Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن نصف مراحل جمع العينات وإعداد لريبو-seq في البكتيريا. ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا لهذه المبادئ التوجيهية إلى بيانات كافية لإجراء تحليل معلوماتي حيوي شامل. البروتوكول الذي نقدمه بسيط، ويستخدم معدات مختبرية قياسية ويستغرق سبعة أيام من التحلل إلى الحصول على المكتبات.

Abstract

تقنية التنميط الريبوسوم (RIBO-seq) هي حاليا الأداة الأكثر فعالية لدراسة عملية تخليق البروتين في الجسم الحي. ميزة هذه الطريقة، بالمقارنة مع النهج الأخرى، هي قدرتها على رصد الترجمة عن طريق رسم خرائط دقيقة لموقف وعدد من الريبوسومات على نسخة مرنا.

في هذه المقالة، نقوم بوصف المراحل المتتالية لجمع العينات وإعداد طريقة ريبو-سيك في البكتيريا، مع تسليط الضوء على التفاصيل ذات الصلة بتخطيط وتنفيذ التجربة.

وبما أن ريبو-سيك يعتمد على الريبوسومات السليمة والرنانات المرتبطة بها، فإن الخطوة الرئيسية هي التثبيط السريع للترجمة والتفكك الكافي للخلايا. وبالتالي، نقترح الترشيح وتجميد فلاش في النيتروجين السائل لحصاد الخلايا مع المعالجة المسبقة اختياري مع الكلورامفينيكول لوقف الترجمة في البكتيريا. للتفكك، نقترح طحن الخلايا المجمدة مع هاون والحشرات في وجود أكسيد الألومنيوم لتعطيل ميكانيكيا جدار الخلية. في هذا البروتوكول، لا يلزم وسادة السكروز أو جهاز طرد فائق الانحدار السكروز لتنقية أحادية. بدلا من ذلك، يتم تطبيق فصل مرنا باستخدام البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE) تليها استئصال بصمة ريبوسومال (28-30 NT الفرقة) ويوفر نتائج مرضية. هذا يبسط إلى حد كبير الأسلوب وكذلك يقلل من الوقت ومتطلبات المعدات لهذا الإجراء. لإعداد المكتبة، نوصي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي الصغيرة المتاحة تجاريا لتسلسل Illumina من نيو إنجلاند Biolabs، باتباع إرشادات الشركة المصنعة مع درجة ما من التحسين.

مكتبات cDNA الناتجة تقدم الكمية والنوعية المناسبة المطلوبة لتسلسل الجيل التالي (NGS). ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا لنتائج البروتوكول الموصوف إلى أن يقرأ 2 إلى 10 ملايين من الملونات التي تم تعيينها بشكل فريد لكل عينة، مما يوفر بيانات كافية للتحليل المعلوماتي الحيوي الشامل. البروتوكول الذي نقدمه سريع وسهل نسبيا ويمكن تنفيذه بمعدات مختبرية قياسية.

Introduction

تم تطوير تقنية التنميط الريبوسوم (RIBO-seq) في مختبر جوناثان ويسمان في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو1. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة لدراسة التعبير الجيني على المستوى الترجمي ، يركز RIBO-seq على كل ربط ريبوسوم ل mRNA ويوفر معلومات حول موقعه والعدد النسبي للريبوسومات على نسخة. أنها تمكن من رصد عملية تخليق البروتين في الجسم الحي، ويمكن أن توفر دقة كودون واحد ودقة السماح لقياس كثافة الريبوسوم على حد سواء، مرنا الفردية وعلى طول النسخ الكامل في الخلية. في الأساس لتقنية ريبو-seq يكمن حقيقة أنه أثناء الترجمة يربط ريبوسوم جزيء مرنا وبالتالي يحمي جزء مدفون من النص من عملية الهضم ريبونوكليز. عند إضافة ريبونوكليز، يتم هضم الحمض النووي الريبي غير المحمي وتظل الشظايا المغلقة بالريبوسومات - التي يبلغ طولها عادة ~ 28-30 nt - سليمة. ويمكن بعد ذلك عزل هذه الشظايا، التي تسمى آثار أقدام ريبوسومية (RF)، وتسلسلها ورسم خرائط لها على النص الذي نشأت عنه مما أدى إلى الكشف عن الموضع الدقيق للريبوسومات. في الواقع، وقد استخدمت القدرة على حماية ريبوسوم شظايا مرنا منذ 1960s لدراسة الربط ribosomal ومواقع بدء الترجمة (TIS)2،3،4. ومع ذلك ، مع التقدم في تكنولوجيا التسلسل العميق ، أصبح RIBO-seq معيارا ذهبيا لرصد الترجمة5 ، والذي ، من خلال المشاركة الريبوسومية ، يمكن أن يوفر معلومات على نطاق الجينوم حول تخليق البروتين6. ريبوسوم التنميط سد الفجوة التكنولوجية التي كانت موجودة بين تحديد النسخ والبروتيوم6.

