Fabrication d’une encre de biomatériau d’agarose incorporée de nanocellulose cristalline pour la culture de mastocytes dérivés de la moelle osseuse

Résumé

Ce protocole met en évidence une méthode permettant d’évaluer rapidement la biocompatibilité d’une encre de biomatériau hydrogel composite de nanocellulose cristalline (CNC) / agarose avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris en termes de viabilité cellulaire et d’expression phénotypique des récepteurs de surface cellulaire, Kit (CD117) et récepteur IgE à haute affinité (FcεRI).

Résumé

La bioimpression tridimensionnelle (3D) utilise des composites à base d’hydrogel (ou encres de biomatériaux) qui sont déposés dans un motif, formant un substrat sur lequel les cellules sont déposées. Étant donné que de nombreuses encres de biomatériaux peuvent être potentiellement cytotoxiques pour les cellules primaires, il est nécessaire de déterminer la biocompatibilité de ces composites d’hydrogel avant leur utilisation dans des processus coûteux d’ingénierie tissulaire 3D. Certaines méthodes de culture 3D, y compris la bio-impression, exigent que les cellules soient intégrées dans une matrice 3D, ce qui rend difficile l’extraction et l’analyse des cellules pour détecter les changements dans la viabilité et l’expression des biomarqueurs sans provoquer de dommages mécaniques. Ce protocole décrit comme preuve de concept, une méthode pour évaluer la biocompatibilité d’un composite d’agarose incorporé dans la nanocellulose cristalline (CNC), fabriqué dans un système de culture à 24 puits, avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris (BMMC) à l’aide de tests cytométriques en flux pour la viabilité cellulaire et l’expression de biomarqueurs.

Après 18 h d’exposition à la matrice CNC/agarose/D-mannitol, la viabilité du BMMC n’a pas été modifiée par la perméabilité à l’iodure de propidium (PI). Cependant, les BMMC cultivés sur le substrat CNC/agarose/D-mannitol semblaient augmenter légèrement leur expression du récepteur IgE à haute affinité (FcεRI) et du récepteur du facteur des cellules souches (Kit; CD117), bien que cela ne semble pas dépendre de la quantité de CNC dans le composite bioencre. La viabilité des BMMC a également été évaluée à la suite d’une exposition prolongée à des échafaudages d’hydrogel fabriqués à partir d’une encre de biomatériau commercial composée de nanocellulose fibrillaire (FNC) et d’alginate de sodium à l’aide d’une bioimprimante d’extrusion 3D. Sur une période de 6 à 48 h, les substrats FNC/alginate n’ont pas nui à la viabilité des BMMC telle que déterminée par cytométrie en flux et essais de microtitre (XTT et lactate déshydrogénase). Ce protocole décrit une méthode efficace pour filtrer rapidement la compatibilité biochimique des encres de biomatériaux candidats pour leur utilité en tant qu’échafaudages 3D pour l’ensemencement post-impression avec des mastocytes.

Introduction

L’intérêt récent pour les systèmes de culture 3D et la bio-impression 3D a attiré l’attention sur les hydrogels et les composites d’hydrogel. Ces composites servent de biomimétiques visqueux mais poreux et peuvent être composés jusqu’à 99% d’eau en poids, ce qui est comparable aux tissus biologiques1,2,3. Ces caractéristiques des composites d’hydrogel permettent ainsi la croissance des cellules sans affecter leur viabilité et leur fonction. L’un de ces composites est la nanocellulose cristalline (CNC), qui a été utilisée comme matériau de renforcement dans les composites d’hydrogel, les échafaudages cellulaires dans le développement d’implants de biomatériaux et dans la culture cellulaire in vitro bidimensionnelle (2D) et ^3D4,5. Pour la plupart, les matrices composées de CNC ne sont pas ouvertement cytotoxiques pour les cellules épithéliales cornéennes ^humaines6, les cellules épithéliales ^{intestinales7}, les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse ^humaine8 ou les cellules de type ^neurone9. Cependant, l’activité métabolique et la prolifération des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine diminuent en corrélation avec l’augmentation de la viscosité des composites de nanocellulose à base de bois, ce qui suggère que la composition de la matrice doit être soigneusement testée pour ses effets délétères sur les fonctions ^cellulaires8.

De même, la CNC peut induire des réponses inflammatoires dans les macrophages lors de l’internalisation, ce qui pourrait avoir de graves conséquences dans les systèmes de culture de cellules immunitaires ^3D10,11. En fait, il y a très peu de données disponibles sur la façon dont la CNC peut influencer d’autres réponses des cellules immunitaires, en particulier les réponses inflammatoires allergiques qui sont initiées par les mastocytes. Les mastocytes sont des leucocytes granulés qui expriment le récepteur IgE à haute affinité, FceRI, responsable de l’activation des réponses inflammatoires aux allergènes. Leur prolifération et leur différenciation dépendent du facteur de cellules souches (SCF), qui lie le récepteur de la tyrosine, Kit. Les mastocytes sont dérivés de cellules progénitrices de la moelle osseuse qui pénètrent dans la circulation et migrent ensuite périphériquement pour se disperser de manière omniprésente dans tous les tissus ^humains12. Comme les mastocytes fonctionnent dans un environnement tissulaire 3D, ils sont un candidat idéal pour les cellules immunitaires pour étudier les processus immunologiques dans des modèles tissulaires 3D in vitro. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun modèle de tissu 3D in vitro viable contenant des mastocytes.

En raison de la nature très sensible des mastocytes et de leur propension à provoquer des réponses pro-inflammatoires aux stimuli externes, un examen attentif des constituants de la matrice 3D et de la méthode de bio-impression pour introduire des mastocytes dans l’échafaudage 3D est nécessaire, comme nous l’avons vu plus loin. Les constructions tissulaires peuvent être biofabriquées à partir de deux grandes catégories de biomatériaux, à savoir les bioencres et les encres de biomatériaux. La distinction réside dans le fait que les bioencres sont des composites d’hydrogel chargés de cellules, tandis que les encres de biomatériaux sont des composites d’hydrogel dépourvus de cellules, tels que définis par Groll et ^al.13,14. Par conséquent, les constructions 3D imprimées avec des bioencres contiennent des cellules pré-intégrées dans la matrice d’hydrogel, tandis que les constructions 3D imprimées avec des encres de biomatériaux doivent être ensemencées avec des cellules après l’impression. La biofabrication d’échafaudages de culture à partir d’encres bioencreuses / biomatériaux à base d’hydrogel est le plus souvent effectuée à l’aide de bioimprimantes 3D d’extrusion, qui extrudent l’encre bioencre / biomatériau à travers une buse à micro-échelle sous pression via un piston à entraînement pneumatique ou ^mécanique14. Les bioimprimantes par extrusion fabriquent des échafaudages 3D en déposant la bioencre dans des motifs de coupe transversale 2D qui sont empilés séquentiellement les uns sur les autres dans une approche « ascendante ».

Pour être compatible avec la bioimpression par extrusion, l’encre bioencre/biomatériau à base d’hydrogel doit posséder des propriétés thixotropes (amincissement par cisaillement), par lesquelles les polymères hydrogel constitutifs de l’encre bioencre/biomatériau s’écoulent comme un fluide à travers une buse à microcanaux lorsqu’ils sont soumis à une contrainte de cisaillement, mais reviennent à un état visqueux semblable à celui d’un gel lors de l’élimination de la contrainte de ^{cisaillement15} . En raison de leur teneur élevée en eau, les polymères des encres bioencres/biomatériaux à base d’hydrogel doivent être réticulés, physiquement ou covalentement, pour maintenir l’architecture et l’intégrité structurelle de la structure bioimprimée en 3D. Dans le cas des bioencres chargées de cellules, les cellules sont directement soumises à des contraintes chimiques pendant le processus de réticulation. Le processus d’extrusion des cellules encapsulées dans la matrice d’hydrogel bioencre soumet également les cellules à un stress de cisaillement, ce qui peut entraîner une viabilité réduite et / ou la mort cellulaire. Une fois que le modèle tissulaire 3D a été bioimprimé, il est difficile de faire la distinction entre les niveaux de cytotoxicité provoqués par la matrice d’hydrogel elle-même et les processus d’extrusion et de réticulation, respectivement. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des échafaudages 3D où les cellules sont pré-intégrées dans la matrice d’hydrogel, ce qui rend difficile l’élimination des cellules pour des analyses ultérieures, ce qui serait préjudiciable à la viabilité des mastocytes.

Une approche plus douce pour générer des constructions tissulaires 3D contenant des mastocytes consiste à ensemencer les cellules dans des échafaudages 3D d’encre de biomatériau poreux pré-imprimés à partir d’une suspension de culture cellulaire, ce qui tire parti de la capacité innée des mastocytes à migrer de la circulation vers les tissus périphériques. Les avantages de cette approche d’ensemencement cellulaire sont doubles: (i) les mastocytes ne sont pas soumis au cisaillement et aux contraintes chimiques des processus d’extrusion et de réticulation, respectivement, et (ii) les cellules peuvent être facilement retirées de l’échafaudage 3D après exposition par lavage doux pour analyse sans nuire à leur viabilité. L’avantage supplémentaire de l’ensemencement et de l’analyse de la viabilité cellulaire des mastocytes sur des échafaudages d’hydrogel poreux bioimprimés en 3D par opposition aux disques d’hydrogel 2D est que les échafaudages d’hydrogel bioimprimés en 3D récapitulent les caractéristiques topographiques micro-échelles des tissus in vivo , qui ne sont pas présents dans les disques d’hydrogel planaires 2D en vrac. Cette approche est une approche appropriée, rapide et rentable pour déterminer les effets cytotoxiques potentiellement catastrophiques des matrices d’hydrogel de bioencre candidates sur les mastocytes, ainsi que sur d’autres cellules immunologiques, avant d’investir dans des expériences coûteuses d’ingénierie tissulaire 3D.

Protocole

NOTE: Ce protocole est composé de cinq sections: (1) isolement de la moelle osseuse de souris et différenciation des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris (BMMC), (2) fabrication de substrats d’hydrogel CNC / agarose / D-mannitol dans un système à 24 puits et culture de BMMC sur les substrats, (3) élimination des BMMC des substrats d’hydrogel CNC / agarose / D-mannitol et analyse de la viabilité et de l’expression des biomarqueurs à l’aide de la cytométrie en flux, (4) Bioimpression 3D d’échafaudages d’hydrogel à partir d’une encre de biomatériau composite de nanocellulose fibrillaire (FNC)/alginate de sodium disponible dans le commerce, et (5) culture de BMMC sur des échafaudages d’hydrogel FNC/alginate de sodium et analyse de la viabilité à l’aide de tests de cytométrie en flux, de XTT et de microtitrage de lactate déshydrogénase (LDH).

1. Génération de la culture BMMC

NOTE: Les souris ont été euthanasiées par asphyxie au _CO2 après anesthésie à l’isoflurane. Le tibia et le fémur ont été isolés et la moelle osseuse entière a été prélevée. Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices et aux politiques du Conseil canadien sur les soins aux animaux avec l’approbation du Comité des soins et de l’utilisation des animaux en sciences de la santé de l’Université de l’Alberta.

1. Préparer le milieu de culture RPMI-1640 complet en ajoutant les suppléments énumérés dans le tableau 1 aux concentrations finales indiquées. Ajuster le pH du milieu à 7,4-7,6 à l’aide de NaOH, filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre à usage unique (taille des pores de 0,2 μm) et conserver à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à 2 mois.
2. Obtenir des fémurs de souris conformément aux protocoles et procédures du comité de soins aux animaux de l’Université locale.
   REMARQUE: Dans cette étude, les fémurs ont été isolés à partir de souris C57BL / 6, mais toute souche peut être utilisée si elle est pertinente pour l’étude.
3. À l’aide de ciseaux, retirez la peau et les muscles de l’articulation de la hanche, puis tirez doucement le fémur en le tordant légèrement hors de l’alvéole de la hanche (Figure 1). Veillez à ne pas casser la tête fémorale. Coupez le tibia du fémur au niveau de la fabella médiale à l’aide de ciseaux. Retirez la patte en coupant juste au-dessus du calcanéum et jetez-la.
4. À l’aide d’un scalpel, enlevez la peau et le cartilage des morceaux du fémur et du tibia. À l’aide de ciseaux, faites une coupe nette à chaque extrémité du fémur et du tibia, exposant la moelle osseuse rouge à l’intérieur. Si nécessaire, retirez le péroné à ce stade, mais notez qu’il peut aider à la manipulation du tibia pendant le rinçage de la moelle osseuse.
5. Préparer une aiguille de 26 G avec une seringue luer-lock de 5 mL et remplir avec environ 5 mL de milieu complet préparé comme décrit ci-dessus.
   REMARQUE: À ce stade, un RPMI incomplet sans les additifs peut également être utilisé pour économiser sur les réactifs.
6. En tenant le fémur ou le tibia avec une pince, insérez l’aiguille dans une extrémité de l’os et appuyez doucement sur la seringue. Tenez l’os au-dessus d’un tube conique stérile de 50 mL et injectez doucement environ 5 mL de milieu dans l’os, en appliquant une certaine pression. Observez des morceaux de moelle osseuse tomber à l’autre extrémité de l’os sous forme de minces rubans rouges et dans le tube conique.
7. Faites tourner les aspirations et remettez en suspension dans un milieu complet, ou transférez-les directement dans une fiole de culture tissulaire stérile T175 ^cm2 contenant 50 mL de milieu RPMI-1640 complet. Maintenir les aspirations dans un milieu RPMI-1640 complet avec 30 ng/mL d’interleukine recombinante (IL)-3 de souris.
8. Après 1 jour, observez les cultures au microscope optique. La culture sera composée d’une population hétérogène de cellules de formes et de tailles variées et de morceaux de moelle osseuse encore plus gros. Nourrissez les cultures cellulaires en ajoutant 15 mL de milieu frais tous les 3 à 5 jours en utilisant le milieu RPMI-1640 complet décrit ci-dessus, et assurez-vous que la densité cellulaire ne dépasse jamais 1 × ¹⁰⁶ cellules/mL. Une fois par semaine, filer les cellules à 200 × g pendant 5 min à température ambiante, remettre en suspension dans un milieu RPMI-1640 frais complet et diviser 1:4 en 50 mL de milieu dans des flacons frais de T175.
9. Après 4 semaines, déterminer la pureté cellulaire en mesurant l’expression superficielle des récepteurs CD117 (Kit) et FceRI par cytométrie en flux comme décrit ci-dessous (rubrique 3.2).
   REMARQUE: Après 4 semaines, 99% des cellules devraient être doublement positives pour CD117 (Kit) et FcεRI.
10. À partir de 4 semaines, maintenez les BMMC avec 20 ng/mL d’IL-3 en milieu RPMI-1640 complet. À environ 6 semaines, les cellules cesseront de se diviser et n’auront plus besoin d’être divisées. Nourrissez les cultures tous les 3 à 5 jours, abattez les cellules par centrifugation une fois par semaine et remettez-les en suspension dans un milieu RPMI-1640 frais complet.

2. Fabrication des substrats d’hydrogel CNC/agarose/D-mannitol et culture BMMC

1. Dans une bouteille en verre, ajouter 0,2 g de poudre d’agarose à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (2 % p/v) jusqu’à un volume final de 10 mL, et faire bouillir pendant 1 min à 100 °C pour dissoudre.
2. Dissoudre 2,5 g de poudre CNC dans du PBS jusqu’à un volume final de 10 mL pour préparer un mélange à 25 % p/v.
3. Dissoudre 2 g de poudre CNC dans du PBS jusqu’à un volume final de 10 mL pour préparer un mélange à 20 % p/v, et diluer en série le mélange à 20 % p/v pour préparer des mélanges CNC à 10, 5 et 2 % p/v.
4. Chauffer les mélanges CNC à 25, 20, 10, 5 et 2 % p/v à 37 °C pendant 10 min (Figure 2A).
5. Ajouter 0,46 g de D-mannitol à la solution d’agarose chaude (4,6 % p/v) et dissoudre.
6. Mélanger les mélanges CNC-PBS préchauffés à 25, 20, 10, 5 et 2 % p/v avec la solution chaude d’agarose/D-mannitol dans des tubes coniques séparés à un rapport de 1:1 pour obtenir des concentrations finales de CNC de 12,5, 10, 5, 2,5 et 1 % p/v dans les mélanges d’hydrogel.
7. En travaillant rapidement, ajouter 500 μL/puits des solutions ci-dessus préparées à l’étape 2.6 en quadruplicate à une plaque de culture de 24 puits, et laisser reposer pendant 30 min à température ambiante pour faciliter la polymérisation (Figure 2B).
8. Superposez soigneusement 1000 μL de la suspension BMMC à une densité de 1,1 × ¹⁰⁶ cellules / mL sur les substrats d’hydrogel avec un micropipetteur, et évitez de toucher le gel avec l’extrémité de la pipette car cela endommagerait la surface du gel et générerait des particules.
9. Incuber les BMMC sur les substrats d’hydrogel dans un incubateur stérile (5% de _CO2, atmosphère humidifiée) à 37 °C pendant 18 h.

3. Analyses cytométriques en flux

1. Analyse cytométrique en flux de la viabilité du BMMC via l’exclusion PI
   1. Retirez soigneusement le milieu de culture contenant des BMMC du haut de la CNC/agarose/D-mannitol, en évitant le gel, et transférez les cellules dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
   2. Laver les BMMC deux fois avec du PBS (pH 7,4) contenant 0,5 % p/v d’albumine sérique bovine à 300 × g pendant 5 min à température ambiante, et remettre en suspension dans 180 μL de PBS-0,5 % p/v BSA jusqu’à une densité finale de 1,5 × ¹⁰⁶ cellules/mL. Transférez les cellules dans une plaque à fond rond de 96 puits.
      REMARQUE: Stériliser toutes les solutions PBS-0,5% w / v BSA deux fois à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm de la taille d’un pore et conserver à 4 ° C.
   3. Ajouter 20 μL de PBS-0,5 % p/v BSA, ou 10x PI (100 μg/mL) préparé dans du PBS-0,5 % p/v BSA, aux cellules jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL, et incuber pendant 1 h à 4 °C ou 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Acquérir des données de fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser à ions Argon (488-514 nm) et d’un filtre passe-bande pour permettre la détection de l’émission de fluorescence à 578 nm. Acquérir 20 000 événements par échantillon à un débit de 30 μL/min à température ambiante. Analysez les données comme décrit ci-dessous (sections 3.2.7-3.2.10).
2. Analyse cytométrique en flux des BMMC pour l’expression des récepteurs de surface Kit (CD117) et FcεRI
   1. Retirez soigneusement le milieu de culture contenant des BMMC du haut de la CNC/agarose/D-mannitol, en évitant le gel, et transférez les cellules dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
   2. Laver les BMMC deux fois avec du PBS-0,5 % BSA filtré à 300 × g pendant 5 min à température ambiante, et remettre en suspension dans 180 μL de PBS contenant 0,5 % p/v de BSA (1,5 × ¹⁰⁶ cellules/mL). Transférez les cellules remises en suspension dans une plaque à fond rond de 96 puits.
   3. Ajouter 20 μL de 10x solutions de travail d’anticorps aux cellules pour obtenir une concentration finale de 0,06 μg/mL de CD117 (c-Kit)-phycoérythrine (PE) et de 0,06 μg/mL de FcεRIα-allophycocyanine (APC), respectivement.
      REMARQUE: Les solutions de travail d’anticorps 10x doivent être préparées dans du PBS stérilisé par filtre à 0,5% p / v BSA.
   4. Ajouter 20 μL de 10x solutions de travail de contrôle d’isotype contenant soit des IgG2b κ de rat isotype control-PE ou du hamster arménien IgG isotype control-APC pour séparer les puits contenant des cellules qui n’ont pas été colorées avec l’un des conjugués anticorps-fluorophore à l’étape 3.2.3.
      REMARQUE: Les témoins d’isotype, le rat IgG2b κ isotype control-PE et le hamster arménien IgG isotype control-APC servent à contrôler la fixation non spécifique des anticorps au BMMC. Comme les BMMC n’expriment pas des niveaux élevés de FcR, il y a rarement une fluorescence de fond élevée détectée avec des anticorps de contrôle d’isotype. Préparez les solutions de travail de contrôle d’isotype 10x dans du PBS-0,5% stérilisé par filtre w / v BSA.
   5. Incuber la plaque à fond rond de 96 puits pendant 1 h à 4 °C dans l’obscurité.
   6. Lavez les cellules en ajoutant 200 μL de tampon PBS-0,5 % p/v BSA frais à chaque puits, et centrifugez à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Retirez soigneusement le surnageant sans toucher la pastille de cellule; laisser derrière lui un surnageant pour s’assurer que la pastille cellulaire reste intacte.
   7. Après le lavage, remettre les cellules en suspension dans 100 μL de 0,5 % p/v de BSA, 0,05 % p/v d’azoture de sodium dans du PBS (pH 7,4) qui a été filtré stérile deux fois avec un filtre à seringue de 0,2 μm de la taille d’un pore. Acquérir des données de fluorescence dans les canaux des détecteurs PE et APC à l’aide d’un cytomètre en flux, comme indiqué ci-dessus à l’étape 3.1.3.
   8. Analysez les données à l’aide d’un logiciel capable de visualiser et d’analyser des fichiers de données cytométriques en flux avec l’extension « .fcs ».
   9. Commencez l’analyse en traçant la dispersion vers l’avant (FSC) le long de l’axe des x et la dispersion latérale (SSC) le long de l’axe des y, et la porte pour la population cellulaire conservée avec une plage FSC de _log10 1,5-5,0 et une plage SSC de _log10 0,75-3,25 dans les cellules non traitées et non colorées comme le montre la figure 3A(i),(ii).
      REMARQUE: Cela permet de s’assurer que les débris cellulaires avec de faibles valeurs FSC et SSC sont éliminés de l’analyse. Les mastocytes sont normalement des cellules très granulaires (SSC élevée) et grandes (FSC élevé) par rapport à d’autres types de cellules immunologiques, telles que les monocytes et les lymphocytes.
   10. Ensuite, générez des diagrammes de points FSC vs SSC et des profils d’histogrammes d’échantillons non traités qui ont été colorés avec le colorant, les anticorps ou les témoins d’isotype, et obtenez l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) dans les canaux PE ou APC en fonction du spectre d’émission du conjugué anticorps-fluorophore spécifique ou du colorant utilisé. Appliquer le même ensemble de portes et de paramètres à tous les échantillons BMMC incubés avec différents substrats CNC / agarose / D-mannitol et colorés avec les témoins d’isotype, les anticorps ou le colorant correspondants; obtenir des IMF.
       REMARQUE : Essentiellement, les diagrammes à points FSC vs SSC des échantillons colorés non traités devraient être impossibles à distinguer des échantillons non traités/non colorés, obtenus à l’étape 3.2.9, afin de s’assurer que la procédure de coloration ne modifie pas la taille de la cellule (mesurée par FSC) ou la granularité (mesurée par SSC) (Figure 3A(i),(ii)).
   11. Calculer les IFM moyennes et l’erreur-type de moyenne (MEB) pour chaque échantillon à partir de 4 expériences indépendantes suivies de la génération de graphiques à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.
   12. Préparer des superpositions d’histogrammes dans le logiciel d’analyse de données cytométriques en flux (Figure 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Bioimpression de substrats d’hydrogel FNC/alginate de sodium

REMARQUE: La bioimprimante 3D utilisée dans cette étude est un système d’extrusion pneumatique équipé de deux têtes d’impression indépendantes à température contrôlée. L’encre de biomatériau utilisée pour la bioimpression 3D des échafaudages d’hydrogel est formulée en (a) nanocellulose fibrillaire hautement hydratée (FNC), qui est morphologiquement similaire au collagène, (b) alginate de sodium et (c) D-mannitol. Il est fourni sous forme de suspension d’hydrogel stérile dans des cartouches de 3 mL auxquelles peuvent être fixées des buses de bio-impression coniques stériles luer-lock (22, 25 ou 27 G).

1. Utilisez ce protocole avec les têtes d’impression et le lit d’impression à température ambiante, où la température ambiante est de 20-25 °C.
2. Conservez les cartouches d’encre biomatériau à 4 °C pour maintenir la stabilité du composite d’hydrogel. Avant de commencer la bioimpression 3D, retirez une cartouche (3 mL) du réfrigérateur et laissez-la s’équilibrer à la température ambiante.
3. Installation d’une cartouche Bioink sur la bioimprimante 3D INKREDIBLE+
   1. Retirez les embouts bleus de la cartouche d’encre de biomatériau de 3 mL (Figure 5B(i)) et fixez une buse de bioimpression conique stérile de 22 G (bleue) à l’extrémité luer-lock de la cartouche Bioink.
      REMARQUE: Il est essentiel d’apposer la buse de bio-impression conique souhaitée sur la cartouche bioink avant d’installer la cartouche et d’effectuer les étapes d’étalonnage suivantes, car ne pas le faire entraînera un étalonnage incorrect de l’axe Z de la bioimprimante 3D.
   2. Connectez le tube d’alimentation en pression d’air de la tête d’impression 1 (PH1, à gauche) à l’extrémité opposée de la cartouche et insérez la cartouche avec sa buse de bioimpression conique attachée dans la fente verticale de PH1 (Figure 5A(ii)).
   3. Placez fermement la cartouche dans PH1 avec la buse de bio-impression conique s’étendant sous la tête d’impression. Serrez la vis sur PH1 dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’elle soit serrée au doigt pour verrouiller la cartouche Bioink en place. Notez que la bioimpression 3D peut être réalisée avec PH2 laissé vide.
4. Étalonnage des axes x-y-z de la bioimprimante 3D
   1. Mettez sous tension la bioimprimante 3D et lancez le logiciel de la bioimprimante sur un PC connecté à la bioimprimante 3D via un câble USB 2.0.
   2. Dans le logiciel, cliquez sur le bouton CONNECT pour synchroniser le logiciel avec la bioimprimante 3D.
      REMARQUE: La synchronisation réussit lorsque les voyants de la diode électroluminescente ultraviolette de la tête d’impression s’allument et s’éteignent et s’éteignent et s’allument et s’allument à nouveau. Le logiciel doit être synchronisé avec la bioimprimante 3D avant de localiser les axes de la bioimprimante et l’étalonnage du point de départ, comme indiqué dans les étapes suivantes.
   3. Observez quatre options dans le menu de contrôle principal de la bioimprimante 3D : (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU et (iv) STATUS SCREEN. Sélectionnez l’option PREPARE BIOPRINT , puis faites défiler jusqu’à et sélectionnez l’option HOME AXES .
      REMARQUE: La bioimprimante 3D déplacera ensuite l’assemblage de la tête d’impression vers l’arrière et vers la gauche pour calibrer les axes y et x, respectivement. Par la suite, avec les têtes d’impression en pause dans la position extrême gauche, la bioimprimante soulèvera le lit d’impression jusqu’à ce que le commutateur d’étalonnage de l’axe Z (situé sur le plateau d’impression) entre en contact avec la buse de bio-impression conique installée sur la tête d’impression 1
   4. Après un étalonnage réussi des axes x-y-z , observez le léger abaissement du plateau d’impression et le déplacement des têtes d’impression au-dessus du point central du plateau d’impression (Figure 5A(i)).
5. Étalonnage du point de départ de la bioimprimante pour la bioimpression dans des plaques à 24 puits
   1. Retirez une plaque de culture stérile à 24 puits de son emballage en plastique scellé et marquez un point au centre du puits D1 sur la face inférieure de la plaque avec un marqueur permanent. Retirez le couvercle de la plaque et placez la plaque de culture à 24 puits sur le plateau d’impression avec le puits D1 situé dans le coin avant gauche du plateau d’impression.
   2. Dans le menu de contrôle principal, sélectionnez MENU UTILITAIRES , puis DÉPLACER L’AXE. Déplacez les têtes d’impression par incréments de 1 mm le long des axes x et y jusqu’à ce que la buse de bio-impression conique de PH1 soit directement au-dessus du point marqué sous le puits D1. Si nécessaire, affinez la position de la buse de bio-impression conique sur le point en déplaçant les têtes d’impression par incréments de 0,1 mm.
   3. Enregistrez les coordonnées x et y de la buse de bioimpression conique directement au-dessus du centre du puits D1, comme indiqué sur l’écran du panneau de commande de la bioimprimante 3D.
      REMARQUE: Dans le cas de la bioimprimante 3D INKREDIBLE+ utilisée ici, les coordonnées x et y sont les suivantes: x : -46,5 et y : -27,5. Ces coordonnées servent de point de départ au centre du puits D1 pour la bioimpression dans une plaque de 24 puits.
   4. Ensuite, soulevez le lit d’impression par incréments de 1 mm jusqu’à ce que le fond du puits D1 touche presque la buse de bio-impression conique installée dans la tête d’impression 1. Affinez le mouvement du plateau d’impression par incréments de 0,1 mm si nécessaire (Figure 5A(ii)). Ensuite, dans le MENU UTILITAIRES, sélectionnez l’option ÉTALONNAGE DE L’AXE Z , puis sélectionnez et confirmez l’option STORE Z CALIBRATION .
   5. Revenez au menu principal et sélectionnez l’option PREPARE BIOPRINT . Faites défiler jusqu’à et sélectionnez l’option CALIBRER Z .
      REMARQUE: La bioimprimante 3D abaissera maintenant le lit d’impression après avoir exécuté avec succès l’étalonnage de l’axe Z (Figure 5A (iii)).
6. Mise à jour du fichier G-code de la plaque à 24 puits avec les coordonnées de point de départ correctes
   1. Ouvrez le fichier de code géométrique de plaque (code G) de 24 puits fourni dans le logiciel de bioimprimation (fichier supplémentaire 1).
      REMARQUE : Ce fichier de code G à 24 puits code l’impression de constructions rectilignes à 2 couches de 5 x 5 x 1 mm dans chaque puits (Figure 5C(i),(iii)). Les fichiers G-code fournis peuvent être utilisés avec n’importe quel logiciel de bio-impression 3D.
   2. Notez que la ligne 1 du fichier G-code lit G0 X-50.0 Y-33.5 ; Position centrale du puits D1. Mettre à jour les coordonnées x et y sur la ligne 1 avec les valeurs obtenues à l’étape 4.5.3, c’est-à-dire que la ligne 1 doit maintenant lire G0 X-46.5 Y-27.5 ; Position centrale du puits D1. Enregistrez le fichier sous un nouveau nom.
      REMARQUE: Cette procédure sert à calibrer le fichier G-code afin que l’impression commence au centre du puits D1 en fonction des coordonnées x,y de la bioimprimante 3D spécifique utilisée. Cette approche peut être utilisée pour calibrer le fichier G-code de la plaque de 24 puits pour l’impression avec n’importe quelle bioimprimante 3D d’extrusion. Aux fins de la présente étude, seule la moitié gauche de la plaque de 24 puits, c’est-à-dire les puits A1-3, B1-3, C1-3 et D1-3, a été imprimée. Un fichier G-code séparé qui code l’impression de constructions rectilignes à 2 couches 5 x 5 x 1 mm dans une grille de 3 x 4 est également fourni (Fichier supplémentaire 2, Figure 5C(ii)).
7. Réglage de la pression d’extrusion pour la tête d’impression 1 (PH1)
   1. Assurez-vous que la pompe pneumatique est bien connectée à l’orifice d’admission d’air arrière de la bioimprimante 3D INKREDIBLE+ et allumez la pompe pneumatique.
   2. Retirez le bouton de commande avant situé sur le côté droit de la bioimprimante 3D INKREDIBLE+.
      REMARQUE: Le bouton de commande avant ajuste la pression pour PH1, tandis que le bouton de commande arrière ajuste la pression pour PH2.
   3. Observez les manomètres numériques pour PH1 et PH2 situés à l’avant de la bioimprimante chacun près de 0 kPa. Faites tourner lentement le bouton de commande avant dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la pression indiquée sur la jauge gauche pour PH1 atteigne 12 kPa (Figure 5A(iii)).
   4. Placez un papier de soie plié ou un morceau de film imperméable à l’eau sous la buse d’impression de la cartouche installée, en prenant soin de ne pas toucher la buse d’impression.
   5. Dans le menu de contrôle principal de la bioimprimante 3D, sélectionnez PREPARE BIOPRINT.
   6. Accédez à ET sélectionnez ACTIVER PH1. Notez que l’encre de biomatériau commence à extruder à partir de la buse d’impression. Si nécessaire, augmentez la pression d’extrusion en faisant pivoter le bouton de commande dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’encre de biomatériau soit extrudée dans un filament continu et enregistrez le nouveau réglage de pression. Travaillez rapidement pour éviter de gaspiller de l’encre de biomatériau.
   7. Sélectionnez DÉSACTIVER PH1 pour arrêter l’extrusion de l’encre de biomatériau, retirer le papier de soie ou le film contenant l’encre de biomatériau extrudé du lit d’impression et fermer la porte de la bioimprimante.
      REMARQUE: La bioimprimante 3D activera automatiquement l’alimentation en pression d’air à PH1 pendant l’impression, comme indiqué par le fichier G-code.
8. Bioimpression 3D de substrats d’hydrogel rectiligne dans un format de plaque à 24 puits
   1. Dans le menu de contrôle principal de la bioimprimante 3D, sélectionnez MENU UTILITAIRES. Accédez à et sélectionnez DÉSACTIVER L’IMPRESSION SD, ce qui permettra au logiciel de bio-imprimante de transmettre des fichiers G-code à la bioimprimante 3D pour impression.
   2. Cliquez sur le bouton LOAD dans le logiciel de bio-impression et sélectionnez le fichier G-code de plaque à 24 puits mis à jour enregistré à l’étape 4.6.2.
   3. Dans le panneau de commande de droite du logiciel, sélectionnez l’onglet APERÇU AVANT IMPRESSION et cliquez sur le bouton IMPRIMER pour commencer la bioimpression dans le puits D1.
      REMARQUE: Si vous utilisez le fichier de code G de la plaque de puits de grille 3 x 4, la bio-impression se terminera dans le puits A3 de la plaque de 24 puits (Figure 5C (ii), D), par opposition au puits A6 si une plaque complète de 24 puits est imprimée.
   4. Une fois la bioimpression des constructions rectilignes terminées, recouvrez la plaque de 24 puits avec son couvercle et déplacez-la dans une armoire de biosécurité de classe II.
   5. Immerger chaque construction rectiligne dans deux gouttes de solution stérile de _CaCl2 de 50 mM (Figure 5B(ii)), et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE: Cela sert à réticuler ioniquement les chaînes de polymères d’alginate avec les ions ^Ca2+ et permet aux constructions rectilignes de maintenir leur intégrité structurelle.
   6. Aspirer soigneusement la solution de _CaCl2 de chaque construction et rincer une fois dans 1 mL de 1x PBS (pH 7,4) pour éliminer l’excès de _CaCl2 (Figure 5D).
   7. Pour éviter la déshydratation des constructions d’hydrogel bioimprimées, maintenez les constructions rectilignes bioimprimées en 3D dans 1x PBS frais jusqu’à ce que les BMMC soient prêts à être ensemencés sur les constructions (Figure 5D).

5. Incubation de BMMC sur des échafaudages rectilignes bioimprimés en 3D et tests de viabilité

1. Incubation de BMMC sur des échafaudages d’hydrogel rectiligne bioimprimés en 3D
   1. Ensemencez des aliquotes de BMMC sur les échafaudages rectilignes bioimprimés en 3D en triple emploi pendant quatre durées différentes, par exemple 6, 18, 24 et 48 h, de sorte que tous les traitements se terminent simultanément. Utilisez des BMMC ensemencés dans des puits vides en triple exemplaire pendant les mêmes durées que les témoins non traités.
   2. Transférer aseptiquement les BMMC d’une fiole de culture T175 ^cm2 dans un tube conique stérile de 50 mL et abreuver les BMMC à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Remettre en suspension la pastille dans 50 mL de milieu RPMI complet frais contenant 20 ng/mL d’IL-3 et calculer la densité des cellules vivantes en comptant une aliquote de BMMC colorés en bleu trypan à l’aide d’un hémacytomètre.
   4. Sur la base de la densité cellulaire calculée à l’étape 5.1.3, préparer une aliquote de 6 mL de la suspension BMMC à une densité finale de 1 × ¹⁰⁶ cellules/mL.
   5. Pour la configuration d’incubation de 48 h, aspirer le PBS des puits A1-3 contenant les échafaudages d’hydrogel rectiligne bioimprimés en 3D et pipeter 1 mL de suspension BMMC (1 × ¹⁰⁶ cellules/mL) dans chaque puits. De plus, pipettez 1 mL de suspension BMMC (1 × ¹⁰⁶ cellules/mL) dans les puits A4-6 sans constructions bioimprimées pour servir de témoin non traité. Incuber les puits restants contenant des échafaudages bioimprimés (B1-3, C1-3, D1-3) dans rpmI sans additifs pour prévenir la déshydratation jusqu’à ce que le moment approprié soit atteint pour l’ensemencement avec BMMC pour les durées de traitement de 24, 18 et 6 heures. Remplissez les puits sans échafaudages bioimprimés (B4-6, C4-6, D4-6) avec 1 mL de PBS jusqu’à ce que le moment approprié soit atteint pour l’ensemencement avec les BMMC pour les points de temps de 24, 18 et 6 h.
   6. Incuber la plaque de 24 puits à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % _{de CO2} .
   7. Pour la configuration d’incubation de 24 heures, aspirer le milieu de culture/tampon préexistant des puits B1 à 6 et ensemencer 1 mL de suspension bmMC (1 × ¹⁰⁶ cellules/mL) dans ces puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
   8. Pour la configuration d’incubation de 18 h, aspirer le milieu de culture/tampon préexistant des puits C1 à 6 et ensemencer 1 mL de suspension bmMC (1 × ¹⁰⁶ cellules/mL) dans ces puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
   9. Pour la configuration d’incubation de 6 h, aspirer le milieu de culture préexistant/ tampon des puits D1-6 et ensemencer 1 mL de suspension BMMC (1 × ¹⁰⁶ cellules/mL) dans ces puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
   10. Pour la fin de l’incubation, distribuer des échantillons de chaque puits de la plaque de 24 puits pour (i) la coloration et l’analyse DE LDH par cytométrie en flux, (ii) le test de viabilité des cellules XTT et (iii) le test de libération de LDH. Par conséquent, assurez-vous qu’une plaque à fond rond de 96 puits et les tubes de microfuge nécessaires de 1,5 mL sont étiquetés bien avant le point final de l’incubation.
2. Échantillonnage cellulaire pour le test métabolique XTT
   1. Ressuspendez soigneusement les BMMC dans le milieu de culture à l’intérieur de chaque puits, en veillant à ne pas endommager et fragmenter les échafaudages d’hydrogel bioimprimés en 3D.
   2. Transférer de manière aseptique 40 μL de la suspension homogène de BMMC de chaque puits dans des tubes de microfuge stériles de 1,5 mL contenant 760 μL de milieu RPMI complet frais (volume final = 800 μL), et vortex brièvement pour mélanger.
   3. Distribuer 100 μL des suspensions BMMC diluées en triple exemplaire dans une plaque de microtitrage à fond plat de 96 puits qui convient à l’enregistrement des mesures d’absorbance (voir le Tableau des matériaux) sur un spectrophotomètre à microplaques.
   4. Distribuer 50 μL de solution de travail XTT à chaque puits contenant la suspension de cellule BMMC à l’aide d’une micropipette multicanal.
      REMARQUE: Préparer la solution de travail XTT en mélangeant 5 mL de réactif XTT avec 100 μL de réactif de couplage d’électrons. Décongeler ces composants à partir de -20 °C dans un bain-marie à 37 °C immédiatement avant utilisation.
   5. Incuber la plaque de 96 puits à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de _CO2 pendant 24 h.
   6. À la fin de l’incubation, retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et laissez refroidir à la température ambiante. Enregistrez les valeurs d’absorbance sur un spectrophotomètre à microplaques à 450 nm avec soustraction de fond à 650 nm.
3. Échantillonnage surnageant pour le dosage de la lactate déshydrogénase (LDH)
   1. Transférer les suspensions BMMC restantes (960 μL) de chaque puits de la plaque de 24 puits dans des tubes de microfuge et abreuver les cellules à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Pipeter trois aliquotes de 100 μL du surnageant de culture cellulaire de chaque tube de microfuge dans une plaque à fond plat de microtitrage de 96 puits. Jetez les surnageants restants de chaque tube de microfuge et conservez les pastilles BMMC pour une coloration ultérieure avec PI dans les sections 5.4.1-5.4.8.
   3. Pipeter 50 μL de la solution de travail LDH dans chaque aliquote de 100 μL de surnageant.
      REMARQUE : Reportez-vous au dossier supplémentaire 3 pour la préparation des réactifs d’analyse de la LDH.
   4. Incuber pendant 1 h dans l’obscurité à température ambiante.
   5. Pipette 50 μL d’acide acétique 1 M dans chaque puits pour arrêter la réaction.
   6. Enregistrez les valeurs d’absorbance sur un spectrophotomètre à microplaques à 490 nm avec soustraction de fond à 680 nm.
4. Analyse cytométrique en flux de la viabilité du BMMC par exclusion de l’iodure de propidium (IP)
   1. Remettre en suspension les granulés BMMC dans un tampon de lavage en flux (PBS [pH 7,4] contenant 0,5 % p/v de BSA) et granuler les cellules à 300 × g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Répétez l’étape de lavage avec le tampon de lavage à flux une fois de plus.
   3. Remettez en suspension chaque pastille BMMC dans un tampon de lavage à débit de 400 μL.
      REMARQUE: Il y aura 24 échantillons BMMC remis en suspension au total: 12 échantillons BMMC incubés sur des substrats d’hydrogel bioimprimés (4 points de temps en triplel) et 12 échantillons de BMMC incubés dans des puits sans constructions bioimprimées (4 points de temps en triple).
   4. Dans une plaque de microtitrage à fond rond de 96 puits, pipette 20 μL de tampon de lavage d’écoulement dans les puits A1-12 et B1-12. Dans la même plaque de microtitrage, pipette 20 μL de solution de coloration 10x PI (100 μg/mL PI dans le tampon de lavage par écoulement) dans les puits C1-12 et D1-12.
   5. Distribuer 180 μL des 12 échantillons bmMC incubés sur des substrats d’hydrogel bioimprimés dans les puits A1-12 (un échantillon par puits). Distribuer 180 μL des 12 échantillons bmMC incubés sans substrats d’hydrogel bioimprimés dans les puits B1 à 12 (un échantillon par puits). Utiliser les échantillons bmMC distribués dans les puits A1-12 et B1-12 comme témoins non colorés pour chaque condition de traitement (24 témoins au total).
   6. Distribuer 180 μL des 12 échantillons bmMC incubés sur des constructions bioimprimées dans des puits C1-12 (un échantillon par puits). Distribuer 180 μL des 12 échantillons bmMC incubés sans constructions bioimprimées dans les puits D1-12 (un échantillon par puits).
      REMARQUE : Les échantillons de BMMC dans les puits C1-12 et D1-12 seront colorés à une concentration efficace finale d’IP de 10 μg/mL (24 échantillons colorés au total).
   7. Incuber la plaque soit pendant 1 h à 4 °C, soit 15 min à température ambiante dans l’obscurité.
   8. À la fin de la période d’incubation, analyser les échantillons directement à partir de la plaque de microtitrage sur un cytomètre en flux comme décrit précédemment à la section 3.1.

Résultats

L’une des caractéristiques les plus cruciales d’une encre ou d’un substrat de culture de biomatériau réussi est celle de la biocompatibilité. Principalement, le substrat ne doit pas induire la mort cellulaire. Il existe plusieurs méthodes de microtitrage et de cytométrie en flux pour quantifier la viabilité cellulaire et la nécrose; cependant, ces méthodes ne se prêtent pas à l’analyse de cellules incorporées dans une matrice d’hydrogel. Dans ce protocole, la limitation mentionnée ci-dessus est con...

Discussion

La fabrication de tissus biomimétiques 3D nécessite l’amalgame réussi de la bioencre, qui imite les composants de la matrice extracellulaire, avec le ou les composants cellulaires pour créer des analogues physiologiques de tissus in vivo . Cela nécessite l’utilisation de cellules primaires, et non de cellules transformées, lors de la fabrication de tissus biomimétiques physiologiques. Les cellules immunologiques primaires, telles que les mastocytes, sont cependant particulièrement sensibles aux effet...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A
Acetic Acid (glacial)	Sigma Aldrich	AX0074-6
Agarose (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)	Thermo Fisher Scientific	17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)	Sigma Aldrich	N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)	BD	309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in	BD	305111
BioLite 24 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	930-186
BioLite 96 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130-191
Biosafety Cabinet Class II	Microzone Corp., Canada	BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2930-100GM
C
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)	Thermo Fisher Scientific	12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)	CELLINK LLC	IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL	CELLINK LLC	CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps	CELLINK LLC	CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC	CELLINK LLC	Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER	CELLINK LLC	S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G	CELLINK LLC	NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G	CELLINK LLC	NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G	CELLINK LLC	NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)	Sigma Aldrich	11465015001
Centrifuge (Benchtop)	Eppendorf	5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate	Sigma Aldrich	CLS3370
CO2 Incubator	Binder GmbH, Germany	9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter	A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)	Fisher Scientific	44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)	Thermo Fisher Scientific	17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	12484028
FlowJo Software	Becton Dickinson & Co. USA	Version 10.6.2
G
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)	VWR	15170-208
HEPES Sodium Salt	Fisher Scientific	BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)	Sigma Aldrich	I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
Lithium L-lactate	Sigma Aldrich	L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)	Sigma Aldrich	M8640
Microtubes (1.7 mL clear)	Axygen	MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)	Axygen	MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)	Millipore	ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)	Thermo Fisher Scientific	725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)	Thermo Fisher Scientific	12-4031-82
Recombinant Murine IL-3	PeproTech, Inc.	213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)	GE Healthcare	SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)	Fisher Scientific	NC9913213
Sodium Azide, 500 g	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma Aldrich	252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)	Sigma Aldrich	93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0