Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגיש שיטה להערכה מהירה של תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC)/אגרוז דיו ביו-חומרים מרוכבים הידרוג'ל עם תאי פין שמקורם במח העצם של העכבר במונחים של כדאיות התא וביטוי פנוטיפי של קולטני פני השטח של התא, קיט (CD117) וקולטן IgE בעל זיקה גבוהה (FcεRI).

Abstract

ביו-הדפסה תלת מימדית (תלת-ממדית) משתמשת ברכיבים מרוכבים מבוססי הידרוג'ל (או דיו ביו-חומרי) המופקדים בתבנית ויוצרת מצע שעליו מופקדים תאים. מכיוון שדיו ביו-חומרים רבים יכולים להיות ציטוקסיים פוטנציאליים לתאים ראשוניים, יש צורך לקבוע את תאימות ביולוגית של מרוכבים הידרוג'ל אלה לפני השימוש שלהם בתהליכים יקרים של הנדסת רקמות תלת-ממדיות. כמה שיטות תרבית תלת-ממדית, כולל הדפסה ביולוגית, דורשות שתאים יוטבעו במטריצה תלת-ממדית, מה שמקשה על חילוץ וניתוח התאים לשינויים בכדאיות ובביטוי סמן ביולוגי מבלי לגרום לנזק מכני. פרוטוקול זה מתאר כהוכחה של מושג, שיטה להערכת תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC) מוטבע אגרוז מרוכבים, מפוברק לתוך מערכת תרבית 24-well, עם תאי פיטום נגזר מח עצם העכבר (BMMCs) באמצעות תרסיסים ציטומטריים זרימה עבור הכדאיות התא וביטוי סמן ביולוגי.

לאחר 18 שעות של חשיפה למטריקס CNC / אגרוז / D-מניטול, הכדאיות BMMC לא היה ללא כל כפי שנמדד על ידי חמיצות יוד פרופיליום (PI). עם זאת, BMMCs תרבית על CNC / agarose / D-מניטול מצע נראה להגדיל מעט את הביטוי שלהם של קולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI) ואת קולטן גורם תא גזע (ערכה; CD117), למרות שזה לא נראה תלוי בכמות CNC בביוינק מורכב. הכדאיות של BMMCs הוערכה גם בעקבות חשיפה לקורס זמן לפיגומים הידרוג'ל שהיו מפוברקים מדיו ביו-חומרים מסחרי המורכב מננו-תאי פרברילר (FNC) ונתרן אלגינט באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית. במשך תקופה של 6-48 שעות, מצעים FNC / אלגינט לא השפיעו לרעה על הכדאיות של BMMCs כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה ובדיקות microtiter (XTT ו לקטט דהידרוגנאז). פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנן במהירות את התאימות הביוכימית של דיו ביו-חומרים מועמד עבור השירות שלהם כפיגומים תלת-ממדיים לזריעה לאחר ההדפסה עם תאי פין.

Introduction

העניין האחרון במערכות תרבות תלת-ממדית וביו-הדפסה תלת-ממדית מיקד את תשומת הלב בהידרוג'לים ובהידרוג'ל מרוכבים. מרוכבים אלה משמשים צמיג אך נקבובי biomimetics והוא יכול להיות מורכב עד 99% תכולת מים לפי משקל, אשר דומה רקמות ביולוגיות1,2,3. תכונות אלה של מרוכבים הידרוג'ל ובכך לאפשר את הצמיחה של תאים מבלי להשפיע על הכדאיות שלהם ותפקוד. מרוכבים אחד כזה הוא ננו-תאי גבישי (CNC), אשר שימש כחומר חיזוק ב מרוכבים הידרוג'ל, פיגומים תאים בפיתוח של שתלים ביו-חומרים, ובתרבות תאים דו מימדית (2D) ותלת-ממדית במבחנה4,5. על פי רוב, מטריצות המורכבות CNC אינן ציטוטוקסיות גלויות לתאי אפיתל קרנית אנושית6, תאי אפיתל מעיים7, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושי8, או תאים דמויי נוירון9. עם זאת, פעילות מטבולית והתפשטות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושיים פוחתת בקורלציה עם הצמיגות המוגברת של מרוכבים ננו-תאיים מבוססי עץ, דבר המצביע על כך שיש לבדוק בקפידה את הרכב המטריצה להשפעותיה המזיקות על תפקודי התא8.

באופן דומה, CNC יכול לגרום לתגובות דלקתיות במקרואפגים עם ההפנמה, אשר יכול להיות השלכות חמורות במערכות תרבית תאי החיסון 3D10,11. למעשה, יש מעט מאוד נתונים זמינים על איך CNC עשוי להשפיע על תגובות אחרות של תאי החיסון, במיוחד תגובות דלקתיות אלרגיות כי הם יזם על ידי תאי פין. תאי פיסט הם לויקוציטים מגורענים המבטאים את קולטן IgE בעל הזיקה הגבוהה, FceRI, האחראי להפעלת תגובות דלקתיות לאלרגנים. התפשטותם ובידולם תלויים בגורם תאי הגזע (SCF), הקושר את קולטן טירוזין, קיט. תאי פיסט נגזרים מתאי מח עצם שנכנסים למחזור ולאחר מכן נודדים באופן היקפי כדי להתפזר בכל מקום בכל הרקמות האנושיות12. כמו תאי פין לתפקד בסביבת רקמה 3D, הם מועמד אידיאלי לתאי החיסון לחקר תהליכים אימונולוגיים במודלים של רקמת 3D במבחנה. עם זאת, עד כה, אין מודל רקמה 3D במבחנה המכיל תאי פין.