لإجراء التنميط ريبوسوم نحن بحاجة للحصول على lysate الخلية من الكائن الحي الذي نما في ظل الظروف التي تم التحقيق فيها. قد يؤدي تعطيل هذه الظروف أثناء جمع الخلايا وتحللها إلى توفير بيانات غير موثوقة. لمنع ذلك ، يتم استخدام مثبطات الترجمة والحصاد السريع وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل. يمكن أن يتم التحلل الخلايا بواسطة طحن المبردة في التجانس الميكانيكية مثل مطحنة خلاط7،8 أو خافق حبة9، والتحوير من خلال ماصة10 أو مع إبرة11. يمكن إضافة المخزن المؤقت للتحلل قبل أو بعد وقت قصير من سحق الخلايا. في بروتوكولنا نستخدم النيتروجين السائل لقذائف الهاون والحشرات ، وكذلك أكسيد الألومنيوم كنهج ألطف لتعطيل جدار الخلية البكتيرية ، والذي يمنع قص الحمض النووي الريبي الذي غالبا ما يواجه عندما يتم تطبيق طرق مثل السونيشن. بعد السحق ، نضيف عازل تحلل بارد الجليد إلى المحتويات المبردة من قذائف الهاون. اختيار العازلة تحلل المناسبة مهم للحصول على أفضل قرار من آثار أقدام ريبوسومات. منذ قوة الأيونية يؤثر على كل من حجم RF ودقة إطار القراءة، فمن المستحسن حاليا لاستخدام المخازن المؤقتة تحلل مع قوة أيونية منخفضة والقدرة العازلة، حتى لو كان يبدو أن تكوين العازلة لا يؤثر على إشغال ريبوسومات على mRNAs11،12. المكونات الهامة للحاجز التحلل هي أيونات المغنيسيوم ، ووجود الذي يمنع تفكك الوحدات الفرعية ريبوسوم ويمنع التغيرات تشكيلية عفوية في ريبوسوماتالبكتيرية 11،13. أيونات الكالسيوم تلعب أيضا دورا هاما وضرورية لنشاط النيوكليز ميكروكوكال (MNase) المستخدمة في التنميط الريبوسوم البكتيرية طريقة14. إضافة جوانوسين 5′-[β,γ-imido]ثلاثي الفوسفات (GMP-PNP), التناظرية غير قابلة للتحلل من GTP, جنبا إلى جنب مع الكلورامفينيكول يمنع الترجمة خلال تحلل15.

عندما يتم الحصول على lysate، يتم توضيحه عن طريق الطرد المركزي وتقسيمها إلى قسمين، كل لريبو-seq وعالية الإنتاجية مجموع تسلسل مرنا (RNA-seq) لأنها تتم في وقت واحد(الشكل 1). يوفر RNA-seq نقطة مرجعية تمكن من مقارنة البيانات من كل من RIBO-seq و RNA-seq أثناء تحليل البيانات. يتم تعريف المترجم التحقيق من خلال تطبيع آثار أقدام ريبوسومات إلى وفرة مرنا16. يمكن أن تساعد البيانات من RNA-seq أيضا في تحديد الاستنساخ أو تسلسل القطع الأثرية17.

figure-introduction-3970
الشكل 1. تخطيطات إعداد عينة مرنا لريبو-seq و RNA-seq. لإعداد مكتبة ريبو-seq، يتم هضم الحمض النووي الريبي مع MNase (A)، تليها اختيار حجم RF من ~ 28-30 NT طول (B)؛ لرنا-seq يتم عزل (C)، استنفدت من rRNA (D)، ويتم تجزئة الحمض النووي الريبي الناتج عشوائيا إلى شظايا من أطوال متفاوتة (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخطوات الأولية لإجراء إعداد عينة لريبو-seq و RNA-seq تختلف قليلا (الشكل 1). بالنسبة للتنميط الريبوسومي ، يحتاج الليسات إلى هضمه بواسطة إندونوكليز محدد لإضعاف جزيئات الحمض النووي الريبي غير المحمية بالريبوسومات. في البروتوكولات القياسية، يتم استرداد أحادية الحصول عليها عن طريق جهاز الطرد الفائق وسادة السكروز أو الطارد الفائق الانحدار السكروز8،14. في هذه المقالة، ونحن نظهر أن هذه الخطوة ليست ضرورية لعزل RF المطلوبة لريبو-seq في البكتيريا، وبالمثل للخلايا eukaryotic18،وأن اختيار حجم شظايا مرنا طول المناسبة من هلام البولي أكريلاميد كافية.

بالنسبة ل RNA-seq ، يتم الحصول على مرنا عن طريق استنفاد الحمض النووي الريبي من إجمالي الحمض النووي الريبي - جزيئات rRNA تهجين إلى مسابير أوليغونوكليوتيد البيوتينية التي ترتبط بالخرز المغناطيسي المغلف بالستريبتافيدين. ثم تتم إزالة مجمعات rRNA-oligonucleotide-حبة من العينة مع مغناطيس مما أدى إلى rRNA المنضب عينة19،20. ثم يتم تجزئة جزيئات الحمض النووي الريبي المنقى عشوائيا بواسطة التحلل المائي القلوية. يتم تحويل الأجزاء التي تم الحصول عليها من مرنا وكذلك آثار أقدام ريبوسومات إلى مكتبات cDNA وإعدادها لتسلسل عميق(الشكل 2). وهذا ينطوي على إصلاح ينتهي اللازمة بعد التحلل المائي القلوية (لرنا) والهضم الأنزيمي (لRF): dephosphorylation من 3 'ينتهي تليها الفوسفور من نهايات 5'. الخطوات التالية هي ربط المحولات والنسخ العكسي لإنشاء إدراجات cDNA مؤطرة بتسلسل مطلوب لتسلسل الجيل التالي (NGS) باستخدام منصة Illumina. المرحلة الأخيرة من إعداد المكتبة هي رد فعل PCR حيث يتم تضخيم البنى ووضع علامات عليها مع عينة من الباركود المحدد للسماح بتعدد وتسلسل عينات مختلفة على قناة واحدة. قبل التسلسل، يتم تقييم جودة وكمية المكتبات من خلال الحمض النووي عالي الحساسية على رقاقة الكهربائي. يمكن بعد ذلك تجميع مكتبات cDNA ذات المعلمات المناسبة وتسلسلها. يمكن إجراء التسلسل على منصات Illumina مختلفة، مثل MiSeq، NextSeq أو HighSeq، اعتمادا على عدد المكتبات، وطول القراءة المطلوبة وعمق التسلسل. بعد التسلسل، يتم إجراء التحليل المعلوماتي الحيوي.

figure-introduction-6705
الشكل 2. إعداد المكتبة. يتضمن إعداد المكتبة إصلاح النهايات وربط المحولات والنسخ العكسي والتضخيم باستخدام ترميز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التنميط ريبوسوم هو أسلوب عالمي التي يمكن تعديلها بسهولة وتعديلها وفقا للمسألة العلمية. في الأصل كان يستخدم في الخميرة1، ولكن بعد فترة وجيزة تم تطبيقه على الخلايا البكتيرية21 وكذلك الكائنات الحية نموذج eukaryotic بما في ذلك الماوس10، حمار وحشي22، ذبابة الفاكهة23 و Arabidopsis thaliana24. كما تم استخدامه لدراسة أنواع مختلفة من الريبوسوم: السيتوبلازمية، الميتوكوندريا25،26 وكلوروبلاست27،28. في eukaryotes RIBO-seq عادة ما يتم تكييفها وصقلها للتحقيق في جوانب محددة من الترجمة، بما في ذلك بدء10،11،29،30،31،32، استطالة1،10،11،31،33، ريبوسوم المماطلة33 وتغيير تشكيل33. معظم التعديلات تنطوي على استخدام مثبطات الترجمة المختلفة. في البكتيريا ومع ذلك، كانت الدراسات المماثلة من الصعب إجراء بسبب ندرة مثبطات مع الآلية المطلوبة للعمل34. مثبط الترجمة الأكثر استخداما في البكتيريا هو الكلورامفينيكول (CAM) الذي يرتبط بمركز نقل بيبتيديل (PTC) ويمنع تحديد المواقع الصحيحة لل AMINOACYL-tRNA في الموقع A. ونتيجة لذلك، يمنع CAM تشكيل رابطة الببتيد مما يؤدي إلى اعتقال ريبوسومات ممدود35. أمثلة أخرى من مثبطات الترجمة في البكتيريا هي التتراسيكلين (TET)36، retapamulin (RET)34 و Onc11237 التي استخدمت للتحقيق في مواقع بدء الترجمة. TET، الذي يمنع تسليم الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم عن طريق التداخل المباشر مع حلقة الجذعية anticodon من tRNA في الموقع A، تم تطبيقها أصلا للتحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من العلاج CAM لأنها على حد سواء المضادات الحيوية تثبيط ترجمة استطالة38. تم العثور على TET للكشف عن الأولية، ولكن لم يتمكن من الكشف عن TIS36الداخلية. يربط RET في PTC من الريبوسوم البكتيري ، ويمنع تكوين أول رابطة الببتيد عن طريق التدخل في استطالة أميناسيل -tRNA في الموقع A. تطبيق نتائج RET في اعتقال الريبوسومات في كل من الابتدائية وكذلك الداخلية TISS34. Onc112، ببتيد مضاد للميكروبات غني بالبرولين، يربط في نفق الخروج ويمنع ربط أمينواسيل-ترنا في موقع ريبوسومال A. ونتيجة لذلك، يمنع Onc112 مجمعات البدء من دخول مرحلة الاستطالة37.

المعلومات الرئيسية التنميط ريبوسوم يوفر هو كثافة الريبوسومات وموقفها على مرنا. تم تطبيقه بنجاح للتحقيق في التعبير الجيني التفاضلي على مستوى الترجمة في ظروف النمو المختلفة1،6، قياس الكفاءة الترجمية1،38،39 والكشف عن أحداث تنظيم الترجمة مثل التوقف الريبوسومي10. RIBO-seq يسمح أيضا للكشف عن ترجمة ncRNA المشروح، pseudogenes وإطارات القراءة المفتوحة الصغيرة غير معطاة (ORF) مما يؤدي إلى تحديد الجينات الرواية و / أو قصيرة جدا البروتين الترميز10،12،22،30،37. في مثل هذه الحالات، يمكن RIBO-seq صقل وتحسين التعليقات التوضيحية الجينوم. مع حساسيته العالية لتحديد ORFs المترجمة وطبيعتها الكمية ، يمكن أن يكون التنميط الريبوسوم أيضا بمثابة وكيل لتحديد البروتيوم أو في مساعدة دراسات البروتيوميات31،34،39. عن طريق رسم خرائط TIS، التنميط ريبوسوم يكشف N-ميؤوس منها isoforms الموسعة والمقتطعة من البروتينات المعروفة10،32. كما تم تكييف RIBO-seq لدراسة الطي المترجم المشترك للبروتينات14و21و24. تمكن هذه الطريقة من قياس معدلات الاستطالة1،10،39 أو فك سرعة codons الفردية6 وتساعد في تطوير نماذج كمية للترجمة17. طريقة التنميط ريبوسوم هي أيضا قادرة على توفير رؤى ميكانيكية في التوقف ريبوسوم في البكتيريا7،15،17، frameshifting40، وقف كودون قراءة21، إنهاء / إعادة تدوير العيوب41،42 وتشكيل ريبوسومات التغييرات33 في eukaryotes. كما تم تكييف RIBO-seq لدراسة تأثير عوامل محددة عبر المفعول على الترجمة مثلميرناس 6 والبروتينات الرابطة للجيش الملكي النيبالي في eukaryotes16،43. ومع ذلك، من المهم أن نعترف بأن التصميم التجريبي والقرار الذي تم الحصول عليه من ريبو-seq تحديد كمية المعلومات التي يمكن استخلاصها من البيانات الناتجة التسلسل12.

Protocol

1. جمع العينات

  1. إعداد ثقافة بكتيرية. نوصي بمستوى ثقافة 100 مل لكل عينة.
  2. إعداد المعدات والكواشف لجمع العينات: ملعقتان لكل عينة، معقمة 0.45 ميكرومتر غشاء استرات السليلوز المختلط (MCE) مرشحات، 50 مل أنابيب معقمة، النيتروجين السائل، 50 ملغم/ مل كلورامينيكول في 70٪ (فول / فول) الإيثانول (اختياري). ثقب غطاء أنابيب 50 مل للسماح بتبخر النيتروجين السائل ومنع انفجار أنابيب مغلقة. إزالة التلوث من المجارف مع المنظفات المختبرية والإيثانول 70٪.
  3. قبل الحرب معدات التصفية واحدة من scoopulas إلى درجة حرارة النمو للثقافة البكتيرية.
    ملاحظة: نوصي جهاز الترشيح جميع الزجاج مع قمع، قاعدة fritted، قارورة مفصل الأرض ومشبك الربيع 47 ملم Ø.
  4. قبل حصاد العينة، أضف الكلورامفينيكول إلى الثقافة البكتيرية إلى التركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل واحتضان 1 دقيقة (اختياري).
  5. صب النيتروجين السائل في أنبوب معقم 50 مل ووضع مغرفة الثانية داخل الأنبوب لتبرد.
    أنذر! النيتروجين السائل يمكن أن يسبب حاويات مغلقة لتنفجر بسبب تغير الضغط عند التبخر. لمنع ذلك ، من الضروري إنشاء بعض الثقوب في غطاء أنابيب 50 مل للسماح بتبخر النيتروجين السائل.
  6. جمع الخلايا عن طريق الترشيح. توقف عن التصفية عندما يمر الوسط عبر الغشاء ، ولكن لا تسمح للمرشح بالجفاف تماما.
  7. جمع الكريات البكتيرية عن طريق كشط بسرعة الخلايا من القرص تصفية باستخدام مغرفة prewarmed. ضع على الفور السكوبولا بأكملها مع الخلايا المحصودة في أنبوب 50 مل مملوء بالنيتروجين السائل. يجب تغطية بيليه حصادها بالكامل في النيتروجين السائل.
  8. السماح للبيليه تجميد جيدا وطرد الخلايا المجمدة باستخدام مغرفة الثانية المبردة سابقا. أغلق الغطاء المثقوب ونقل الأنبوب إلى -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تطهير المجارف بعد كل حصاد العينة.

2. تحلل الخلية

  1. إعداد 0.1 M GMP-PNP في 10 mM تريس درجة الحموضة 8، DNase I و 1.5 مل أنابيب رد الفعل لليسات والاحتفاظ بها على الجليد. تبريد الطرد المركزي إلى 4 °C.
  2. إعداد تحلل العازلة (20 mM TRIS pH 7.6، 10 m MgAcet، 150 M KAcet، 0.4٪ TRITON X-100، 6 مللي متر β ميركابتوثانول، 5 M CaCl2 واختياري 1 مللي متر كلورامينيكول). Aliquot 500 μL من العازلة تحلل لكل عينة في أنابيب رد فعل 1.5 مل ووضعها على الجليد.
  3. إزالة التلوث هاون والحشرات مع المنظفات المختبرية والإيثانول 70٪، وتجفيفها. هاون بارد والحشرات عن طريق صب النيتروجين السائل في قذائف الهاون.
  4. نقل بيليه المجمدة في هاون المبردة مسبقا وطحنها إلى مسحوق. مع ملعقة، إضافة ما يقرب من 1 حجم أكسيد الألومنيوم ومواصلة طحن. الحفاظ على هاون، والحشرات والخلايا باردة عن طريق صب النيتروجين السائل عند الحاجة، لا تدع محتويات هاون لذوبان.
  5. قبل استخدام العازلة تحلل، إضافة GMP-PNP و DNase I في تحلل العازلة aliquot إلى التركيز النهائي من 2 MM و 100 U/mL على التوالي. نقل الحل إلى هاون مع الخلايا وأكسيد الألومنيوم ومواصلة طحن. دع الذوبان في اللحوب يذوب ببطء أثناء طحن ونقل الخليط إلى أنبوب رد الفعل 1.5 مل المبرد مسبقا ووضعه على الفور على الجليد.
  6. lysates الطرد المركزي في 20 000 س غ لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. نقل المضادات العملاقة إلى أنابيب تفاعل جديدة مبردة مسبقا سعة 1,5 مل وإبقائها على الجليد.
  7. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في كل عينة مع NanoDrop. استخدام 1:10 تخفيف العينات و1:10 تخفيف العازلة تحلل في المياه الخالية من النيوكليز كما فارغة.
    ملاحظة: كن على علم بأن الكلورامفينيكول يظهر امتصاص كبير في 260 نانومتر.
  8. تقسيم كل lysate إلى قسمين: واحد لريبو-seq (0.5 - 1 ملغ من الحمض النووي الريبي) والثاني لRNA-seq (الباقي).
  9. تنظيف العينات لرنا-seq باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: نوصي باستخدام Zymo RNA Clean &؛ التركيز -25 عدة (انظر جدول المواد). نوصي أيضا بإضافة 4.5 كميات من الإيثانول (مقارنة بحجم العينة) إلى مزيج العينة وحاجز الربط لآثار أقدام الريبوسومات والحمض النووي الريبي المجزأ ، من أجل زيادة كفاءة تنقية شظايا الحمض النووي الريبي القصير.
  10. تخزين العينات المخصصة ل RNA-seq عند -80 درجة مئوية. وسيستمر إجراء الحمض النووي الريبي-seq من الخطوة 5.

3. MNase هضم عينات لريبو- seq

  1. إلى 1 ملغ من الحمض النووي الريبي إضافة 3.8 ميكرولتر من 187.5 U/μL MNase في 10 mM تريس درجة الحموضة 8 وأعلى مع تحلل العازلة إلى الحجم الإجمالي من 500 ميكرولتر.
  2. احتضان في 25 درجة مئوية، 300 دورة في الدقيقة، لمدة 45 دقيقة في الحرارية.
  3. تنظيف العينات مع مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (كما هو الحال في الخطوة 2.9).
  4. تخزين عينات لريبو-seq في -80 درجة مئوية (نقطة توقف) أو المضي قدما في تحديد الحجم.

4. البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (الصفحة) واختيار حجم العينات لريبو-seq

  1. إعداد هلام البولي أكريلاميد TBE 15٪ مع 8 M اليوريا ووضعه في خزان مع مخزن مؤقت TBE. قبل تشغيل لمدة 10 دقائق على الأقل في الجهد المستمر من 200 V.
  2. مزيج العينات مع TBE-اليوريا عينة المخزن المؤقت، denature في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ووضعها على الفور على الجليد.
  3. غسل اليوريا عن طريق حقن TBE العازلة في آبار هلام باستخدام حقنة. تحميل العينات ترك مسافة بئر واحدة بينهما لفصل كل عينة ومنع التلوث المتبادل. استخدام 29 nt أوليغونوكليوتيد ومزيج من 26 NT و 32 nt أوليغونوكليوتيدات كعلامات. تشغيل الكهربائي في الجهد المستمر من 180 V.
  4. إعداد العازلة العقيمة لاحتضان بين عشية وضحاها (5 mM EDTA، 10 mM NaOAc pH 5).
  5. بعد الكهربائي، وصمة عار الجل في حمام الذهب SYBR لمدة 2-3 دقائق وشطف هلام مع الماء الخالي من النيوكليز.
  6. أجزاء المكوس من هلام بين 26 و 32 NT مع الإبر العقيمة أو شفرات الحلاقة ووضع شظايا هلام في أنابيب منفصلة 1.5 مل لكل عينة. تغيير الإبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حضانة بين عشية وضحاها إلى كل أنبوب رد فعل.
  8. احتضان العينات في 10 درجة مئوية، 1000 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في thermomixer.
  9. في اليوم التالي، تنظيف العينات كما هو الحال في الخطوة 2.9. Elute آثار أقدام في 80 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
  10. تخزين العينات عند -80 درجة مئوية نقطة التوقف. وسيستمر إجراء RIBO-seq من الخطوة 7.

5. تنقية الحمض النووي الريبي البكتيري عن طريق استنفاد الحمض النووي الريبي من عينات لرنا-seq

  1. إزالة rRNA من العينات مع عدة تنقية مرنا البكتيرية (على سبيل المثال، Invitrogen MICROBExpress). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تنظيف العينات كما في الخطوة 2.9. Elute مرنا في 50 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
  3. تخزين عينات ل RNA-seq في -80 درجة مئوية (نقطة توقف) أو الاستمرار في تجزئة قلوية.

6. تجزئة القلوية من العينات لرنا-seq

  1. إعداد العازلة التحلل المائي القلوية (مزيج 220 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO3، 30 ميكرولتر من 0.1 M Na2CO3 و 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA). مزيج 1 حجم (50 ميكرولتر) من العازلة القلوية مع حجم واحد (50 ميكرولتر) من العينة واحتضان في 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من 3 M NaOAc درجة الحموضة 5.5 لوقف رد الفعل.
  3. تنظيف العينات كما هو الحال في الخطوة 2.9 وelute العينات في 80 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
  4. نقطة التوقف المحتملة: تخزين عينات RNA-seq عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك، نوصي بالذهاب مباشرة إلى الخطوة 7 من أجل تجنب التجميد والذوبان غير الضروريين.

7. إزالة الفوسفور والفوسفور من العينات لكل من الحمض النووي الريبي - وريبو - seq

  1. إضافة 10 ميكرولتر من 10x رد فعل العازلة PNK و 5 μL T4 PNK إلى كل عينة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة من أجل إزالة الفوسفوريات نهايات 3' .
  2. إضافة 3 ميكرولتر من 1 MM ATP واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة من أجل الفوسفور نهايات 5'.
  3. تنظيف العينات كما هو الحال في الخطوة 2.9، elute في 30 ميكرولتر مياه خالية من النيوكليز.
  4. تخزين العينات عند -80 درجة مئوية نقطة التوقف.

8. إعداد المكتبة باستخدام NEBNext Multix الصغيرة RNA مكتبة الإعدادية تعيين ل Illumina

  1. إعداد 100-1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المدخلات (شظايا مرنا التي تم الحصول عليها وآثار أقدام ريبوسومال) في 6 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز وإضافة 1 ميكرولتر من 3 'محول ريال. حضانة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 3 'الربط رد فعل العازلة (2X) و 3 ميكرولتر من 3 'ربط انزيم ميكس واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة، بدلا من 1 ساعة في 25 درجة مئوية كما يحدد بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. تهجين التمهيدي النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع برنامج معدل: 5 دقائق في 75 درجة مئوية، 30 دقيقة في 37 درجة مئوية وعقد في 4 درجة مئوية.
  4. ليجيت محول ريال 5' . اتبع بروتوكول الشركة المصنعة مع تغيير واحد: إجراء الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة، بدلا من ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.
  5. إجراء النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. نقطة التوقف المحتملة: احتضان العينات التي تحتوي على cDNAs مركبة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإبطال النسخ العكسي وتخزينها عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك، نوصي بالشروع مباشرة في الخطوات التالية لتجنب التجميد والذوبان غير الضروري للعينات.
  7. تخزين نصف كل مكتبة cDNA في -80 درجة مئوية كا نسخة احتياطية.
  8. إجراء تضخيم PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام نصف مزيج رد الفعل. تخزين المكتبات التي تم الحصول عليها عند -80 درجة مئوية STOP point.

9. تحديد حجم مكتبات cDNA باستخدام PAGE

  1. إعداد 6٪ هلام البولي أكريلاميد-TBE ووضعه في خزان مع مخزن مؤقت TBE. قبل تشغيل لمدة 10 دقائق على الأقل في الجهد المستمر من 200 V.
  2. خلط العينات مع هلام تحميل صبغ، الأزرق (6X) وتحميلها على هلام. استخدام سريع تحميل pBR322 الحمض النووي-MspI دايجست كسلم. في البداية، تشغيل الكهربائي في الجهد المستمر من 120 V للسماح الحمض النووي لدخول هلام ومن ثم تغيير الجهد إلى 180 V.
  3. عند الانتهاء من الكهربائي، وصمة عار الجل في حمام الذهب SYBR لمدة 2-3 دقائق وشطف هلام مع الماء الخالي من النيوكليز.
  4. أجزاء هلام المكوس التي تحتوي على المكتبات. لعينات RNA-seq المكوس بين 135-180 NT وريبو-seq بين 135-170 NT. استخدم إبرة معقمة أو شفرة حلاقة وضع شظايا الجل المقتطعة في أنابيب تفاعل منفصلة 1.5 مل. تذكر لتغيير إبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات.
    ملاحظة: المحولات والباركود من NEBNext Multix الصغيرة RNA مكتبة الإعدادية تعيين ل Illumina يكون 119 NT في المجموع الذي يحدد خفض ختان أقل.
  5. أضف 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز إلى كل جزء جل مقتطع.
  6. احتضان شظايا هلام في 10 درجة مئوية، 450 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في thermomixer.
  7. تنظيف وتركيز مكتبات cDNA مع مجموعة تنظيف الحمض النووي التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: نوصي باستخدام Zymo DNA Clean &؛ التركيز -5 عدة (انظر جدول المواد).
  8. تخزين مكتبات cDNA المنقى عند -80 درجة مئوية STOP point.

النتائج

تم الحصول على النتائج المثالية المعروضة هنا في دراسة تدرس تنظيم الترجمة في خلايا WT Bacillus الفرعية. تم تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD600 يساوي 0.1 في 100 مل من المتوسط الغني واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي حتى OD600 وصلت إلى 0.5-0.6. ثم تم استبدال الوسط الغني بالحد الأدنى ?...

Discussion

التحدي التقني الرئيسي للتنميط ريبوسوم هو الحاجة إلى منع الترجمة بسرعة من أجل التقاط لقطة من الريبوسومات على الحمض النووي الريبي في حالة فسيولوجية معينة من الاهتمام. ولتحقيق ذلك، تستخدم مثبطات الترجمة والحصاد السريع وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل بشكل شائع. تطبيق المضادات الحيوية اخ...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تود ALS الاعتراف بالدعم المالي لمنح تثبيت EMBO IG 3914 وPOIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 نفذت في إطار برنامج الفريق الأول لمؤسسة العلوم البولندية التي يشارك في تمويلها الاتحاد الأوروبي في إطار الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (powder)InvitrogenAM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pureAcros Organics125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)New England BiolabsP0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.Chempur114560600
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3881-500G
ChloramphenicolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnase I recombinant, Rnase-freeRoche4716728001
EDTA disodium saltFisher ScientificE/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.ABA6480111
Filtration apparatusVWR Collection511-0265all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrateSigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA&A Biotechnology040-500
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661-250G
MCE membrane fiterAlfatec TechnologyM47MCE45GWSpore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA PurificationInvitrogenAM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for IlluminaNew England BiolabsE7300S
Nuclease-Free WaterAmbionAM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Concentrator -25Zymo ResearchR1018
Sodium acetateSigma-AldrichS2889-250G
Sodium carbonateSigma-Aldrich223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stainLife TechnologiesS11494
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction BufferNew England BiolabsB0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Urea G.R.lach:ner40096-AP0

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. . . Babraham Bioinformatics. Fast QC. , (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, 678 (2019).
  49. Choi, J. . RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021)
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved