で説明されている方法を使用して、継代セル1:2。N2/B27培地で毎日給餌を続けます。
  5. 18/19日目:3.2.2で説明されている方法を使用した継代セル1:3。N2/B27培地を25日目まで毎日摂食し続けます。
  6. 25日目:N2/B27培地に10μMのDAPTを添加した細胞を給餌します。
  7. 28日目:新鮮な未処理のN2/B27培地を細胞に供給します。
  8. 30日目:3.2に記載の方法を用いて細胞をミクログリア培養プレートに継代し、1% B-27サプリメントを添加したBrainPhys培地で維持します。

4. ミクログリア/ニューロン共培養

  1. プレート30日目の皮質ニューロンをミクログリア培養の上に50,000細胞/cm2の密度で。培地にラミニン1 μg/mLを添加して、細胞の接着を改善します。
  2. 50%の付着培地と50%のBrainohys培地に1%のB-27サプリメントを添加した混合物で培養を維持します。実験まで隔週で半中程度の変更を行います。
  3. ニューロンが60日目に達した後に実験を行います。

5. インターフェロンγ治療

  1. 100 ng/mL IFN-γを添加した新鮮な培地を調製します。培地を加え、24時間インキュベートします。培地を取り出して、実験に進みます。

6. 免疫細胞化学

  1. 培養皿内の細胞を4%パラホルムアルデヒド100μLで室温で20分間固定します。
  2. 1 mLのPBSで細胞を5分間ずつ3回すすぎます。
  3. PBST(PBS + 0.1% Triton X)1 mLを10分間加えます。
  4. ブロッキングバッファーを添加します:PBS1 mLと5%ヤギ血清を1時間。
  5. 100 μLのPBS + 1%ヤギ血清で希釈した一次抗体を4°Cで一晩加えます。 それに応じて、すべての一次抗体を最適化します。
  6. 1 mLのPBSで細胞を5分間ずつ3回すすぎます。
  7. 100 μLのPBSと1%ヤギ血清で希釈した二次抗体を室温で1時間加えます。

7. スパイン解析

  1. 共焦点顕微鏡で60倍の倍率で画像を取得します。
  2. ImageJ 関数 NeuronJ52 を使用して画像を解析します。
  3. NeuronJを通じて、神経突起の長さ、脊椎の長さ、および脊椎数の測定値を取得します。

8. カルシウムイメージング

  1. 3 μM Fluo-4AM色素で新鮮な培地を調製します。この培地で共培養物を37°Cで30分間インキュベートします。 その後、PBSで細胞をすすぎ、細胞に生細胞イメージング溶液を添加して、イメージングに進みます。
  2. 生細胞イメージング用に装備された共焦点顕微鏡を使用して、40倍で2分間のタイムラプス画像を取得します。活動は、ベースラインで15 mMグルタミン酸に曝露した場合、または5 mM塩化カリウムによる脱分極の設定で記録できます。
  3. ImageJを使用して、個々の細胞体の蛍光強度を経時的に測定します。選択ツールを使用して、各セル本体を囲む個々の関心領域(ROI)を選択します。 ROI マネージャー を開き、[ 追加 ] を押して選択します。ROI マネージャーに新しい選択項目を引き続き追加します。
  4. [計測値の設定 (Set Measurements)] ツールを使用して、平均グレー エリアを計測します。必要なセルボディの数がROIマネージャーに追加されたら、それらすべてを選択し、Multi-Measureツールを使用します。これにより、ビデオ ファイルの経時的な各平均グレー エリアが読み出されます。エクスポートされたデータから、各フレームの関心領域の平均蛍光強度が得られます。
  5. 蛍光強度比 F/F0 を求めます。ここで、F は特定の時間における蛍光強度、F0 は初期蛍光強度です。F/F0 は、ニューロンの自発的な活動を調べるために経時的にグラフ化したり、刺激の設定で最大蛍光強度で調べたりすることができます。

結果

プロトコル検証
iPS細胞由来のミクログリアは、7つのiPS細胞系統から3つの異なる分化ラウンドで作製されました。制御iPS細胞ラインML27、ML56、ML292、ML364、統合失調症iPS細胞ラインML40、ML141、ML250を用いた。これらのiPS細胞株の特性評価は、前述した51。これらのiPS細胞由来ミクログリアは、ICCおよびqPCRを用いて検証されました。適応?...

ディスカッション

多能性幹細胞の異なる軌跡に沿った分化法の開発は、脳機能と疾患過程の研究に多くの道を開いた53,54,55。初期の研究では、特定の脳障害に重要であると仮定された特定のニューロン細胞タイプの発達に焦点を当てていました56,57。最近、脳オルガノイ?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists(BRAINS)Award R01MH113858(R.K.)、National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846(R.K.)、Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award(R.K.)、Ryan Licht Sang Bipolar Foundation(R.K.)の支援を受けました。 Jeanne Marie Lee-Osterhaus Family Foundation、Brain & Behavior Research Foundation(A.K.へ)、Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation(R.K.へ)、Harvard Stem Cell Institute(R.K.へ)、Steve WillisとElissa Freud(R.K.へ)によるNARSAD Young Investigator Awardを受賞しました。この研究で使用された線維芽細胞を提供してくださったハーバード大学医学部およびマクリーン病院のBruce M. Cohen博士とDonna McPhie博士に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C antibodyBiolegend337207Dilution 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 antibodyAbcamab18465
CUTL1 monoclonal antibodyAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture FlasksNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Goat SerumSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 antibodyAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 antibodySynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 supplementGibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 antibodyBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 antibodyAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom PlateGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 antibodyAbcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris1254

参考文献

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