בשל האופי הרגיש ביותר של תאי פיסט ונטייתם לעורר תגובות פרו דלקתיות לגירויים חיצוניים, נדרשת התחשבות זהירה במרכיבי מטריצת תלת-ממד ושיטת ההדפסה הביולוגית של החדרת תאי פיסט לפיגומים תלת-ממדיים, כפי שנדון בהמשך. מבנים רקמה יכול להיות biofabricated משתי קטגוריות רחבות של biomaterials, כלומר, bioinks ודיו ביו-חומרים. ההבחנה טמונה בעובדה כי bioinks הם מרוכבים הידרוג'ל עמוס תאים, ואילו דיו ביו-חומרים הם מרוכבים הידרוג'ל כי הם נטולי תאים, כפי שהוגדר על ידי Groll et al.13,14. לפיכך, מבנים תלת-ממדיים המודפסים עם ביו-ינקים מכילים תאים המוטבעים מראש במטריצת ההידרוג'ל, בעוד מבנים תלת-ממדיים המודפסים בדיו ביו-חומריים צריכים להיות מוזרעים בתאים לאחר ההדפסה. הביו-פיכחון של פיגומי תרבות מביו-ינקים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג'ל מבוצע בדרך כלל באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית של שחול, המבלטים בדיו הביו-וינק/ביו-חומרים באמצעות זרבובית מיקרו-קשקשים תחת לחץ באמצעות בוכנה פנאומטית או מכנית14. ביו-הדפסה מייצרת פיגומים תלת-ממדיים על ידי הפקדת הביו-ינק בדפוסים חתך בדו-ממדיים שנערמו זה על זה בגישה של "מלמטה למעלה".

כדי להיות תואם להדפסה ביולוגית של שחול, הדיו הביולוגי/ביו-חומרים מבוסס ההידרוג'ל חייב להיות בעל תכונות טיקסוטרופיות (דילול גחלה), לפיהן פולימרים הידרוג'ל המרכיבים את זרימת הדיו הביו-וינק/ביו-חומרים כמו נוזל דרך זרבובית מיקרו-ערוצית כאשר הם נתונים ללחץ גזוז, אך חוזרים למצב צמיג דמוי ג'ל עם הסרת הלחץ הגועתי15 . בשל תכולת המים הגבוהה שלהם, יש לקשר בין הפולימרים של ביונקים ביולוגיים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג'ל, פיזית או קוולנטית, כדי לשמור על הארכיטקטורה והשלמות המבנית של המבנה הביו-מודפס תלת-ממדי. במקרה של ביונקים עמוסי תאים, התאים נתונים ישירות ללחצים כימיים במהלך תהליך ההצלבה. תהליך השולט תאים עטופים בתוך מטריצת הידרוג'ל bioink גם נושא את התאים לגיז לחץ גיזום, אשר יכול להוביל ירידה הכדאיות ו /או מוות תאים. לאחר מודל הרקמה 3D כבר ביוהדפסה, קשה להפלות בין רמות של ציטוטוקסיות המועלה על ידי מטריצת הידרוג'ל עצמה ואת תהליכי שחול וקישור, בהתאמה. זה מאתגר במיוחד בהקשר של פיגומים תלת-ממדיים שבהם התאים מוטבעים מראש בתוך מטריצת ההידרוג'ל, ובכך מקשים על הסרת התאים עבור ניתוחים הבאים, אשר יפגע בכדאיות של תאי פין.

גישה עדינה יותר ליצירת מבנים של רקמה תלת-ממדית המכילה תאי פיסט כרוכה בזריעת התאים לפיגומים תלת-ממדיים דיו ביו-חומריים מודפסים מראש מהשעיית תרבית התא, הממנפת את היכולת המולדת של תאי פין לנדוד מהמחזור לרקמות היקפיות. היתרונות של גישת זריעת תאים זו הם כפולים: (i) תאי התורן אינם נתונים לגיזום גיזה וכימיקלים מתהליכי השחול וההצלבה, בהתאמה, ו-(ii) ניתן להסיר בקלות את התאים מהפיגומים 3D לאחר החשיפה על ידי כביסה עדינה לניתוח מבלי להשפיע לרעה על הכדאיות שלהם. היתרון הנוסף של זריעה וניתוח הכדאיות של תאי פיסט על פיגומי הידרוג'ל נקבוביים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית לעומת דיסקים הידרוג'ל דו-ממדיים הוא שפיגומי הידרוג'ל תלת-ממדיים מודפסים ביו-הדפסה חוזרים לתכונות טופוגרפיות מיקרו-בקנה מידה זעיר של רקמות ויוו , שאינן קיימות בתפזורת, דיסקים הידרוג'ל פלנאריים דו-ממדיים. גישה זו היא גישה מתאימה, מהירה וחסכונית כדי לקבוע את ההשפעות הציטוטוקסיות שעלולות להיות קטסטרופליות של מטריצות הידרוג'ל ביו-סינק מועמדות על תאי פיטום, כמו גם תאים אימונולוגיים אחרים, לפני השקעה בניסויים יקרים בהנדסת רקמות תלת-ממדיות.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: (1) בידוד של מח עצם העכבר ובידול של תאי פיטום שמקורם במח עכבר (BMMCs), (2) ייצור של מצעים הידרוג'ל CNC / agarose / D-מניטול במערכת 24-well ותרבות של BMMCs על המצעים, (3) הסרת BMMCs מן CNC / agarose / D-מניטול הידרוג'ל וסטוח של כדאיות וביטוי סמן ביולוגי באמצעות cytometry זרימה, (4) ביו-הדפסה תלת-ממדית של פיגומי הידרוג'ל מפיברילר ננו-תאי (FNC) /נתרן אלגינט ביו-חומרים מורכבים, ותרבית (5) של BMMCs על פיגומי הידרוג'ל FNC/נתרן אלגינט וניתוח הכדאיות באמצעות ציטומטריית זרימה, XTT, ומיקרו-טייטר דהידרוגנאז לקטט (LDH).

1. דור תרבות ה- BMMC

הערה: עכברים הומתו על ידי חנק CO2 בעקבות הרדמה איזופלורן. השוקה ועצם הירך היו מבודדים, ומח עצם שלם נקצר. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם למועצה הקנדית להנחיות ולמדיניות לטיפול בבעלי חיים באישור ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים במדעי הבריאות של אוניברסיטת אלברטה.

