Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتقييم التوافق البيولوجي بسرعة للخلايا النانوية البلورية (CNC) / agarose المركبة هيدروجيل الحبر المواد الحيوية مع خلايا الصاري نخاع العظم الماوس المستمدة من حيث صلاحية الخلية والتعبير الظاهري لمستقبلات سطح الخلية، كيت (CD117) ومستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI).

Abstract

تستخدم الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المركبات القائمة على الهيدروجيل (أو أحبار المواد الحيوية) التي يتم إيداعها في نمط ، مما يشكل ركيزة تودع عليها الخلايا. لأن العديد من الأحبار المواد الحيوية يمكن أن تكون سامة للخلايا الأولية، فمن الضروري تحديد التوافق البيولوجي لهذه المركبات هيدروجيل قبل استخدامها في عمليات هندسة الأنسجة 3D مكلفة. تتطلب بعض طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك الطباعة الحيوية، أن يتم تضمين الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا وتحليلها للتغيرات في القدرة على البقاء والتعبير عن العلامات الحيوية دون إحداث ضرر ميكانيكي. يصف هذا البروتوكول بأنه دليل على المفهوم ، وهو طريقة لتقييم التوافق البيولوجي للخلايا النانوية البلورية (CNC) المدمجة مركب agarose ، ملفقة في نظام ثقافة 24 بئرا ، مع خلايا سارية مشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs) باستخدام المقايسات الخلوية التدفق لرواية الخلية والتعبير عن العلامة الحيوية.

بعد 18 ساعة من التعرض لمصفوفة CNC /agarose/D-mannitol ، لم تتغير قابلية BMMC للحياة كما تقاس نفاذية يوديد البروبيديوم (PI). ومع ذلك، BMMCs مثقف على CNC/agarose/D-مانيتول الركيزة يبدو أن زيادة طفيفة في التعبير عن مستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI) ومستقبلات عامل الخلايا الجذعية (كيت؛ CD117) ، على الرغم من أن هذا لا يبدو أن تعتمد على كمية CNC في مركب bioink. كما تم تقييم صلاحية BMMCs بعد التعرض لدورة زمنية لسقالات الهيدروجيل التي تم تصنيعها من حبر المواد الحيوية التجارية المكونة من نانوسليلوز الرجفان (FNC) وألجينات الصوديوم باستخدام طابعة بيولوجية قذف ثلاثية الأبعاد. على مدى فترة 6-48 ساعة، لم تؤثر ركائز FNC/alginate سلبا على صلاحية BMMCs كما يحددها قياس التدفق الخلوي ومقايسات الميكروتتر (XTT وdhydrogenase اللاكتات). يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لفحص التوافق الكيميائي الحيوي للحبر الحيوية المرشحة بسرعة لفائدة سقالات ثلاثية الأبعاد للبذر بعد الطباعة مع الخلايا الصارية.

Introduction

وقد ركز الاهتمام الأخير في نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الاهتمام على الهيدروجيلات ومركبات الهيدروجيل. هذه المركبات بمثابة اللزوجة بعد المحاكاة الحيوية المسامية ويمكن أن تتكون من ما يصل إلى 99٪ محتوى المياه من حيث الوزن، وهو ما يماثل الأنسجة البيولوجية1،2،3. هذه السمات من مركبات هيدروجيل وبالتالي تسمح لنمو الخلايا دون التأثير على قدرتها على البقاء ووظيفتها. واحد من هذه المركبة هو نانوسليلوز البلورية (CNC)، والتي تم استخدامها كمادة تعزيز في مركبات الهيدروجيل، سقالات الخلية في تطوير يزرع المواد الحيوية، وفي ثنائي الأبعاد (2D) و 3D في ثقافة الخلايا المختبرية4،5. بالنسبة للجزء الأكبر، المصفوفات المكونة من CNC ليست سامة للخلايا الخلوية علنا إلى الخلايا الظهارية القرنية البشرية6، الخلايا الظهارية المعوية7، الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم البشري8، أو الخلايا العصبية الشبيهة9. ومع ذلك ، فإن النشاط الأيضي وانتشار الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من نخاع العظم البشري يقلل من الارتباط مع زيادة لزوجة مركبات الخلايا النانوية القائمة على الخشب ، مما يشير إلى أنه يجب اختبار تكوين المصفوفة بعناية لآثارها الضارة على وظائف الخلية8.

وبالمثل ، يمكن أن تحفز CNC الاستجابات الالتهابية في الضامة عند الاستيعاب ، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة في أنظمة زراعة الخلايا المناعية ثلاثية الأبعاد10،11. في الواقع ، هناك القليل جدا من البيانات المتاحة حول كيفية تأثير CNC على استجابات الخلايا المناعية الأخرى ، وخاصة الاستجابات الالتهابية التحسسية التي تبدأها الخلايا السارية. الخلايا الصارية هي الكريات البيض الحبيبية التي تعبر عن مستقبلات IgE عالية التقارب ، FceRI ، المسؤولة عن تنشيط الاستجابات الالتهابية لمسببات الحساسية. انتشارها والتمايز تعتمد على عامل الخلايا الجذعية (SCF), الذي يربط مستقبلات التيروزين, كيت. الخلايا الصاري مشتقة من خلايا السلف نخاع العظم التي تدخل الدورة الدموية وتهاجر بعد ذلك هامشيا لتفريق في كل مكان في جميع الأنسجة البشرية12. كما تعمل الخلايا الصاري في بيئة الأنسجة 3D، فهي مرشح مثالي للخلايا المناعية لدراسة العمليات المناعية في نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر . ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد قابلة للحياة في المختبر التي تحتوي على خلايا سارية.

نظرا للطبيعة الحساسة للغاية للخلايا الصاري وميلها إلى الحصول على استجابات مؤيدة للالتهابات للمحفزات الخارجية ، يلزم النظر بعناية في مكونات المصفوفة ثلاثية الأبعاد وطريقة الطباعة الحيوية لإدخال الخلايا السارية في السقالة ثلاثية الأبعاد ، كما نوقش أكثر. يمكن تصنيع الأنسجة من فئتين واسعتين من المواد الحيوية ، أي الدينك الحيوي وحبر المواد الحيوية. ويكمن التمييز في حقيقة أن المركبات البيولوجية هي مركبات هيدروجيل محملة بالخلايا، في حين أن أحبار المواد الحيوية هي مركبات هيدروجيل خالية من الخلايا، على النحو المحدد من قبل Groll et al.13,14. وبالتالي، تحتوي البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بالأنك الحيوي على خلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، في حين أن البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بحبر المواد الحيوية تحتاج إلى بذر بخلايا بعد الطباعة. يتم إجراء التصنيع الحيوي لسقالات الثقافة من الأحبار الحيوية / الأحبار الحيوية القائمة على الهيدروجيل بشكل شائع باستخدام الطابعات الحيوية ثلاثية الأبعاد البثق ، والتي تبرز حبر bioink / biomaterial من خلال فوهة صغيرة تحت الضغط إما عن طريق المكبس الهوائي أو الميكانيكي. تقوم الطابعات الحيوية البثق بتصنيع سقالات ثلاثية الأبعاد عن طريق إيداع المنك الحيوي في أنماط مقطعية ثنائية الأبعاد مكدسة بشكل متسلسل على بعضها البعض في نهج "من أسفل إلى أعلى".

لتكون متوافقة مع الطباعة الحيوية البثق، يجب أن يكون الحبر bioink/biomaterial القائم على الهيدروجيل تمتلك خصائص التكستروبيك (القص رقيق)، حيث البوليمرات هيدروجيل المكونة للتدفق الحبر bioink / المواد الحيوية مثل السائل من خلال فوهة القنوات الدقيقة عندما تتعرض لضغوط القص، ولكن العودة إلى حالة لزجة، هلام مثل عند إزالة الإجهاد القص15 . نظرا لارتفاع محتوى المياه ، يجب ربط البوليمرات من الأحبار الحيوية / المواد الحيوية القائمة على الهيدروجيل ، إما ماديا أو مكافئا ، للحفاظ على الهندسة المعمارية والسلامة الهيكلية للبنية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد. في حالة الخلايا المحملة bioinks ، تتعرض الخلايا مباشرة لضغوط كيميائية خلال عملية الربط. عملية الخلايا البثق مغلفة داخل مصفوفة هيدروجيل bioink يخضع أيضا الخلايا لإجهاد القص، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء و / أو موت الخلية. وبمجرد طباعة نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد بيولوجيا، من الصعب التمييز بين مستويات السمية الخلوية التي تثيرها مصفوفة الهيدروجيل نفسها وعمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي. وهذا يشكل تحديا خاصا في سياق السقالات ثلاثية الأبعاد حيث تكون الخلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، مما يجعل من الصعب إزالة الخلايا لإجراء تحليلات لاحقة، مما سيضر بقابلية الخلايا الصارية للحياة.

نهج ألطف لتوليد الأنسجة ثلاثية الأبعاد يبني تحتوي على الخلايا الصاري ينطوي على بذر الخلايا في المطبوعة مسبقا، والسقالات الحبر المواد الحيوية المسامية 3D من تعليق ثقافة الخلية، مما يعزز القدرة الفطرية للخلايا الصاري للهجرة من الدورة الدموية إلى الأنسجة الطرفية. فوائد هذا النهج البذر الخلية هي ذات شقين: (1) لا تخضع الخلايا الصاري للقص والضغوط الكيميائية من عمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي، و (2) يمكن إزالة الخلايا بسهولة من سقالة 3D بعد التعرض عن طريق غسل لطيف للتحليل دون التأثير سلبا على قدرتها على البقاء. الفائدة الإضافية من البذر وتحليل صلاحية الخلية من الخلايا الصاري على 3D المطبوعة بيولوجيا، والسقالات هيدروجيل مسامية بدلا من أقراص هيدروجيل 2D هو أن السقالات هيدروجيل المطبوعة بيولوجيا 3D تلخص السمات الطوبوغرافية microscale في الأنسجة الحية ، والتي ليست موجودة بكميات كبيرة، 2D أقراص هيدروجيل مخطط. هذا النهج هو نهج مناسب وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد الآثار السامة للخلايا الكارثية المحتملة لمصفوفات هيدروجيل البيونك المرشحة على الخلايا الصارية ، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى ، قبل الاستثمار في التجارب الهندسية مكلفة الأنسجة ثلاثية الأبعاد.

Protocol

ملاحظة: يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام: (1) عزل نخاع عظم الفأر وتمايز الخلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs)، (2) تلفيق CNC/agarose/D-mannitol هيدروجيل الركائز في نظام 24 جيدا وثقافة BMMCs على الركائز، (3) إزالة BMMCs من CNC / agarose / D - mannitol هيدروجيل الركائز وتحليل الجدوى والتعبير العلامات الحيوية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، (4) الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لسقالات الهيدروجيل من الخلايا النانوية الليفية المتاحة تجاريا (FNC) / حبر المادة الحيوية المركبة الألجينات الصوديوم ، و (5) ثقافة BMMCs على سقالات هيدروجيل alginate FNC / الصوديوم وتحليل الجدوى باستخدام قياس التدفق الخلوي ، XTT ، وdhydrogenase اللاكتات (LDH) المقايسات microtrogenase (LDH).

1. جيل ثقافة BMMC

ملاحظة: تم قتل الفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون بعد تخدير الأيزوفلوران. تم عزل الساق وعظم الفخذ، وتم حصاد نخاع العظم كله. أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والسياسات الخاصة برعاية الحيوان التابعة للمجلس الكندي، بموافقة لجنة العلوم الصحية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ألبرتا.

  1. إعداد كامل RPMI-1640 ثقافة المتوسطة بإضافة المكملات المدرجة في الجدول 1 إلى التركيزات النهائية المشار إليها. ضبط درجة الحموضة من المتوسط إلى 7.4-7.6 باستخدام NaOH، تصفية تعقيم باستخدام استخدام واحد، زجاجة أعلى مرشح (0.2 ميكرومتر حجم المسام)، وتخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. الحصول على عظم الفخذ من الفئران وفقا لبروتوكولات وإجراءات لجنة رعاية الحيوان في الجامعة المحلية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم عزل عظم الفخذ من الفئران C57BL/6، ولكن يمكن استخدام أي سلالة إذا كانت ذات صلة بالدراسة.
  3. باستخدام مقص، وإزالة الجلد والعضلات من مفصل الورك، ومن ثم سحب عظم الفخذ بلطف عن طريق التواء قليلا من مقبس الورك (الشكل 1). يجب الحرص على عدم قطع رأس الفخذ. قطع الساق بعيدا عن عظم الفخذ في fabella وسيطة باستخدام مقص. إزالة مخلب عن طريق قطع فقط فوق calcaneum وتجاهل.
  4. باستخدام مشرط، وإزالة الجلد والغضاريف من عظم الفخذ والساق القطع. باستخدام مقص، وجعل قطع نظيفة على كل طرف من عظم الفخذ والساق، وفضح نخاع العظام الحمراء داخل. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الشظية عند هذه النقطة، ولكن لاحظ أنها قد تساعد في التلاعب في الساق أثناء تنظيف نخاع العظم.
  5. إعداد إبرة 26 G مع حقنة 5 مل luer قفل، وملء مع ما يقرب من 5 مل من وسائل الإعلام كاملة أعدت على النحو المبين أعلاه.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، RPMI غير مكتملة بدون إضافات يمكن أيضا استخدامها لحفظ على الكواشف.
  6. عقد عظم الفخذ أو الساق مع ملقط، إدراج الإبرة في نهاية واحدة من العظام واضغط بلطف المحاقن. عقد العظام أكثر من 50 مل أنبوب مخروطي معقم، وحقن بلطف ما يقرب من 5 مل من المتوسطة في العظام، وتطبيق بعض الضغط. مراقبة قطعة من نخاع العظام تسقط الطرف الآخر من العظام وشرائط حمراء رقيقة وفي أنبوب مخروطي.
  7. تدور أسفل أسبيراتس وإعادة الإنفاق في وسط كامل، أو نقل مباشرة إلى قارورة زراعة الأنسجة العقيمة T175 سم2 التي تحتوي على 50 مل من RPMI-1640 المتوسطة كاملة. الحفاظ على أسبيراتس في المتوسط RPMI-1640 كاملة مع 30 نانوغرام / مل فأرة إنترلوكين المؤتلف (IL)-3.
  8. بعد يوم واحد، مراقبة الثقافات تحت المجهر الخفيف. وسوف تتكون الثقافة من مجموعة غير متجانسة من الخلايا ذات الأشكال والأحجام المختلفة وحتى قطع أكبر من نخاع العظام. تغذية ثقافات الخلية بإضافة 15 مل من المتوسط الطازج كل 3-5 أيام باستخدام المتوسطة RPMI-1640 كاملة كما هو موضح أعلاه، وضمان كثافة الخلية لا يتجاوز أبدا 1 × 106 خلايا / مل. مرة واحدة في الأسبوع، تدور أسفل الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في RPMI-1640 المتوسطة كاملة جديدة، وتقسيم 1:4 إلى 50 مل من المتوسطة في قوارير T175 الطازجة.
  9. بعد 4 أسابيع، حدد نقاء الخلية عن طريق قياس التعبير السطحي لمستقبلات CD117 (Kit) و FceRI حسب قياس التدفق الخلوي كما هو موضح أدناه (القسم 3.2).
    ملاحظة: بعد 4 أسابيع، يجب أن تكون 99٪ من الخلايا إيجابية مزدوجة ل CD117 (كيت) و FcεRI.
  10. في 4 أسابيع وما بعدها، والحفاظ على BMMCs مع 20 نانوغرام / مل من IL-3 في المتوسط RPMI-1640 كاملة. في حوالي 6 أسابيع، ستتوقف الخلايا عن الانقسام ولن تحتاج بعد الآن إلى تقسيم. تغذية الثقافات كل 3-5 أيام، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة في الأسبوع، وإعادة الإنفاق في RPMI-1640 المتوسطة كاملة جديدة.

2. تصنيع CNC / agarose / D - مانيتول هيدروجيل الركائز والثقافة BMMC

  1. في زجاجة، أضف 0.2 غرام من مسحوق الآغاروز إلى المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) (2٪ ث/v) إلى حجم نهائي قدره 10 مل، ويغلي لمدة دقيقة واحدة عند 100 درجة مئوية ليذوب.
  2. حل 2.5 غرام من مسحوق CNC في برنامج تلفزيوني إلى حجم نهائي من 10 مل لإعداد خليط 25٪ ث / الخامس.
  3. حل 2 غرام من مسحوق CNC في برنامج تلفزيوني إلى حجم نهائي من 10 مل لإعداد خليط 20٪ ث / الخامس، وتمييع تسلسلي 20٪ ث / الخامس خليط لإعداد 10، 5، و 2٪ ث / v CNC الخلائط.
  4. سخني خلائط 25 و20 و10 و5 و2٪ ث/v CNC إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (الشكل 2A).
  5. إضافة 0.46 غرام من D-مانيتول إلى محلول الآغاروز الساخن (4.6٪ ث / v) وتذوب.
  6. مزيج قبل تسخينها 25, 20, 10, 5 و 2٪ ث / v CNC-PBS الخلائط مع محلول الآغاروز الساخن / D-مانيتول في أنابيب مخروطية منفصلة في نسبة 1:1 إلى إنتاج تركيزات CNC النهائي من 12.5, 10, 5, 2.5, و 1٪ ث / الخامس في مخاليط الهيدروجيل.
  7. العمل بسرعة، إضافة 500 ميكرولتر / بئر من الحلول المذكورة أعلاه أعدت في الخطوة 2.6 في أربعة أضعاف إلى لوحة ثقافة 24 جيدا، والسماح للوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل البلمرة (الشكل 2B).
  8. طبقة بعناية 1000 ميكرولتر من تعليق BMMC في كثافة 1.1 × 106 خلايا / مل على رأس الركائز الهيدروجيل مع micropipettor، وتجنب لمس هلام مع غيض من ماصة لأن هذا سوف يضر سطح هلام وتوليد الجسيمات.
  9. احتضان BMMCs على ركائز الهيدروجيل في حاضنة معقمة (5٪ CO2، الغلاف الجوي المرطب) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.

3. تحليل التدفق الخلوي

  1. تحليل التدفق الخلوي لقابلية BMMC للحياة عن طريق استبعاد PI
    1. إزالة بعناية المتوسطة الثقافة التي تحتوي على BMMCs من أعلى CNC / agarose / D - mannitol ، وتجنب هلام ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الميكروفون 1.5 مل.
    2. غسل BMMCs مرتين مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 0.5٪ ث / الخامس ألبوم مصل البقر في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في 180 ميكروغرام من PBS-0.5٪ ث / v BSA إلى كثافة نهائية من 1.5 × 106 خلايا / مل. نقل الخلايا إلى 96 جيدا جولة أسفل لوحة.
      ملاحظة: تصفية تعقيم جميع PBS-0.5٪ ث / v حلول BSA مرتين باستخدام 0.2 ميكرومتر مسام الحجم مرشح حقنة, وتخزينها في 4 °C.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من PBS-0.5٪ ث / v BSA، أو 10x PI (100 ميكروغرام / مل) أعدت في PBS-0.5٪ ث / الخامس جيش الشعب الصيني، إلى الخلايا إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل، واحتضان إما 1 ساعة في 4 درجة مئوية أو 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الحصول على بيانات الفلورسينس باستخدام مقياس تدفق الخلايا المجهزة ليزر أيون الأرجون (488-514 نانومتر) ومرشح بانديباس لتمكين الكشف عن انبعاث مضان في 578 نانومتر. الحصول على 20000 حدث لكل عينة بمعدل تدفق 30 ميكرولتر / دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحليل البيانات كما هو موضح أدناه (الأقسام 3.2.7-3.2.10).
  2. تحليل التدفق الخلوي ل BMMCs لل Kit (CD117) وتعبير مستقبلات سطح FcεRI
    1. إزالة بعناية المتوسطة الثقافة التي تحتوي على BMMCs من أعلى CNC / agarose / D - mannitol ، وتجنب هلام ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الميكروفون 1.5 مل.
    2. غسل BMMCs مرتين مع PBS-0.5٪ BSA المصفاة في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ ث / الخامس BSA (1.5 × 106 خلية / مل). نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى لوحة مستديرة القاع 96 جيدا.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من حلول عمل الأجسام المضادة 10x إلى الخلايا لتحقيق تركيز نهائي من 0.06 ميكروغرام / مل من CD117 (ج كيت) - فيكوريثرين (PE) و 0.06 ميكروغرام / مل من FcεRIα-allophycocyanin (APC) ، على التوالي.
      ملاحظة: يجب إعداد حلول عمل الأجسام المضادة 10x في برنامج تلفزيوني معقم بتصفية-0.5٪ ث/v BSA.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من حلول التحكم 10x isotype التي تحتوي على إما الفئران IgG2b κ isotype control-PE أو الهامستر الأرمني IgG isotype control-APC لفصل الآبار التي تحتوي على خلايا لم تلطخ بأي من الأجسام المضادة الفلورية المقترنة في الخطوة 3.2.3.
      ملاحظة: عناصر التحكم isotype، الجرذ IgG2b κ isotype التحكم PE والأرمن الهامستر IgG isotype التحكم-APC تعمل على التحكم في مرفق غير محددة من الأجسام المضادة إلى BMMC. وبما أن مركبات BMMCs لا تعبر عن مستويات عالية من FcR ، فنادرا ما يتم اكتشاف مضان خلفية عالية مع أجسام مضادة للتحكم متساوية النوع. إعداد حلول التحكم في 10x isotype العمل في تصفية تعقيم PBS-0.5٪ ث / v BSA.
    5. احتضان لوحة 96 جيدا الجولة القاع لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية في الظلام.
    6. غسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من جديد PBS-0.5٪ ث / v BSA العازلة لكل بئر, والطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى. إزالة supernatant بعناية دون لمس بيليه الخلية; ترك وراءها بعض supernatant لضمان أن بيليه الخلية لا يزال دون عائق.
    7. بعد الغسيل، إعادة تأمين الخلايا في 100 ميكرولتر من 0.5٪ ث / v BSA، 0.05٪ ث / الخامس azide الصوديوم في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) التي تم تصفيتها معقمة مرتين مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر المسام الحجم. الحصول على بيانات الفلورسينس في قنوات الكشف PE و APC باستخدام مقياس تدفق الخلايا، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.1.3.
    8. تحليل البيانات باستخدام برامج قادرة على عرض وتحليل تدفق ملفات البيانات الخلوية مع التمديد ".fcs".
    9. ابدأ التحليل برسم مبعثر أمامي (FSC) على طول المحور x والمبعثر الجانبي (SSC) على طول المحور ص، وبوابة لمحتوى الخلية المحفوظة مع نطاق FSC من log10 1.5-5.0 ونطاق SSC من log10 0.75-3.25 في الخلايا غير المعالجة وغير الملطخة كما هو موضح في الشكل 3A(i)(ii)".
      ملاحظة: يعمل هذا على ضمان إزالة حطام الخلية ذات قيم FSC وSSC المنخفضة من التحليل. الخلايا الصارية عادة ما تكون خلايا محببة جدا (عالية SSC) وكبيرة (FSC عالية) بالمقارنة مع أنواع الخلايا المناعية الأخرى، مثل الخلايا الأحادية والخلايا الليمفاوية.
    10. بعد ذلك ، قم بتوليد مؤامرات نقطة FSC مقابل SSC وملامح المدرج التكراري للعينات غير المعالجة التي تم تلطيخها بالصبغة أو الأجسام المضادة أو عناصر التحكم متساوية النمط ، والحصول على متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) في قنوات PE أو APC وفقا لطيف الانبعاثات الخاص بالأجسام المضادة المحددة ذات الفلوروفورية المقترنة أو الصبغة المستخدمة. تطبيق نفس المجموعة من البوابات والمعلمات لجميع عينات BMMC المحتضنة مع مختلف CNC / agarose / D - mannitol الركائز وملطخة مع الضوابط isotype المقابلة ، والأجسام المضادة ، أو صبغة ؛ الحصول على مؤسسات التمويل الأصغر.
      ملاحظة: أساسا، يجب أن تكون قطع النقاط FSC مقابل SSC من العينات الملطخة غير المعالجة لا يمكن تمييزها عن العينات غير المعالجة/غير الملطخة، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.9، لضمان عدم تغيير إجراء التلطيخ لحجم الخلية (مقاسا ب FSC) أو الحبيبية (مقاسة ب SSC) (الشكل 3A(i)(ii)).
    11. حساب متوسط مؤسسات التمويل الأصغر والخطأ القياسي في المتوسط (SEM) لكل عينة من 4 تجارب مستقلة يتبعها إنشاء رسوم بيانية باستخدام حزمة برامج التحليل الإحصائي.
    12. إعداد تراكبات المدرج التكراري في برنامج تحليل البيانات الخلوية التدفق (الشكل 3B، 4A(ii)، B(ii)).

4.3D الطباعة الحيوية لركائز الهيدروجيل الألجينات في المجلس الوطني الاتحادي/الصوديوم

ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المستخدمة في هذه الدراسة هي نظام قذف هوائي مجهز برأسي طباعة مستقلين يتم التحكم في درجة حرارةهما. الحبر الحيوي المستخدمة في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي سقالات هيدروجيل وضعت من (أ) نانوسليلوز الرجفان رطب للغاية (FNC)، وهو مشابه شكليا للكولاجين، (ب) الصوديوم الجينات، و (ج) د-مانيتول. يتم توفيره كارت وتعليق هيدروجيل معقم في خراطيش 3 مل يمكن توصيل فوهات الطباعة الحيوية المخروطية المعقمة للوير قفل (22 أو 25 أو 27 G).

  1. استخدم هذا البروتوكول مع رؤوس الطباعة وطباعتها في درجة حرارة الغرفة، حيث درجة حرارة الغرفة 20-25 درجة مئوية.
  2. تخزين خراطيش الحبر المواد الحيوية في 4 درجة مئوية للحفاظ على استقرار مركب هيدروجيل. قبل البدء في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، قم بإزالة خرطوشة (3 مل) من الثلاجة والسماح لها بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. تركيب خرطوشة Bioink على الطابعة الحيوية INKREDIBLE + 3D
    1. قم بإزالة القبعات ذات النهاية الزرقاء من خرطوشة حبر المواد الحيوية سعة 3 مل (الشكل 5B(i))، وألصق فوهة طباعة بيولوجية مخروطية معقمة سعة 22 جم (زرقاء) إلى نهاية قفل luer لخرطوشة Bioink.
      ملاحظة: من الضروري لصق فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المطلوبة على خرطوشة bioink قبل تثبيت الخرطوشة وتنفيذ خطوات المعايرة اللاحقة ، حيث سيؤدي عدم القيام بذلك إلى معايرة غير سليمة لمحور z للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
    2. قم بتوصيل أنابيب إمداد ضغط الهواء ل printhead 1 (PH1، إلى اليسار) بالطرف المقابل للخرطوشة، وأدخل الخرطوشة مع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المرفقة في الفتحة الرأسية ل PH1 (الشكل 5A(ii)).
    3. مقعد ثابت خرطوشة في PH1 مع فوهة الطباعة الحيوية مخروطية تمتد تحت رأس الطباعة. شد المسمار على PH1 في اتجاه عقارب الساعة حتى إصبع ضيق لقفل خرطوشة Bioink في مكان. لاحظ أنه يمكن إجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد مع ترك PH2 فارغا.
  4. معايرة محاور x-y-z للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد
    1. الطاقة على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، وإطلاق برنامج الطباعة الحيوية على جهاز كمبيوتر متصل بالطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد عبر كابل USB 2.0.
    2. في البرنامج، انقر فوق الزر CONNECT لمزامنة البرنامج مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: تكون المزامنة ناجحة عند تشغيل وإيقاف تشغيل أضواء الصمام الثنائي الباعث للضوء فوق البنفسجي ذات رأس الطباعة، وتقوم مروحة فلتر HEPA بإيقاف تشغيلها ومرة أخرى. يجب مزامنة البرنامج مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد قبل توجيه محاور الطابعة الحيوية ومعايرة نقطة البداية ، كما هو موضح في الخطوات اللاحقة.
    3. لاحظ أربعة خيارات في قائمة التحكم الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد: (1) إعداد BIOPRINT، (2) BIOPRINT، (3) قائمة المرافق، و (4) شاشة الحالة. حدد الخيار تحضير BIOPRINT ، ثم مرر لأسفل إلى وحدد خيار HOME AXES .
      ملاحظة: ثم سيقوم الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد بتحريك تجميع رأس الطباعة للخلف واليسار لمعايرة المحاور ص و س، على التوالي. بعد ذلك، مع توقف رؤوس الطباعة مؤقتا في أقصى الموضع الأيسر، ستقوم الطابعة الحيوية برفع الطباعة حتى يقوم مفتاح معايرة المحور z (الموجود على المطبوعة) بالاتصال بموهية الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة على رأس الطباعة 1
    4. بعد المعايرة الناجحة لمحاور x-y-z ، لاحظ الخفض الطفيف للطباعة ونقل رؤوس الطباعة إلى أعلى النقطة الوسطى للطباعة (الشكل 5A(i)).
  5. معايرة نقطة البداية للطباعة الحيوية للطباعة الحيوية في 24 لوحة بئر
    1. إزالة لوحة ثقافة 24 بئر معقمة من غلافها البلاستيكي المختوم ، ووضع علامة على نقطة في النقطة المركزية من D1 جيدا على الجانب السفلي من لوحة مع علامة دائمة. قم بإزالة غطاء اللوحة، وضع لوحة الثقافة ذات ال 24 بئرا على المطبوعة مع D1 جيدا الموجود في الزاوية اليسرى الأمامية من المطبوعة.
    2. في قائمة التحكم الرئيسية، حدد UTILITIES MENU ثم حدد MOVE AXIS. حرك رؤوس الطباعة بزيادات 1 مم على طول المحورين x و y حتى تكون فوهة الطباعة الحيوية المخروطية ل PH1 فوق النقطة التي تم وضع علامة عليها تحت D1 جيدا. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية فوق النقطة عن طريق تحريك رؤوس الطباعة بزيادات 0.1 مم.
    3. سجل x-و-y-إحداثيات فوهة الطباعة الحيوية المخروطية عندما مباشرة فوق مركز D1 جيدا، كما هو مبين على شاشة لوحة التحكم للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: في حالة الطابعة الحيوية INKREDIBLE + 3D المستخدمة هنا، تكون إحداثيات x و y كما يلي: x : -46.5 و y : -27.5. هذه الإحداثيات بمثابة نقطة انطلاق في مركز D1 جيدا للطباعة الحيوية في لوحة من 24 بئرا.
    4. بعد ذلك، ارفع الطباعة بزيادات 1 مم حتى يلمس الجزء السفلي من البئر D1 فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة في رأس الطباعة 1 تقريبا. ضبط حركة الطباعة بزيادات 0.1 مم إذا لزم الأمر (الشكل 5A(ii)). ثم، من قائمة الأدوات المساعدة، حدد الخيار معايرة Z-AXIS ، وحدد وأكد خيار "معايرة STORE Z ".
    5. العودة إلى القائمة الرئيسية، وحدد الخيار تحضير BIOPRINT . مرر لأسفل إلى وحدد خيار CALIBRATE Z .
      ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الآن خفض printbed عند تنفيذ معايرة المحور z بنجاح (الشكل 5A(iii)).
  6. تحديث ملف G-code ذو 24 لوحة بشكل جيد مع إحداثيات نقطة البداية الصحيحة
    1. افتح ملف التعليمات البرمجية الهندسية للوحات 24 جيدا (G-code) في برنامج الطابعة الحيوية (الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: هذا الملف G-code 24-well يشفر طباعة 2-طبقة 5 × 5 × 1 مم بنيات مستقيمية في كل بئر (الشكل 5C(i)(iii)). يمكن استخدام ملفات G-code المتوفرة مع أي برنامج طباعة حيوية ثلاثي الأبعاد.
    2. لاحظ أن سطر 1 من ملف G-code يقرأ G0 X-50.0 Y-33.5 ; مركز موقف D1 جيدا. تحديث إحداثيات س ص على الخط 1 مع القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.5.3، أي، يجب الآن قراءة السطر 1 G0 X-46.5 Y-27.5 ; مركز موقف D1 جيدا. حفظ الملف تحت اسم جديد.
      ملاحظة: يعمل هذا الإجراء على معايرة ملف G-code بحيث تبدأ الطباعة في وسط بئر D1 استنادا إلى إحداثيات x,y للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المحددة المستخدمة. يمكن استخدام هذا النهج لمعايرة ملف G-code ذو 24 بئرا للطباعة باستخدام أي طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد. ولأغراض هذه الدراسة، لم يطبع سوى النصف الأيسر من اللوحة ذات ال 24 بئرا، أي الآبار A1-3 وB1-3 وC1-3 وD1-3. كما يتم توفير ملف G-code منفصل يقوم بترميز طباعة بنية مستقيمية من طبقتين 5 × 5 × 1 مم في شبكة 3 × 4 (ملف إضافي 2، الشكل 5C(ii)).
  7. تعديل ضغط البثق ل Printhead 1 (PH1)
    1. تأكد من أن المضخة الهوائية متصلة بإحكام بمنفذ كمية الهواء الخلفي للطباعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد، ثم قم بتشغيل المضخة الهوائية.
    2. اسحب مقبض التحكم الأمامي الموجود على الجانب الأيمن من الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: يقوم مقبض التحكم الأمامي بضبط الضغط للحصول على PH1، بينما يضبط مقبض التحكم الخلفي الضغط ل PH2.
    3. مراقبة مقاييس الضغط الرقمي لPH1 و PH2 تقع على الجزء الأمامي من الطابعة الحيوية كل قراءة ما يقرب من 0 كيلو باسكال. تدوير مقبض التحكم الأمامي ببطء باتجاه عقارب الساعة حتى يصل الضغط المشار إليه على المقياس الأيسر ل PH1 إلى 12 كيلو باسكال (الشكل 5A(iii)).
    4. ضع ورق نسيج مطوي أو قطعة من فيلم الختم المقاوم للماء تحت فوهة الطباعة للخرطوشة المثبتة، مع الحرص على عدم لمس فوهة الطباعة.
    5. من قائمة التحكم الرئيسية في الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد إعداد BIOPRINT.
    6. انتقل إلى وحدد تشغيل PH1. لاحظ أن الحبر الحيوي يبدأ في البثق من فوهة الطباعة. إذا لزم الأمر، قم بزيادة ضغط البثق عن طريق تدوير مقبض التحكم في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم قذف حبر المادة الحيوية في خيوط مستمرة، وتسجيل إعداد الضغط الجديد. العمل بسرعة لتجنب إهدار الحبر المواد الحيوية.
    7. حدد إيقاف تشغيل PH1 لإيقاف قذف حبر المادة الحيوية، وإزالة ورق الأنسجة أو الفيلم الذي يحتوي على حبر المواد الحيوية مقذوف من المطبوعة، وإغلاق باب الطابعة الحيوية.
      ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد سيتم تشغيل العرض ضغط الهواء إلى PH1 أثناء الطباعة كما هو تعليمات من قبل ملف G-code تلقائيا.
  8. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للركائز الهيدروجيل المستقيمة في شكل لوحة من 24 بئرا
    1. من قائمة التحكم الرئيسية على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد UTILITIES MENU. انتقل إلى وحدد تعطيل SD PRINT، والتي سوف تسمح لبرنامج الطباعة الحيوية لنقل ملفات G-رمز إلى الطابعة الحيوية 3D للطباعة.
    2. انقر على زر LOAD في برنامج الطباعة الحيوية، وحدد ملف G-code المحدث ذو 24 بئرا المحفوظ في الخطوة 4.6.2.
    3. في لوحة التحكم اليمنى في البرنامج، حدد علامة التبويب معاينة الطباعة ، وانقر على زر PRINT لبدء الطباعة الحيوية في D1 جيدا.
      ملاحظة: إذا كان استخدام 3 × 4 شبكة جيدا لوحة G-رمز الملف، سوف تنتهي الطباعة الحيوية في A3 جيدا من لوحة 24-جيدا (الشكل 5C(ii)، D)، بدلا من A6 جيدا إذا تمت طباعة لوحة كاملة 24 جيدا.
    4. عند الانتهاء من الطباعة الحيوية للبنى المستقيمة ، قم بتغطية اللوحة ذات ال 24 بئرا بغطاءها ونقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
    5. تزج كل بناء مستقيم في قطرتين من المعقمة 50 mM CaCl2 الحل (الشكل 5B(ii))، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا يخدم إلى ربط متقاطعة صوتيا سلاسل البوليمر alginate مع الأيونات Ca2 + والسماح للبناءات المستقيم للحفاظ على سلامتها الهيكلية.
    6. يستنشق بعناية حل CaCl2 من كل بناء، وشطف مرة واحدة في 1 مل من 1x PBS (الرقم الحموضة 7.4) لإزالة CaCl2 الزائدة (الشكل 5D).
    7. لمنع الجفاف من يبني الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا، والحفاظ على 3D يبني المستقيم المطبوع بيولوجيا في برنامج تلفزيوني 1x الطازجة حتى BMMCs على استعداد لتكون البذور على البنى (الشكل 5D).

5. حضانة BMMCs على سقالات مستقيمة مطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد واختبار قابلية البقاء

  1. حضانة BMMCs على سقالات هيدروجيل مستقيمة مطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد
    1. البذور aliquots من BMMCs على السقالات المستقيمة المطبوعة بيولوجيا 3D في ثلاثية المدد لمدة أربع فترات مختلفة، على سبيل المثال، 6 و 18 و 24 و 48 ساعة، بحيث تنتهي جميع العلاجات في وقت واحد. استخدم BMMCs المصنفة في آبار فارغة في ثلاثية المدد مثل عناصر التحكم غير المعالجة.
    2. نقل BMMCs aseptically من قارورة الثقافة T175 سم2 إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل، بيليه BMMCs في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. Resuspend بيليه في 50 مل من المتوسطة RPMI كاملة جديدة تحتوي على 20 نانوغرام / مل من IL-3، وحساب كثافة الخلايا الحية عن طريق عد aliquot من BMMCs تريبان الأزرق الملطخة باستخدام مقياس الهماسية.
    4. بناء على كثافة الخلية المحسوبة في الخطوة 5.1.3، قم بإعداد 6 مل من تعليق BMMC بكثافة نهائية تبلغ 1 × 106 خلايا/مل.
    5. لإعداد الحضانة 48 ساعة، يستنشق برنامج تلفزيوني من الآبار A1-3 التي تحتوي على سقالات هيدروجيل المستقيم المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد، وماصة 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في كل بئر. أيضا، ماصة 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في الآبار A4-6 دون يبني مطبوعة بيولوجيا لتكون بمثابة السيطرة غير المعالجة. احتضان الآبار المتبقية التي تحتوي على سقالات مطبوعة بيولوجيا (B1-3، C1-3، D1-3) في RPMI دون إضافات لمنع الجفاف حتى يتم الوصول إلى الوقت المناسب للبذر مع BMMC لمدة العلاج 24 و 18 و 6 ساعة. ملء الآبار دون سقالات مطبوعة بيولوجيا (B4-6، C4-6، D4-6) مع 1 مل من برنامج تلفزيوني حتى يتم التوصل إلى الوقت المناسب للبذر مع BMMCs ل24، 18، و 6 ساعة نقاط الوقت.
    6. احتضان لوحة 24 بئرا في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 الرطوبة.
    7. لإعداد الحضانة 24 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار B1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    8. لإعداد الحضانة 18 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار C1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    9. لإعداد الحضانة 6 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار D1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلية / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    10. لإنهاء الحضانة، والاستغناء عن عينات من كل بئر من لوحة 24 جيدا ل(1) PI تلطيخ وتحليل حسب قياس التدفق الخلوي، (2) XTT فحص صلاحية الخلية، و (3) LDH الافراج عن المقايسة. لذلك، تأكد من أن لوحة مستديرة القاع 96-جيدا والأنابيب الدقيقة اللازمة 1.5 مل وصفت قبل وقت كاف من نقطة النهاية للحضانة.
  2. أخذ عينات الخلايا لإجراء الفحص الأيضي XTT
    1. إعادة إنفاق بدقة BMMCs في وسط الثقافة داخل كل بئر، مع الحرص على عدم الإضرار وتفتيت السقالات هيدروجيل 3D المطبوعة بيولوجيا.
    2. نقل 40 ميكرولتر من تعليق BMMC متجانسة من كل بئر إلى أنابيب ميكروفوج 1.5 مل معقمة تحتوي على 760 ميكرولتر من المتوسط RPMI كاملة جديدة (الحجم النهائي = 800 ميكرولتر)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
    3. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق BMMC المخفف في ثلاثية إلى لوحة microtiter مسطحة القاع 96 جيدا التي هي مناسبة لتسجيل قياسات امتصاص (انظر جدول المواد) على مطياف لوحة صغيرة.
    4. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من XTT حل العمل لكل بئر تحتوي على تعليق الخلية BMMC باستخدام micropipette متعدد القنوات.
      ملاحظة: إعداد حل العمل XTT عن طريق خلط 5 مل من كاشف XTT مع 100 ميكرولتر من كاشف اقتران الإلكترون. إذابة هذه المكونات من -20 درجة مئوية في حمام مائي 37 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام.
    5. احتضان لوحة 96 بئرا في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 مرطب لمدة 24 ساعة.
    6. في نهاية الحضانة، قم بإزالة لوحة 96 بئرا من الحاضنة واتركها تبرد لدرجة حرارة الغرفة. قيم امتصاص قياسية على مطياف ميكروبليت عند 450 نانومتر مع طرح الخلفية عند 650 نانومتر.
  3. أخذ عينات فائقة لاستات ديهيدروجيناز (LDH) المقايسة
    1. نقل تعليق BMMC المتبقية (960 ميكرولتر) من كل بئر من لوحة 24 جيدا إلى أنابيب ميكروفوج، والكريه الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. Pipette ثلاثة 100 μL aliquots من ثقافة الخلية supernatant من كل أنبوب microfuge في لوحة 96 microtiter جيدا شقة القاع. تجاهل بقايا النافورات من كل أنبوب ميكروفوج، والاحتفاظ بكريات BMMC لمزيد من التلطيخ مع PI في الأقسام 5.4.1-5.4.8.
    3. ماصة 50 ميكرولتر من حل العمل LDH في كل 100 ميكرولتر aliquot من supernatant.
      ملاحظة: الرجوع إلى الملف التكميلي 3 لإعداد الكواشف LDH المقايسة.
    4. حضانة لمدة 1 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    5. ماصة 50 ميكرولتر من 1 M حمض الخليك إلى كل بئر لوقف رد الفعل.
    6. قيم امتصاص قياسية على مطياف لوحة صغيرة عند 490 نانومتر مع طرح الخلفية عند 680 نانومتر.
  4. تحليل التدفق الخلوي لقابلية بقاء BMMC عن طريق استبعاد يوديد البروبيديوم (PI)
    1. Resuspend الكريات BMMC في تدفق غسل العازلة (PBS [درجة الحموضة 7.4] التي تحتوي على 0.5٪ ث / v BSA)، والكريه الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. كرر خطوة الغسيل مع تدفق غسل العازلة مرة أخرى.
    3. Resuspend كل بيليه BMMC في 400 ميكرولتر من تدفق غسل العازلة.
      ملاحظة: سيكون هناك 24 عينة BMMC أعيد إنفاقها في المجموع: 12 عينة BMMC المحتضنة على ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا (4 نقاط زمنية في ثلاثية) و 12 عينة BMMC المحتضنة في الآبار دون البنى المطبوعة بيولوجيا (4 نقاط زمنية في ثلاث نسخ).
    4. في لوحة microtiter مستديرة القاع 96 جيدا، ماصة 20 ميكرولتر من تدفق غسل العازلة في الآبار A1-12 و B1-12. في نفس لوحة microtiter، ماصة 20 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI 10x (100 ميكروغرام / مل PI في تدفق غسل العازلة) في الآبار C1-12 و D1-12.
    5. توزيع 180 ميكرولتر من العينات 12 BMMC المحتضنة على ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا في الآبار A1-12 (عينة واحدة لكل بئر). توزيع 180 ميكرولتر من العينات 12 BMMC المحتضنة دون ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا في الآبار B1-12 (عينة واحدة لكل بئر). استخدم عينات BMMC التي تم توزيعها في الآبار A1-12 و B1-12 كعناصر تحكم غير ملطخة لكل حالة علاج (24 تحكما في المجموع).
    6. توزيع 180 ميكرولتر من العينات ال 12 التي تم احتضانها على بنى مطبوعة بيولوجيا في الآبار C1-12 (عينة واحدة لكل بئر). توزيع 180 ميكرولتر من العينات ال 12 التي تم احتضانها من قبل BMMC دون إجراء عمليات بناء مطبوعة بيولوجيا في الآبار D1-12 (عينة واحدة لكل بئر).
      ملاحظة: سوف تلطخ عينات BMMC في الآبار C1-12 و D1-12 بتركيز PI فعال نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل (24 عينة ملطخة في المجموع).
    7. احتضان لوحة إما لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية أو 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    8. في نهاية فترة الحضانة، قم بتحليل العينات مباشرة من لوحة الميكروتيتر على مقياس تدفق الخلايا كما هو موضح سابقا تحت القسم 3.1.

النتائج

واحدة من أهم خصائص الحبر المواد الحيوية الناجحة أو ركيزة الثقافة هو أن من التوافق البيولوجي. في المقام الأول ، يجب ألا تؤدي الركيزة إلى الموت الخلوي. هناك العديد من الأساليب القائمة على الميكروتيتر وتدفق قياس الخلايا لتحديد مدى صلاحية الخلية ونخر; ومع ذلك، هذه الطرق غير قابلة لتحليل الخلا...

Discussion

يتطلب تصنيع الأنسجة المحاكاة الحيوية ثلاثية الأبعاد الدمج الناجح للدينك الحيوي ، الذي يحاكي مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مع المكون الخلوي (المكونات) لإنشاء تناظرات فسيولوجية في الأنسجة الحية . وهذا يتطلب استخدام الخلايا الأولية، وليس الخلايا المتحولة، عند تصنيع الأنسجة المحاكاة ا...

Disclosures

وقد دعم هذا العمل المجلس الوطني للبحوث في كندا وألبرتا للابتكار.

Acknowledgements

نشكر ألبرتا الابتكار لتوفير CNC وكين هاريس وجاي يونغ تشو لمشورتهم التقنية عند إعداد مصفوفة CNC / agarose / D - mannitol. نشكر أيضا بن هوفمان وهيذر وينشيل ونيكول ديامانتييدات على نصائحهم التقنية ودعمهم بإعداد ومعايرة الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A
Acetic Acid (glacial)Sigma AldrichAX0074-6
Agarose (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-MercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)BD309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 inBD305111
BioLite 24 Well MultidishThermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Well MultidishThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 cm2 Flask VentedThermo Fisher Scientific130-191
Biosafety Cabinet Class IIMicrozone Corp., CanadaBK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
C
C57BL/6 miceThe Jackson Laboratory000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)CELLINK LLCIK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mLCELLINK LLCCL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip CapsCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare for PCCELLINK LLCVersion 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTERCELLINK LLCS-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22GCELLINK LLCNZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25GCELLINK LLCNZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27GCELLINK LLCNZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)Sigma Aldrich11465015001
Centrifuge (Benchtop)Eppendorf5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS MicroplateSigma AldrichCLS3370
CO2 IncubatorBinder GmbH, Germany9040-0113
CytoFLEX Flow CytometerBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivatedThermo Fisher Scientific12484028
FlowJo SoftwareBecton Dickinson & Co. USAVersion 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)VWR15170-208
HEPES Sodium SaltFisher ScientificBP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
Lithium L-lactateSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)Sigma AldrichM8640
Microtubes (1.7 mL clear)AxygenMCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)Thermo Fisher Scientific566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12-4031-82
Recombinant Murine IL-3PeproTech, Inc. 213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)GE HealthcareSH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)Fisher ScientificNC9913213
Sodium Azide, 500 gFisher ScientificBP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)Thermo Fisher Scientific11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)Sigma Aldrich252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)Sigma Aldrich93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)Thermo Fisher ScientificVLBL00D0

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved