Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea

Resumen

Este protocolo destaca un método para evaluar rápidamente la biocompatibilidad de una tinta de biomaterial de hidrogel compuesto de nanocelulosa cristalina (CNC)/agarosa con mastocitos derivados de la médula ósea de ratón en términos de viabilidad celular y expresión fenotípica de los receptores de la superficie celular, Kit (CD117) y receptor IgE de alta afinidad (FcεRI).

Resumen

La bioimpresión tridimensional (3D) utiliza compuestos a base de hidrogel (o tintas de biomateriales) que se depositan en un patrón, formando un sustrato sobre el que se depositan las células. Debido a que muchas tintas de biomateriales pueden ser potencialmente citotóxicas para las células primarias, es necesario determinar la biocompatibilidad de estos compuestos de hidrogel antes de su utilización en costosos procesos de ingeniería de tejidos 3D. Algunos métodos de cultivo 3D, incluida la bioimpresión, requieren que las células se incrusten en una matriz 3D, lo que dificulta la extracción y el análisis de las células en busca de cambios en la viabilidad y la expresión de biomarcadores sin provocar daños mecánicos. Este protocolo describe como prueba de concepto, un método para evaluar la biocompatibilidad de un compuesto de agarosa incrustado de nanocelulosa cristalina (CNC), fabricado en un sistema de cultivo de 24 pocillos, con mastocitos derivados de médula ósea de ratón (BMMC) utilizando ensayos citométricos de flujo para la viabilidad celular y la expresión de biomarcadores.

Después de 18 h de exposición a la matriz CNC/agarosa/D-manitol, la viabilidad de BMMC no se alteró según lo medido por la permeabilidad del yoduro de propidio (PI). Sin embargo, los BMMC cultivados en el sustrato CNC/agarosa/D-manitol parecieron aumentar ligeramente su expresión del receptor IgE de alta afinidad (FcεRI) y el receptor del factor de células madre (Kit; CD117), aunque esto no parece depender de la cantidad de CNC en el compuesto de biotinta. La viabilidad de los BMMC también se evaluó después de una exposición prolongada a andamios de hidrogel que se fabricaron a partir de una tinta de biomaterial comercial compuesta de nanocelulosa fibrilar (FNC) y alginato de sodio utilizando una bioimpresora de extrusión 3D. Durante un período de 6-48 h, los sustratos FNC/alginato no afectaron negativamente a la viabilidad de los BMMCs según lo determinado por la citometría de flujo y los ensayos de microtituladores (XTT y lactato deshidrogenasa). Este protocolo describe un método eficiente para evaluar rápidamente la compatibilidad bioquímica de las tintas de biomateriales candidatas para su utilidad como andamios 3D para la siembra posterior a la impresión con mastocitos.

Introducción

El reciente interés en los sistemas de cultivo 3D y la bioimpresión 3D ha centrado la atención en los hidrogeles y los compuestos de hidrogel. Estos compuestos sirven como biomiméticos viscosos pero porosos y pueden estar compuestos de hasta un 99% de contenido de agua en peso, lo que es comparable a los tejidos biológicos1,2,3. Estas características de los compuestos de hidrogel permiten el crecimiento de las células sin afectar su viabilidad y función. Uno de estos compuestos es la nanocelulosa cristalina (CNC), que se ha utilizado como material de refuerzo en compuestos de....

Protocolo

NOTA: Este protocolo se compone de cinco secciones: (1) aislamiento de la médula ósea de ratón y diferenciación de mastocitos derivados de la médula ósea de ratón (BMMCs), (2) fabricación de sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol en un sistema de 24 pocillos y cultivo de BMMCs en los sustratos, (3) eliminación de BMMCs de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol y análisis de viabilidad y expresión de biomarcadores mediante citometría de flujo, (4) Bioimpresión 3D de andamios de hidrogel a partir de una tinta de biomaterial compuesto de nanocelulosa fibrilar (FNC)/alginato de sodio disponible comercialmente, y (5) cultivo de BMMC en andamios de hidrogel d....

Resultados

Una de las características más cruciales de una tinta de biomaterial o sustrato de cultivo exitoso es la de la biocompatibilidad. Principalmente, el sustrato no debe inducir la muerte celular. Existen varios métodos citométricos de flujo y basados en microtituladores para cuantificar la viabilidad celular y la necrosis; sin embargo, estos métodos no son susceptibles de analizar células incrustadas dentro de una matriz de hidrogel. En este protocolo, la limitación mencionada anteriormente se elude sembrando los MMM.......

Discusión

La fabricación de tejidos biomiméticos 3D requiere la amalgama exitosa de la biotinta, que imita los componentes de la matriz extracelular, con los componentes celulares para crear análogos fisiológicos de los tejidos in vivo . Esto requiere el uso de células primarias, y no células transformadas, al fabricar tejidos biomiméticos fisiológicos. Sin embargo, las células inmunológicas primarias, como los mastocitos, son particularmente susceptibles a los efectos citotóxicos y a los cambios fenotípicos q.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A
Acetic Acid (glacial)	Sigma Aldrich	AX0074-6
Agarose (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)	Thermo Fisher Scientific	17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)	Sigma Aldrich	N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)	BD	309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in	BD	305111
BioLite 24 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	930-186
BioLite 96 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130-191
Biosafety Cabinet Class II	Microzone Corp., Canada	BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2930-100GM
C
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)	Thermo Fisher Scientific	12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)	CELLINK LLC	IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL	CELLINK LLC	CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps	CELLINK LLC	CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC	CELLINK LLC	Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER	CELLINK LLC	S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G	CELLINK LLC	NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G	CELLINK LLC	NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G	CELLINK LLC	NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)	Sigma Aldrich	11465015001
Centrifuge (Benchtop)	Eppendorf	5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate	Sigma Aldrich	CLS3370
CO2 Incubator	Binder GmbH, Germany	9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter	A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)	Fisher Scientific	44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)	Thermo Fisher Scientific	17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	12484028
FlowJo Software	Becton Dickinson & Co. USA	Version 10.6.2
G
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)	VWR	15170-208
HEPES Sodium Salt	Fisher Scientific	BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)	Sigma Aldrich	I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
Lithium L-lactate	Sigma Aldrich	L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)	Sigma Aldrich	M8640
Microtubes (1.7 mL clear)	Axygen	MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)	Axygen	MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)	Millipore	ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)	Thermo Fisher Scientific	725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)	Thermo Fisher Scientific	12-4031-82
Recombinant Murine IL-3	PeproTech, Inc.	213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)	GE Healthcare	SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)	Fisher Scientific	NC9913213
Sodium Azide, 500 g	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma Aldrich	252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)	Sigma Aldrich	93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0