  1. הכן את RPMI-1640 מלא תרבות בינוני על ידי הוספת התוספים המפורטים בטבלה 1 לריכוזים הסופיים שצוינו. כוונן את רמת ה-pH של המדיום ל-7.4-7.6 באמצעות NaOH, עיקור מסנן באמצעות מסנן חד פעמי עם בקבוק עליון (גודל נקבובית של 0.2 מיקרומטר) ואחסן ב-4 °C (4 °F) בחושך למשך עד חודשיים.
  2. להשיג ירמואים מעכברים בהתאם לפרוטוקולים והנהלים של הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטה.
    הערה: במחקר זה, עצם הירך היו מבודדים מעכברים C57BL/6, אבל כל זן יכול לשמש אם זה רלוונטי למחקר.
  3. בעזרת מספריים, הסירו את העור והשרירים ממפרק הירך ולאחר מכן משכו בעדינות את עצם הירך על-ידי פיתול מעט מתוך שקע הירך (איור 1). תיזהר לא לשבור את ראש הירך. חותכים את השוקה הרחק מ עצם הירך ב-1.5 מעלות באמצעות מספריים. הסר את כף רגל על ידי חיתוך ממש מעל הקלקנום ולהשליך.
  4. בעזרת אזמל, יש להסיר את העור ואת הסחוס מחתיכות עצם הירך והשוקה. באמצעות מספריים, לעשות חתך נקי על כל קצה של עצם הירך ואת השוקה, לחשוף את מח העצם האדום בפנים. במידת הצורך, להסיר את השוקית בשלב זה, אבל שים לב שזה עשוי לסייע במניפולציה של השוקה במהלך שטיפה מח עצם.
  5. הכן מחט 26 G עם מזרק 5 מ"ל luer-lock, ולמלא עם כ 5 מ"ל של מדיה מלאה מוכן כמתואר לעיל.
    הערה: בשלב זה, RPMI לא שלם ללא התוספים יכול לשמש גם כדי לחסוך על ריאגנטים.
  6. מחזיק את עצם הירך או השוקה עם מלקחיים, להכניס את המחט לקצה אחד של העצם ולחץ בעדינות על המזרק. החזק את העצם מעל צינור חרוט סטרילי 50 מ"ל, בעדינות להזריק כ 5 מ"ל של בינוני לתוך העצם, הפעלת קצת לחץ. צפו בפיסות של מח עצם נופלות מהקצה השני של העצם כסרטים אדומים דקים לתוך הצינור החרוט.
  7. ספין למטה את השאיפות resuspend במדיום מלא, או להעביר ישירות לתוך T175 cm2 בקבוק תרבית רקמות סטריליות המכיל 50 מ"ל של RPMI-1640 מלא בינוני. שמור על השאיפות במדיום RPMI-1640 מלא עם 30 ng/mL עכבר רקומביננטי interleukin (IL)-3.
  8. לאחר יום אחד, התבונן בתרביות תחת מיקרוסקופ אור. התרבות תורכב מאוכלוסייה הטרוגנית של תאים בצורות וגדלים שונים וחתיכות גדולות עוד יותר של מח עצם. הזן תרביות תאים על ידי הוספת 15 מ"ל של מדיום טרי כל 3-5 ימים באמצעות המדיום המלא RPMI-1640 כמתואר לעיל, ולהבטיח את צפיפות התא לעולם לא יעלה על 1 × 106 תאים / מ"ל. פעם בשבוע, לסובב את התאים ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend טרי RPMI-1640 בינוני, לפצל 1:4 לתוך 50 מ"ל של בינוני בבקבוקי T175 טריים.
  9. לאחר 4 שבועות, לקבוע את טוהר התא על ידי מדידת ביטוי פני השטח של קולטני CD117 (Kit) ו- FceRI על ידי ציטומטריית זרימה כמתואר להלן (סעיף 3.2).
    הערה: לאחר 4 שבועות, 99% מהתאים צריכים להיות חיוביים כפולים עבור CD117 (Kit) ו- FcεRI.
  10. ב 4 שבועות ואילך, לשמור על BMMCs עם 20 ננוגרם / מ"ל של IL-3 במצב בינוני RPMI-1640 מלא. בעוד כ-6 שבועות, התאים יפסיקו להתחלק ולא יזדקקו עוד לפיצול. להאכיל את התרבויות כל 3-5 ימים, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה פעם בשבוע, ו resuspend RPMI-1640 מלא טרי.

2. ייצור המצעים ההידרוגלים CNC/אגרוז/D-מניטול ותרבות ה- BMMC

  1. בבקבוק זכוכית, להוסיף 0.2 גרם של אבקת אגרוז מלוחים חוצצי פוספט (PBS) (2% w /v) לנפח סופי של 10 מ"ל, להרתיח במשך 1 דקות ב 100 °C (50 °F) כדי להתמוסס.
  2. יש להמיס 2.5 גרם אבקת CNC ב-PBS לנפח סופי של 10 מ"ל כדי להכין תערובת של 25% w/v.
  3. ממיסים 2 גרם אבקת CNC ב- PBS לנפח סופי של 10 מ"ל כדי להכין תערובת של 20% w/v, ולדלל באופן סדרתי את תערובת 20% w/v כדי להכין תערובות 10, 5 ו-2% w/v CNC.
  4. מחממים את התערובות 25, 20, 10, 5 ו-2% w/v CNC ל-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (איור 2A).
  5. הוסיפו 0.46 גרם של D-מניטול לתמיסת אגרוז חם (4.6% w/v) והתמוססו.
  6. מערבבים את תערובות 25, 20, 10, 5 ו-2% w/v CNC-PBS עם תמיסת האגרוז/D-מניטול החמה בצינורות חרוטיים נפרדים ביחס של 1:1 כדי להניב ריכוזי CNC סופיים של 12.5, 10, 5, 2.5 ו-1% w/v בתערובות ההידרוגל.
  7. כדי לעבוד במהירות, להוסיף 500 μL/well של הפתרונות הנ"ל שהוכנו בשלב 2.6 ב-quadruplicate ללוח תרבות של 24 בארות, ולתת לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על פילמור (איור 2B).
  8. שכבה בזהירות 1000 μL של השעיית BMMC בצפיפות של 1.1 × 106 תאים / מ"ל על גבי מצעים הידרוג'ל עם micropipettor, ולהימנע מלגעת בג'ל עם קצה הפיפטה כמו זה יפגע פני השטח ג'ל וליצור חלקיקים.
  9. לדגור את BMMCs על מצע הידרוג'ל באינקובטור סטרילי (5% CO2, אטמוספרה לחה) ב 37 °C (18 שעות).

3. ניתוחים ציטומטריים זרימה

  1. ניתוח ציטומטרי זרימה של הכדאיות BMMC באמצעות אי הכללת PI
    1. הסר בזהירות את המדיום התרבותי המכיל BMMCs מראש CNC / אגרוז / D-מניטול, הימנעות הג'ל, ולהעביר את התאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל.
    2. לשטוף את BMMCs פעמיים עם PBS (pH 7.4) המכיל 0.5% w / v אלבומין סרום בקר ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ו resuspend ב 180 μL של PBS-0.5% w /v BSA לצפיפות סופית של 1.5 × 106 תאים / מ"ל. מעבירים את התאים לצלחת עגולה 96 היטב.
      הערה: מסנן-לעקר את כל פתרונות PBS-0.5% w /v BSA פעמיים באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר, ולאחסן ב 4 °C (7 °F).
    3. הוסף 20 μL של PBS-0.5% w /v BSA, או 10x PI (100 מיקרוגרם / מ"ל) מוכן PBS-0.5% w / v BSA, לתאים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל, ודגרה עבור 1 שעות ב 4 °C (5 °F) או 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לרכוש נתוני פלואורסצנטיות באמצעות cytometer זרימה מצויד לייזר יון ארגון (488-514 ננומטר) ומסנן bandpass כדי לאפשר זיהוי של פליטת פלואורסצנטיות ב 578 ננומטר. לרכוש 20,000 אירועים לדגימה בקצב זרימה של 30 μL / min בטמפרטורת החדר. נתח את הנתונים כמתואר להלן (סעיפים 3.2.7-3.2.10).
  2. ניתוח ציטומטרי זרימה של BMMCs עבור ערכה (CD117) וביטוי קולטן פני השטח FcεRI
    1. הסר בזהירות את המדיום התרבותי המכיל BMMCs מראש CNC / אגרוז / D-מניטול, הימנעות הג'ל, ולהעביר את התאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל.
    2. לשטוף BMMCs פעמיים עם PBS-0.5% BSA מסונן ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ו resuspend ב 180 μL של PBS המכיל 0.5% w / v BSA (1.5 × 106 תאים / מ"ל). מעבירים את התאים המחודשים לצלחת עגולה בת 96 בארות.
    3. הוסף 20 μL של 10x פתרונות עבודה נוגדן לתאים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.06 מיקרוגרם / מ"ל של CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) ו 0.06 מיקרוגרם / mL של FcεRIα-allophycocyanin (APC), בהתאמה.
      הערה: יש להכין את פתרונות העבודה של נוגדני 10x ב- PBS-0.5% w/v BSA מעוקר מסנן.
    4. הוסף 20 μL של 10x איזוטיפ בקרת פתרונות עבודה המכילים גם חולדה IgG2b κ איזוטיפ control-PE או אוגר ארמני IgG איזוטיפ בקרה-APC כדי להפריד בארות המכילות תאים שלא הוכתמו עם אף אחד מהנוגדנים-פלואורופור מצומד בשלב 3.2.3.
      הערה: פקדי איזוטיפ, חולדה IgG2b κ איזוטיפ בקרה-PE ואוגר ארמני IgG איזוטיפ בקרה-APC משמשים לשליטה עבור התקשרות לא ספציפית של נוגדנים ל- BMMC. כמו BMMCs אינם מבטאים רמות גבוהות של FcR, יש רק לעתים רחוקות פלואורסצנטיות רקע גבוהה זוהתה עם נוגדנים בקרת איזוטיפ. הכן את פתרונות העבודה של בקרת איזוטיפ 10x ב- PBS-0.5% w/v BSA מעוקר מסנן.
    5. לדגור על צלחת 96-היטב עגול תחתון במשך 1 שעה ב 4 °C (60 °F) בחושך.
    6. לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של PBS-0.5% w / v חוצץ BSA לכל באר, וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת. הסר בזהירות את supernatant מבלי לגעת גלולה התא; להשאיר מאחור כמה supernatant כדי להבטיח כי גלולה התא נשאר ללא הפרעה.
    7. לאחר הכביסה, resuspend תאים ב 100 μL של 0.5% w /v BSA, 0.05% w /v נתרן אזיד ב PBS (pH 7.4) כי כבר סטרילי מסונן פעמיים עם מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר. לרכוש נתוני פלואורסצנטיות בערוצי גלאי PE ו- APC באמצעות cytometer זרימה, כפי שמתואר לעיל בשלב 3.1.3.
    8. נתח נתונים באמצעות תוכנה המסוגלת להציג ולנתח קבצי נתונים ציטומטריים של זרימה עם הסיומת ".fcs".
    9. התחל ניתוח על-ידי התוויית פיזור קדימה (FSC) לאורך ציר x ופיזור הצד (SSC) לאורך ציר ה- y, ושער עבור אוכלוסיית התאים השמורים עם טווח FSC של log10 1.5-5.0 וטווח SSC של log10 0.75-3.25 בתאים הלא מטופלים והלא נגועים כפי שמוצג באיור 3A(i),(ii).
      הערה: פעולה זו משמשת כדי להבטיח כי פסולת תאים עם ערכי FSC ו- SSC נמוכים מסולקים מהניתוח. תאי פיסט הם בדרך כלל תאים גרגריים מאוד (SSC גבוה) וגדולים (FSC גבוה) בהשוואה לסוגי תאים אימונולוגיים אחרים, כגון מונוציטים ולימפוציטים.
    10. לאחר מכן, ליצור FSC לעומת SSC נקודות פרופילים של דגימות לא מטופלות כי כבר מוכתמים עם צבע, נוגדנים, או פקדי איזוטיפ, ולקבל עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) בערוצי PE או APC על פי ספקטרום הפליטה של הצמד או צבע הנוגדנים-פלואורופור הספציפיים המשמשים. החל את אותה קבוצה של שערים ופרמטרים על כל דגימות BMMC דגירה עם מצעים שונים CNC / אגרוז / D-מניטול מוכתם עם פקדי איזוטיפ המתאימים, נוגדנים, או צבע; השג MFIs.
      הערה: בעיקרו של דבר, החלקות הנקודות FSC לעומת SSC של הדגימות המוכתמות שלא טופלו צריכות להיות מוערכות מדגימות לא מטופלות/לא נגועות, המתקבלות בשלב 3.2.9, כדי להבטיח שהליך ההכתמה לא ישנה את גודל התא (נמדד על ידי FSC) או את הגרגריות (נמדד על-ידי SSC) (איור 3A(i),(ii)).
    11. חשב MFIs ממוצע ושגיאה סטנדרטית של ממוצע (SEM) עבור כל מדגם מתוך 4 ניסויים עצמאיים ואחריו יצירת גרפים באמצעות חבילת תוכנה לניתוח סטטיסטי.
    12. הכן שכבות-על של היסטוגרמה בתוכנת ניתוח הנתונים הציטומטרית של הזרימה (איור 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D ביו-הדפסה של מצעים הידרוג'ל FNC/נתרן אלגינט

הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד המשמשת במחקר זה היא מערכת שחול פנאומטית המצוידת בשני ראשי הדפסה עצמאיים הנשלטים בטמפרטורה. הדיו הביו-חומרים המשמש להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של פיגומי ההידרוג'ל מנוסחים (א) מננו-תאית פיברילר (FNC) בעלת לחות רבה, הדומה מבחינה מורפולוגית לקולגן, (ב) נתרן אלגינט ו-(ג) D-מניטול. הוא מסופק כמו מתלה הידרוג'ל סטרילי במחסניות 3 מ"ל שאליהן ניתן לחבר חרירי ביו-הדפסה חרוטיים סטריליים (22, 25 או 27 גרם).

  1. השתמש בפרוטוקול זה עם ראשי ההדפסה ומודפס בטמפרטורת החדר, שם טמפרטורת החדר היא 20-25 מעלות צלזיוס.
  2. אחסן את מחסניות הדיו הביו-חומרים ב- 4 °C (4 °F) כדי לשמור על היציבות של מרוכבים הידרוג'ל. לפני תחילת הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, יש להסיר מחסנית (3 מ"ל) מהמקרר ולאפשר לה להתפרק לטמפרטורת החדר.
  3. התקנת מחסנית ביוינק על ביו-הדפסה מסוג INKREDIBLE+ תלת-ממדי
    1. הסר את כובעי הקצה הכחולים ממחסנית הדיו הביו-חומרית בגודל 3 מ"ל (איור 5B(i)), והדבק זרבובית ביו-הדפסה חרוט סטרילית של 22 גרם (כחול) לקצה הנעילה של מחסנית הביוינק.
      הערה: חיוני להצמיד את זרבובית הביו-הדפסה החרוטית הרצויה למחסנית הביו-וינק לפני התקנת המחסנית וביצוע שלבי הכיול הבאים, שכן אי ביצוע פעולה זו יגרום לכיול לא תקין של ציר z של הביו-הדפסה בתלת-ממד.
    2. חבר את צינורות אספקת לחץ האוויר עבור ראש ההדפסה 1 (PH1, משמאל) לקצה הנגדי של המחסנית, והכנס את המחסנית עם זרבובית ההדפסה החרוטית המצורפת שלה לחריץ האנכי של PH1 (איור 5A(ii)).
    3. הונחו היטב את המחסנית ב-PH1 עם זרבובית הטביעה החרוטית המשתרעת מתחת לראש ההדפסה. הדק את הבורג ב-PH1 בכיוון השעון עד להדק את האצבע כדי לנעול את מחסנית הביוינק במקומה. שים לב כי הדפסה ביולוגית 3D יכול להתבצע עם PH2 נשאר ריק.
  4. כיול צירי x-y-z של הביו-הדפסה תלת-ממדית
    1. הפעל את הביו-הדפסה תלת-ממדית והפעל את תוכנת הביו-הדפסה במחשב המחובר להדפסה הביולוגית תלת-ממדית באמצעות כבל USB 2.0.
    2. בתוכנה, לחץ על לחצן CONNECT כדי לסנכרן את התוכנה עם הביו-הדפסה בתלת-ממד.
      הערה: הסינכרון מצליח כאשר אורות הדיודה הפולטים אור אולטרה סגול של ראש ההדפסה מופעלים לסירוגין, ומאוורר מסנן HEPA עובר לסירוגין שוב ושוב. התוכנה חייבת להיות מסונכרנת עם הביו-הדפסה בתלת-ממד לפני ביות צירי הביו-הדפסה וכיול נקודת ההתחלה, כפי שמתואר בשלבים הבאים.
    3. שים לב לארבע אפשרויות בתפריט הבקרה הראשי של הביו-הדפסה בתלת-ממד: (i) הכנת ביו-הדפסה, (ii) ביו-הדפסה, (iii) תפריט כלי שירות ו-(iv) SCREEN STATUS. בחרו באפשרות 'הכנת ביו-הדפסה ' ולאחר מכן גלול מטה ובחרו באפשרות 'צירי בית' .
      הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד תזיז את הרכב ראש ההדפסה אחורה ושמאלה כדי לכייל את צירי ה- y וה- x, בהתאמה. לאחר מכן, כאשר ראשי ההדפסה מושהים במיקום השמאלי הרחוק, הביו-הדפסה תעלה את המודפס עד שמתג הכיול ציר z (הממוקם על נייר ההדפסה) ייצור קשר עם זרבובית הביו-הדפסה החרוטית המותקנת על ראש ההדפסה 1
    4. לאחר כיול מוצלח של צירי x-y-z , שים לב להנמכה הקלה של מיטת ההדפסה ובהעתקת ראשי ההדפסה אל מעל נקודת המרכז של מיטת ההדפסה (איור 5A(i)).
  5. כיול נקודת התחלה של הביו-הדפסה להדפסה ביולוגית בלוחות של 24 בארות
    1. הסר צלחת תרבות סטרילית 24-well מן העטיפה פלסטיק אטום שלה, ולסמן נקודה של בנקודת המרכז של גם D1 בחלק התחתון של הצלחת עם סמן קבוע. הסר את כיסוי הצלחת, ומניחים את צלחת התרבות 24-well על המודפס עם גם D1 הממוקם בפינה השמאלית הקדמית של מיטת ההדפסה.
    2. בתפריט הבקרה הראשי, בחר תפריט כלי עזר ולאחר מכן בחר הזז ציר. הזז את ראשי ההדפסה במרווחים של 1 מ"מ לאורך צירי x ו- y עד שזרבובית ההדפסה הביולוגית החרוטית של PH1 נמצאת ישירות מעל הנקודה המסומנת תחת באר D1. במידת הצורך, כוונן את המיקום של זרבובית הביו-הדפסה החרוטית מעל הנקודה על-ידי הזזת ראשי ההדפסה במרווחים של 0.1 מ"מ.
    3. הקלט את קואורדינטות x ו- y של זרבובית הביו-הדפסה החרוטית כאשר ישירות מעל מרכז הבאר D1, כפי שצוין במסך לוח הבקרה של הביו-הדפסה תלת-ממדית.
      הערה: במקרה של ביו-הדפסה תלת-ממדית INKREDIBLE+ המשמש כאן, הקואורדינטות x ו- y הן כדלקמן: x : -46.5 ו - y : -27.5. קואורדינטות אלה משמשות כנקודת המוצא במרכז ה-D1 של באר להדפסה ביולוגית בצלחת של 24 בארות.
    4. לאחר מכן, הרימו את המודפס במרווחים של 1 מ"מ עד שהתחתית של הבאר D1 כמעט נוגעת בזרבובית הביו-הדפסה החרוטית המותקנת בראש ההדפסה 1. כוונן את תנועת המודפס במרווחים של 0.1 מ"מ במידת הצורך (איור 5A(ii)). לאחר מכן, מתפריט כלי שירות, בחר באפשרות כיול ציר Z ובחר ואשר עוד יותר את האפשרות כיול STORE Z .
    5. חזור לתפריט הראשי ובחר באפשרותכן ביו-הדפסה . גלול מטה ובחר באפשרות CALIBRATE Z .
      הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד תוריד כעת את המודפסת לאחר ביצוע מוצלח של כיול ציר z (איור 5A(iii)).
  6. מעדכן קובץ G-code של לוחית 24-well עם קואורדינטות נקודת התחלה נכונות
    1. פתח את קובץ הקוד הגיאומטרי (G-code) שסופק בתוכנת הביו-הדפסה (קובץ משלים 1).
      הערה: קובץ G-code זה, בעל 24 בארות, מקודד את ההדפסה של מבנים רב-שכבתיים בני 5 x 5 x 1 מ"מ בכל באר (איור 5C(i),(iii)). ניתן להשתמש בקבצי קוד G שסופקו עם כל תוכנת הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
    2. שים לב כי שורה 1 של קובץ G-code קורא G0 X-50.0 Y-33.5 ; מיקום מרכזי של D1 היטב. עדכן את קואורדינטות x ו- y בשורה 1 עם הערכים שהושגו בשלב 4.5.3, כלומר, שורה 1 צריכה לקרוא כעת G0 X-46.5 Y-27.5 ; מיקום מרכזי של D1 היטב. שמור את הקובץ תחת שם חדש.
      הערה: הליך זה משמש לכיול קובץ קוד ה- G כך שההדפסה תתחיל במרכז באר D1 בהתבסס על הקואורדינטות x,y של הביו-הדפסה התלת-ממדית הספציפית הנמצאת בשימוש. גישה זו יכולה לשמש לכיול קובץ 24-צלחת G-קוד להדפסה עם כל שחול ביו-הדפסה תלת-ממדית. לצורך מחקר זה, רק המחצית השמאלית של צלחת 24-well, כלומר, בארות A1-3, B1-3, C1-3, ו- D1-3 הודפסו. קובץ G-code נפרד המקודד הדפסה של מבנים רב-שכבתיים בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ ברשת 3 x 4 מסופק גם הוא (קובץ משלים 2, איור 5C(ii)).
  7. התאמת לחץ שחול עבור Printhead 1 (PH1)
    1. ודא שהמשאבה הפנאומטית מחוברת היטב ליציאת צריכת האוויר האחורית של הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ והדליק את המשאבה הפנאומטית.
    2. שלף את ידית הבקרה הקדמית הממוקמת בצד ימין של הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ 3D.
      הערה: ידית הבקרה הקדמית מתאימה את הלחץ ל- PH1, בעוד ידית השליטה האחורית מתאימה את הלחץ ל- PH2.
    3. שים לב למדי הלחץ הדיגיטליים עבור PH1 ו- PH2 הממוקמים בחזית הביו-הדפסה כל אחד לקרוא קרוב ל 0 kPa. סובבו באיטיות את ידית הבקרה הקדמית בכיוון השעון עד שהלחץ המצוין במד השמאלי של PH1 יגיע ל-12 kPa (איור 5A(iii)).
    4. מניחים נייר טישו מקופל או חתיכת סרט איטום עמיד למים מתחת לזרבובית ההדפסה של המחסנית המותקנת, ונזהרים שלא לגעת בזרבובית ההדפסה.
    5. מתפריט הבקרה הראשי בהדפסה הביולוגית תלת-ממדית, בחרו 'הכינו ביו-הדפסה'.
    6. נווט אל ההפעלה של PH1 ובחרו בו. שים לב שהדיו הביו-חומריםי מתחיל להלל מהזרבובית. במידת הצורך, להגביר את לחץ השחול על ידי סיבוב ידית הבקרה בכיוון השעון עד הדיו biomaterial הוא בלם חוט רציף, ולתעד את הגדרת הלחץ החדשה. עבוד במהירות כדי להימנע מבזבוז דיו ביו-חומרי.
    7. בחר בטל את PH1 כדי להפסיק את שחול הדיו הביו-חומריםי, להסיר את נייר הטישו או את הסרט המכיל את הדיו הביו-חומרים המובלט ממיטת ההדפסה ולסגור את דלת הביו-הדפסה.
      הערה: הביו-הדפסה התלת-ממדית תדליק באופן אוטומטי את אספקת לחץ האוויר ל-PH1 במהלך ההדפסה בהתאם להוראות קובץ הקוד G.
  8. ביו-הדפסה תלת-ממדית של מצעים הידרוג'לים רקטלינאריים בפורמט צלחת של 24 באר
    1. מתפריט הבקרה הראשי בהדפסה הביולוגית תלת-ממדית, בחר תפריט כלי עזר. נווט אל הדפסה SD ותבחר, אשר יאפשר לתוכנת הביו-הדפסה לשדר קבצי קוד G להדפסה של ביו-הדפסה תלת-ממדית.
    2. לחץ על כפתור LOAD בתוכנת הביו-הדפסה ובחר את קובץ קוד G המעודכן של לוחית 24 טוב שנשמר בשלב 4.6.2.
    3. בלוח הבקרה הימני בתוכנה, בחר בכרטיסיה הצגה לפני הדפסה ולחץ על לחצן PRINT כדי להתחיל בהדפסה ביולוגית ב- D1.
      הערה: אם משתמשים בקובץ קוד G של לוחית ה-G של רשת 3 x 4, ההדפסה הביולוגית תסתיים היטב A3 של הלוח בן 24 הבאר (איור 5C(ii),D), בניגוד ל-A6 אם מודפסת צלחת מלאה של 24 בארות.
    4. עם השלמת הדפסה ביולוגית של המבנים המשעשעים, לכסות את צלחת 24 באר עם המכסה שלה ולהעביר אותו לארון בטיחות ביולוגית Class II.
    5. יש לטבול כל מבנה רקטלינארי בשתי טיפות של תמיסת CaCl2 סטרילית של 50 מ"מ (איור 5B(ii)), ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      הערה: זה משמש כדי לחצות באופן יוני את שרשראות הפולימר אלגינט עם יונים Ca2 + ולאפשר מבנים רקטלינאריים לשמור על השלמות המבנית שלהם.
    6. שאפו בזהירות את תמיסת CaCl2 מכל מבנה, ושטפו פעם אחת במ"ל אחד של PBS 1x (pH 7.4) כדי להסיר עודף CaCl2 (איור 5D).
    7. כדי למנוע התייבשות של מבני ההידרוג'ל המודפסים ביו-מודפסים, שמרו על המבנים המתרוקנים המודפסים בהדפסה ביולוגית בתלת-ממד ב-PBS 1x טרי עד שה-BMMCs יהיו מוכנים לזרעים על המבנים (איור 5D).

5. דגירה של BMMCs על פיגומים רקטלינאריים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית ובדיקת כדאיות

  1. דגירה של BMMCs על פיגומי הידרוג'ל רקטלינאריים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית
    1. עליקות זרעים של BMMCs על הפיגומים הרקטיניים המודפסים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית במשולש במשך ארבעה משכי זמן שונים, למשל, 6, 18, 24 ו-48 שעות, כך שכל הטיפולים מסתיימים בו זמנית. השתמש ב- BMMCs שנזרעו לבארות ריקות במשולש עבור אותם משכי זמן כמו פקדים שאינם מטופלים.
    2. מעבירים באופן אספטי BMMCs מבקבוק תרבות T175 cm2 לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, ומעבירים את ה- BMMCs ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. יש להעריך מחדש את הכדור ב-50 מ"ל של מדיום RPMI מלא טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל של IL-3, וחשב את צפיפות התאים החיים על-ידי ספירת עליקוט של BMMCs מוכתמים בכחול טריפאן באמצעות המציטומטר.
    4. בהתבסס על צפיפות התא המחושבת בשלב 5.1.3, הכן aliquot 6 מ"ל של השעיית BMMC בצפיפות סופית של 1 × 106 תאים / מ"ל.
    5. עבור הגדרת הדגירה 48 שעות, שאפו PBS מבארות A1-3 המכילים את פיגומי הידרוג'ל רקטליניאריים מודפסים 3D, ופיפטה 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים / מ"ל) השעיה לתוך כל באר. כמו כן, פיפטה 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים / מ"ל) השעיה לתוך בארות A4-6 ללא מבנים מודפסים ביולוגית כדי לשמש בקרה לא מטופלת. לדגור את שאר בארות המכילות פיגומים ביו-מודפסים (B1-3, C1-3, D1-3) ב- RPMI ללא תוספים כדי למנוע התייבשות עד שיגיע הזמן המתאים לזרוע עם BMMC למשך הטיפול 24, 18 ו 6 שעות. מלא את הבארות ללא פיגומים מודפסים ביולוגית (B4-6, C4-6, D4-6) עם 1 מ"ל של PBS עד הזמן המתאים הוא הגיע לזרוע עם BMMCs עבור 24, 18, ו 6 שעות נקודות זמן.
    6. לדגור על צלחת 24-באר ב 37 °C (5° פחמן דו חמצני ) אטמוספרה לחה 5%.
    7. עבור הגדרת הדגירה של 24 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות B1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) מתלים לתוך בארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    8. עבור הגדרת הדגירה של 18 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות C1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) לבארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    9. עבור הגדרת הדגירה של 6 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות D1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) מתלים לתוך בארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    10. לסיום הדגירה, חלק דגימות מכל באר של צלחת 24-well עבור (i) PI כתמים וניתוח על ידי cytometry זרימה, (ii) XTT הכדאיות תא הבדיקה, ו (iii) LDH שחרור הבדיקה. לכן, להבטיח כי צלחת עגולה 96-באר ואת צינורות microfuge 1.5 מ"ל הדרושים מסומנים הרבה לפני נקודת הקצה של הדגירה.
  2. דגימת תאים לבדיקה מטבולית של XTT
    1. תדפיסו מחדש את ה-BMMCs במדיום התרבותי בתוך כל באר, תוך נזהרת שלא לפגוע ולפרק את פיגומי ההידרוג'ל המודפסים בתלת-ממד.
    2. העברה אספטית 40 μL של השעיית BMMC הומוגני מכל באר צינורות מיקרופוגה סטריליים 1.5 מ"ל המכילים 760 μL של מדיום RPMI מלא טרי (נפח סופי = 800 μL), ומערבולת לזמן קצר לערבב.
    3. יש לחלק 100 מיקרו-אל של מתליות BMMC מדוללות במשולש ללוח מיקרו-תיימר שטוח בעל 96 בארות המתאימה למדידות ספיגה (ראו טבלת החומרים) בספקטרופוטומטר מיקרו-פלט.
    4. חלק 50 μL של פתרון עבודה XTT לכל באר המכילה את ההשעיה של תא BMMC באמצעות מיקרופיפט רב ערוצי.
      הערה: הכן פתרון עבודה XTT על ידי ערבוב 5 מ"ל של ריאגנט XTT עם 100 μL של ריאגנט צימוד אלקטרונים. להפשיר רכיבים אלה מ -20 °C (50 °F) באמבט מים 37 °C (37 °F) מיד לפני השימוש.
    5. לדגור על צלחת 96-well ב 37 °C (5°F) באטמוספירה 5% CO2 לח במשך 24 שעות.
    6. בסוף הדגירה, להסיר את צלחת 96-באר מן האינקובטור ולאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. רשומות ערכי ספיגה על ספקטרופוטומטר מיקרו-לוח ב 450 ננומטר עם חיסור רקע ב 650 ננומטר.
  3. דגימה על-טבעית לבדיקת להידרוגנאז לקטט (LDH)
    1. העבר את ההשעיות BMMC הנותרות (960 μL) מכל באר של צלחת 24-well לצינורות microfuge, וכדור התאים ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. Pipette שלושה 100 aliquots μL של תרבית התא supernatant מכל צינור microfuge לתוך צלחת 96-well microtiter שטוח תחתון. השלך את שאריות supernatants מכל צינור microfuge, ולשמור על כדורי BMMC להכתמת נוסף עם PI בסעיפים 5.4.1-5.4.8.
    3. Pipette 50 μL של פתרון העבודה LDH לתוך כל 100 μL aliquot של supernatant.
      הערה: עיין בקובץ משלים 3 להכנת ריאגנטים לבדיקת LDH.
    4. דגירה במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר.
    5. פיפטה 50 μL של 1 M חומצה אצטית לכל באר כדי לעצור את התגובה.
    6. רשומות ערכי ספיגה על ספקטרופוטומטר מיקרו-לוח ב 490 ננומטר עם חיסור רקע ב 680 ננומטר.
  4. ניתוח ציטומטרי זרימה של הכדאיות BMMC באמצעות אי הכללת פרופידיום יודיד (PI)
    1. resuspend כדורי BMMC במאגר לשטוף זרימה (PBS [pH 7.4] המכיל 0.5% w / v BSA), וכדור התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. חזור על שלב הכביסה עם חוצץ שטיפת זרימה פעם נוספת.
    3. יש תנצל מחדש כל גלולה BMMC ב-400 מיקרו-אל של מאגר שטיפת זרימה.
      הערה: יהיו 24 דגימות BMMC resuspended בסך הכל: 12 דגימות BMMC דגירה על מצעים הידרוג'ל מודפס ביו-מודפס (4 נקודות זמן משולש) ו 12 דגימות BMMC דגירה בבארות ללא מבנים מודפסים ביולוגית (4 נקודות זמן משולש).
    4. בצלחת מיקרוטיטר 96-באר עגולה, pipette 20 μL של חוצץ לשטוף זרימה לתוך בארות A1-12 ו - B1-12. באותה צלחת microtiter, pipette 20 μL של פתרון כתמי PI 10x (100 מיקרוגרם / מ"ל PI במאגר לשטוף זרימה) לתוך בארות C1-12 ו - D1-12.
    5. מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המודגרות על מצעים הידרוג'ל מודפסים ביולוגית לבארות A1-12 (מדגם אחד לבאר). יש לחלק 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המוגררות ללא מצעים הידרוג'ל מודפסים ביולוגית לבארות B1-12 (דגימה אחת לבאר). השתמש בדגימות BMMC שניתנו לבארות A1-12 ו- B1-12 כפקדים לא נגועים עבור כל מצב טיפול (24 פקדים בסך הכל).
    6. מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המודגרות על מבנים מודפסים ביולוגית לבארות C1-12 (מדגם אחד לבאר). מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC דגירה ללא מבנים מודפסים ביולוגית לתוך בארות D1-12 (מדגם אחד לבאר).
      הערה: דגימות BMMC בבארות C1-12 ו- D1-12 יוכתמו בריכוז PI יעיל סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל (24 דגימות מוכתמות בסך הכל).
    7. לדגור על הצלחת במשך שעה אחת ב 4 °C (75 °F) או 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    8. בסוף תקופת הדגירה, לנתח את הדגימות ישירות מצלחת microtiter על cytometer זרימה כפי שתואר בעבר תחת סעיף 3.1.

תוצאות

אחד המאפיינים המכריעים ביותר של דיו ביו-חומרים מוצלח או מצע תרבות הוא זה של תאימות ביולוגית. בראש ובראשונה, אסור שהמצע יזום מוות תאי. ישנן מספר שיטות ציטומטריות מבוססות מיקרוטיטר וזרימה לכימות הכדאיות של התא ונמק; עם זאת, שיטות אלה אינן מקובלות על ניתוח תאים המוטמעים בתוך מטריצת הידרוג'ל. ב...

Discussion

ייצור של רקמות ביו-מימטיות תלת-ממדיות דורש מיזוג מוצלח של הביו-וינק, המחקה רכיבים של המטריצה החוץ-תאית, עם הרכיבים התאיים ליצירת אנלוגים פיזיולוגיים של רקמות ויוו . זה מחייב שימוש בתאים ראשוניים, ולא תאים שעברו טרנספורמציה, בעת ייצור רקמות ביו-מימטיות פיזיולוגיות. תאים אימונולוגיים ר?...

Disclosures

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר קנדה ואלברטה Innovates.

Acknowledgements

אנו מודים לאלברטה אינחדשס על שסיפקה ל- CNC וקן האריס וג'ה-יאנג צ'ו על העצה הטכנית שלהם בעת הכנת מטריצת CNC / אגרוז / D-מניטול. אנו מודים גם לבן הופמן, הת'ר וינצ'ל וניקול דיאמנטידס על הייעוץ הטכני והתמיכה שלהם עם ההתקנה וכיול הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A
Acetic Acid (glacial)Sigma AldrichAX0074-6
Agarose (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-MercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)BD309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 inBD305111
BioLite 24 Well MultidishThermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Well MultidishThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 cm2 Flask VentedThermo Fisher Scientific130-191
Biosafety Cabinet Class IIMicrozone Corp., CanadaBK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
C
C57BL/6 miceThe Jackson Laboratory000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)CELLINK LLCIK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mLCELLINK LLCCL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip CapsCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare for PCCELLINK LLCVersion 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTERCELLINK LLCS-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22GCELLINK LLCNZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25GCELLINK LLCNZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27GCELLINK LLCNZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)Sigma Aldrich11465015001
Centrifuge (Benchtop)Eppendorf5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS MicroplateSigma AldrichCLS3370
CO2 IncubatorBinder GmbH, Germany9040-0113
CytoFLEX Flow CytometerBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, SterileCorning352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivatedThermo Fisher Scientific12484028
FlowJo SoftwareBecton Dickinson & Co. USAVersion 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)VWR15170-208
HEPES Sodium SaltFisher ScientificBP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
Lithium L-lactateSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)Sigma AldrichM8640
Microtubes (1.7 mL clear)AxygenMCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)Thermo Fisher Scientific566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12-4031-82
Recombinant Murine IL-3PeproTech, Inc. 213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)GE HealthcareSH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)Fisher ScientificNC9913213
Sodium Azide, 500 gFisher ScientificBP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)Thermo Fisher Scientific11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)Sigma Aldrich252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)Sigma Aldrich93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)Thermo Fisher ScientificVLBL00D0

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved