发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们描述了细菌中RIBO-seq样品收集和制备的阶段。根据这些准则对图书馆进行排序，可以获得足够的数据，以便进行全面的生物信息分析。我们目前的协议很简单，使用标准的实验室设备，从裂解到获得库需要七天时间。

摘要

核糖体分析技术（RIBO-seq）是目前研究 体内蛋白质合成过程的最有效工具。与其他方法相比，这种方法的优点是它能够通过精确绘制 mRNA 成绩单上核糖体的位置和数量来监控翻译。

本文介绍了细菌中RIBO-seq方法的样品采集和制备的连续阶段，突出了与实验规划和执行相关的细节。

由于RIBO-seq依赖于完整的核糖体和相关的mRNA，关键步骤是快速抑制转化和细胞的充分解体。因此，我们建议在液氮中过滤和闪光冷冻，用于细胞采集，并可选使用氯霉素进行预处理，以阻止细菌的转化。对于解体，我们建议用砂浆研磨冷冻细胞，在氧化铝的存在下缠缠，以机械地破坏细胞壁。在此协议中，不需要蔗糖垫或蔗糖梯度超中心化用于单体净化。相反，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 进行 mRNA 分离，然后应用核糖体足迹切除 （28-30 nt 波段），并提供令人满意的结果。这在很大程度上简化了方法，并减少了程序的时间和设备要求。为了准备图书馆，我们建议使用市售的小型RNA套件，用于新英格兰生物实验室的照明测序，遵循制造商的指南，并进行一定程度的优化。

由此产生的 cDNA 库为下一代测序 （NGS） 提出了所需的适当数量和质量。根据上述协议对准备的库进行排序，每个样本可绘制 2 到 10 毫升的独特映射读数，为全面的生物信息分析提供足够的数据。我们介绍的协议是快速和相对容易的，可以用标准的实验室设备执行。

引言

核糖体分析技术（RIBO-seq）是在加州大学旧金山分校乔纳森·魏斯曼的实验室里开发的。与用于研究转化水平基因表达的其他方法相比，RIBO-seq 专注于与 mRNA 结合的每个核糖体，并提供有关其位置和成绩单上核糖体的相对数量的信息。它能够监测体内蛋白质合成的过程，并可以提供单一的圆环分辨率和精度，从而能够测量细胞中单个 mRNA 和整个转录组的核糖体密度。RIBO-seq 技术的基础在于，在翻译过程中，核糖体将 mRNA 分子结合，从而保护脚本的埋藏片段免受核糖化的消化。加入核糖这些片段称为核糖体脚印（RF），然后可以分离、测序并映射到它们产生的脚本上，从而检测核糖体的确切位置。事实上，自20世纪60年代以来，保护mRNA片段的核糖体能力一直被用来研究核糖体结合和翻译启动站点（TIS）2，3，4。然而，随着深测序技术的进步，RIBO-seq已成为翻译监测5的黄金标准，通过核糖体的参与，可以提供蛋白质合成6的全基因组信息。核糖体分析填补了抄本组和原型6号之间存在的技术空白。

要进行核糖体分析，我们需要获得在调查条件下生长的生物体的细胞裂解。在细胞收集和裂解过程中破坏这些条件可能会提供不可靠的数据。为了防止这种情况，通常使用液氮中的转化抑制剂、快速收获和闪光冷冻。细胞可以通过机械同质化器（如搅拌机7、8或珠子搅拌机9）中的低温研磨来解冻，也可以通过移液器10或针11进行三次搅拌。裂解缓冲器可以在细胞粉碎之前或之后添加。在我们的协议中，我们使用液氮来预冷砂浆和虫害，以及氧化铝作为一种更温和的方法来破坏细菌细胞壁，防止RNA剪切经常遇到，当方法，如声化应用。粉碎后，我们将冰冷裂解缓冲器添加到砂浆的冷却内容中。选择适当的裂解缓冲区对于获得核糖体足迹的最佳分辨率非常重要。由于离子强度影响RF大小和读数帧精度，目前建议使用低离子强度和缓冲容量的裂解缓冲器，即使缓冲成分似乎不影响mRNA11，12的核糖体占用率。裂解缓冲的重要成分是镁离子，其存在可防止核糖核酸亚单位的分离，并抑制细菌核糖体11、13的自发构象变化。钙离子也起着重要作用，对于细菌核糖核酸（MNase）在细菌核糖体分析方法14中使用的活性至关重要。添加瓜诺辛5×[β，γ-米多]三磷酸盐（GMP-PNP），GTP的不可水解的模拟，以及氯霉素抑制在裂解15期间的翻译。

获得裂解剂时，通过离心机进行澄清，并分为两部分，每部分用于 RIBO-seq 和高通量总 mRNA 测序 （RNA-seq），因为它们同时执行 （图 1）。RNA-seq 提供了一个参考点，可在数据分析期间比较来自 RIBO-seq 和 RNA-seq 的数据。被调查的转子是由核糖体足迹正常化到mRNA丰度16来定义的。来自RNA-seq的数据也有助于识别克隆或测序文物17。

figure-introduction-1881
图1。为RIBO-seq和RNA-seq准备的mRNA样本的原理图。 对于 RIBO-seq 库的准备，RNA 会用 MNase （A） 进行消化，然后选择长度为 ~28-30 nt 长度的 RF 大小（B）;RNA-seq RNA 是孤立的 （C），耗尽了 rRNA （D），由此产生的 mRNA 被随机分割成不同长度的片段 （E）。 请单击此处查看此图的较大版本。

RIBO-seq 和 RNA-seq 的样品制备程序的初始步骤略有不同（图 1）。对于核糖体分析，裂解酶需要由特定的内毒酶消化，以降解不受核糖体保护的mRNA分子。在标准协议中，获得的单体通过蔗糖垫超中心化或蔗糖梯度超中心化8，14回收。在本文中，我们表明，这一步骤是没有必要隔离的RF所需的RIBO-seq细菌，同样为真核细胞18，和大小选择适当的长度mRNA片段从多晶酰胺凝胶是足够的。

对于RNA-seq，mRNA是通过从总RNA-rRNA分子中耗尽到生物基化寡核苷酸探头获得的，后者与链球菌涂层的磁珠结合。然后用磁铁从样品中取出rRNA-寡核苷酸-珠复合物，导致rRNA耗尽样本19，20。纯化的mRNA分子然后随机碎片碱性水解。获得的 mRNA 片段以及核骨足迹被转换为 cDNA 库，并准备进行深测序（图 2）。这涉及碱性水解（用于 mRNA）和酶消化（用于 RF）后所需的末端修复:3' 端的脱磷，然后是 5' 端的磷酸化。接下来的步骤是适配器配合和反向转录，以创建 cDNA 插入，这些插入由使用 Illlumina 平台的下一代测序 （NGS） 所需的序列所示。库准备的最后阶段是 PCR 反应，其中结构被放大并贴上样品特定条形码的标签，以便在一个通道上对各种样品进行复用和排序。测序前，通过芯片电泳高灵敏度DNA评估库的质量和数量。然后，可以汇集和排序具有适当参数的 cDNA 库。可在不同的光照平台上进行排序，如 MiSeq、NextSeq 或 HighSeq，具体取决于库的数量、所需的读取长度和测序深度。测序后，进行生物信息分析。

figure-introduction-3290
图2。图书馆准备。 库准备包括末端修复、适配器结块、反向转录和用条形码放大。 请单击此处查看此图的较大版本。

核糖体剖析是一种通用的方法，可以根据科学问题进行易于修改和调整。最初它被用于酵母1，但不久后，它被应用于细菌细胞21以及真核模型生物，包括小鼠10，斑马鱼22，果蝇23和阿拉伯多普西塔利亚纳24。它也用于研究不同的核糖体类型:细胞质，线粒体25，26和叶绿体27，28。在欧盟核生物RIBO-seq是常见的适应和改进，以调查翻译的具体方面，包括启动10，11，29，30，31，32，拉长1，10，11，31，33，核糖体停滞33和构象变化33。大多数修改涉及使用不同的翻译抑制剂。然而，在细菌中，类似的研究一直难以进行，因为缺乏与行动34所需的机制的抑制剂。细菌中最常用的转化抑制剂是氯霉素 （CAM），它与肽转移酶中心 （PTC） 结合，防止氨基-tRNA在 A 站点的正确定位。因此，CAM阻止形成肽键，导致逮捕拉长核糖体35。细菌中翻译抑制剂的其他示例是四环素 （TET）36、雷塔帕穆林 （RET）34和 Onc11237，它们已用于调查翻译启动站点。TET，通过直接与A-site tRNA的抗子茎环重叠来防止tRNA输送到核糖体，最初用于验证从CAM治疗获得的结果，因为它们都是抑制翻译拉长38的抗生素。TET被发现检测原发性TIS，但无法显示内部TIS36。RET 结合细菌核糖体的 PTC，并通过干扰 A 站点中的拉长器氨基-tRNA 来防止形成第一个肽键。应用 RET 结果在小学和内部 TIS34中都会导致核糖体逮捕。Onc112，一种富含丙线的抗菌肽，在出口隧道中结合，并阻断核糖体A部位的氨基酸-tRNA结合。因此，Onc112 阻止启动复合物进入拉长阶段37。

核糖体分析提供的主要信息是核糖体密度及其在mRNA上的位置。它成功地用于研究不同生长条件下的翻译水平上的微分基因表达1、6、测量转化效率1、38、39，并检测利博索马尔暂停10等翻译调控事件。RIBO-seq还允许发现注释的ncRNA，伪基因和未注释的小开放读取帧（ORF）的翻译，导致识别新颖和/或非常短的蛋白质编码基因10，12，22，30，37。在这种情况下，RIBO-seq 可以微调和改进基因组注释。由于它对翻译的ORF的识别具有很高的敏感性和定量性质，核糖体分析也可以作为蛋白质组测定或辅助蛋白质组学研究31，34，39的代理。通过映射TIS，核糖体特征分析揭示了已知蛋白质10、32的N-末端延伸和截断等形。RIBO-seq也被改编为研究蛋白质14，21，24的共转化折叠。这种方法能够测量个体胶子6的拉长速率1、10、39或解码速度，并有助于开发翻译17的定量模型。核糖体分析方法还能够提供机械的见解，在细菌7，15，17，帧移位40，停止科顿读数21，终止/回收缺陷41，42和核糖体构象变化33在真核生物。RIBO-seq还被调整，以研究特定的转作用因子对翻译的影响，如miRNA6和RNA结合蛋白在真核生物16，43。然而，重要的是要承认，实验设计和获得的RIBO-seq分辨率决定了从由此产生的测序数据12中可以提取的信息量。

研究方案

1. 样本收集

  1. 准备细菌培养。我们建议每个样本的文化量为 100 mL。
  2. 准备设备和试剂进行样品收集:每个样品两勺，无菌0.45微米混合纤维素酯膜（MCE）过滤器，50mL无菌管，液氮，50毫克/mL氯霉素在70%（vol/vol）乙醇（可选）。刺穿50mL管的盖子，使液氮蒸发，防止封闭管的爆炸。用实验室洗涤剂和 70% 乙醇去污勺子。
  3. 预热过滤设备和细菌培养的生长温度的勺子之一。
    注:我们推荐一个带漏斗、碎底座、接地接头和47毫米弹簧夹的全玻璃过滤装置。
  4. 在采样前，将氯霉素加入细菌培养中，最终浓度为100微克/mL，孵育1分钟（可选）。
  5. 将液氮倒入 50 mL 无菌管中，并将第二勺放入管内冷却。
    谨慎！液氮会导致封闭的容器爆炸，因为蒸发时压力变化。为了防止这种情况，有必要在50mL管的盖子上打几个洞，以便液氮蒸发。
  6. 通过过滤收集细胞。当介质通过膜时停止过滤，但不允许滤镜完全干燥。
  7. 通过使用预热铲快速刮掉过滤盘上的细胞来收集细菌颗粒。立即将整个勺子与收获的细胞放在充满液氮的 50 mL 管中。收获的颗粒应完全覆盖在液氮中。
  8. 让颗粒彻底冻结，并用先前冷却的第二勺清除冷冻细胞。关闭被刺穿的盖子，将管子转移到 -80°C 停止点
    注:每次采集样品后对铲子进行消毒。

2. 细胞裂解

  1. 准备0.1 M GMP-PNP在10米特里斯pH 8，DNase I和1.5 mL反应管的铦，并保持他们在冰上。将离心机冷却至4°C。
  2. 准备裂解缓冲区 （20 mM TRIS pH 7.6， 10 mM MgAcet， 150 mM 卡塞特， 0.4% TRITON X-100， 6 mM β -麦加托乙醇， 5 mM 卡Cl2 和可选 1 mM 氯霉素）.将每个样品的裂解缓冲液的 500 μL 引用到 1.5 mL 反应管中，并将其放置在冰上。
  3. 用实验室洗涤剂和 70% 乙醇净化砂浆和害虫，并干燥。通过向砂浆中注入液氮来冷却砂浆和虫害。
  4. 将冷冻颗粒转移到预冷砂浆中，将其研磨成粉末。用铲子，加入大约1卷氧化铝，然后继续研磨。必要时浇注液氮，使砂浆、虫害和细胞保持冷却，不要让砂浆中的内容解冻。
  5. 在使用裂解缓冲之前，将 GMP-PNP 和 DNase I 添加到溶解缓冲液中，最终浓度分别为 2 mM 和 100 U/mL。将溶液与电池和氧化铝一起转移到砂浆中，并继续研磨。让岩茶在研磨时慢慢解冻，将混合物转移到预冷却的1.5 mL反应管中，并立即放在冰上。
  6. 离心解体在20 000 x g 下在4°C下5分钟。 将超自然分子转移到新的预冷却的1，5 mL反应管中，并把它们放在冰上。
  7. 用纳米滴测量每个样品中的RNA浓度。在无核糖水中使用 1:10 稀释样品和 1:10 稀释裂解缓冲液作为空白。
    注意:请注意，氯霉素在260纳米时表现出显著的吸收。
  8. 将每个裂解水分成两部分:一部分用于RIBO-seq（0.5 - 1毫克RNA），另一部分用于RNA-seq（其余部分）。
  9. 根据制造商的协议，使用市售的 RNA 清理套件清洁 RNA-seq 的样品。
    注意:我们建议使用 Zymo RNA 清洁和浓缩 -25 套件（参见 材料表）。我们还建议在样品和结合缓冲器中加入 4.5 卷乙醇（与样品量相比），用于核糖体足迹和碎裂的 mRNA，以提高短 RNA 片段的纯化效率。
  10. 将用于RNA-seq的样品存储在-80°C。 RNA-seq 的程序将从第 5 步开始继续。

3. 对RIBO-seq样品进行MNase消化

  1. 到 1 毫克 RNA 添加 3.8 μL 的 187.5 U/μL MNase 在 10 mM Tris pH 8 和充值与裂解缓冲器到总体积 500 μL。
  2. 在 25 °C，300 RPM 的温室中孵化 45 分钟。
  3. 使用市售的 RNA 清理套件清洁样品（如步骤 2.9）。
  4. 将样品存放在 -80 °C （停止点） 或进行大小选择。

4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 和 RIBO-seq 样品的大小选择

  1. 准备一个15%的聚丙烯酰胺-TBE凝胶与8M尿素，并将其放置在一个坦克与TBE缓冲。在200 V的恒定电压下预运行至少10分钟。
  2. 将样品与 TBE-尿素样品缓冲区混合，在 95 °C 下脱自然 1 分钟，并立即将其放置在冰上。
  3. 使用注射器将 TBE 缓冲器注入凝胶井，洗净尿素。加载样品，在样品之间留出一个井空间，以分离每个样品并防止交叉污染。使用29 nt寡核苷酸和26 nt和32 nt寡核苷酸的混合物作为标记。以180 V的恒定电压运行电泳。
  4. 为夜间孵化准备无菌缓冲（5 mM EDTA，10 mM NaOAc pH 5）。
  5. 电泳后，在 SYBR 金浴中染色凝胶约 2-3 分钟，用无核糖水冲洗凝胶。
  6. 使用无菌针头或剃须刀叶片将凝胶碎片在 26 至 32 nt 之间，并将凝胶碎片单独放置在每个样品的 1.5 mL 管中。在样品之间更换针头或剃须刀刀片。
  7. 在每个反应管中加入 200 μL 的隔夜潜伏缓冲。
  8. 在 10 °C、1000 RPM 的温混合器中隔夜孵化样品。
  9. 第二天，按照步骤 2.9 清洁样品。在 80μL 的无核水中留下脚印。
  10. 将样品存放在-80°C.停止点。RIBO-seq 的程序将从第 7 步开始继续。

5. 通过从RNA-seq样品中耗尽rRNA来净化细菌mRNA

  1. 用细菌 mRNA 净化试剂盒（例如，英异原 MICROB 快报）从样品中取出 rRNA。按照制造商的协议。
  2. 按照步骤 2.9 清洁样品。将 mRNA 在 50 μL 的无核糖水中排出。
  3. 将样品储存在-80°C（停止点）或继续碱性碎片化。

6. RNA-seq样品碱性碎片化

  1. 准备碱性水解缓冲（混合 220 μL 0.1 M NaHCO3， 30 μL 的 0.1 M Na2CO3 和 1μL 的 0.5 M EDTA）.将 1 卷 （50 μL） 碱性缓冲器与 1 卷 （50 μL） 样本混合，在 95 °C 孵化 25 分钟。
  2. 添加 5 μL 的 3 M NaOAc pH 5.5 以阻止反应。
  3. 按照步骤 2.9 清洁样品，并在 80 μL 的无核糖水中清除样品。
  4. 可能的停止点:将RNA-seq样品存储在-80°C。 但是，我们建议直接进入第 7 步，以避免不必要的冻结和解冻。

7. RNA-和RIBO-seq样品的脱磷和磷化

  1. 在每个样品中加入 10μL 的 10 倍反应缓冲器 PNK 和 5 μL T4 PNK。在37°C孵育1.5小时，以去磷酸化3'结束。
  2. 加入3微升的1m ATP，在37°C孵育1小时，以磷酸化5'结束。
  3. 清洁样品，如步骤2.9，在30微l无核糖水。
  4. 将样品存放在-80°C.停止点。

8. 图书馆准备使用NEBNext多路复用小RNA图书馆准备集为照明

  1. 在 6 μL 无核糖水中准备 100-1000 ng 的输入 RNA（获得 mRNA 片段和核糖体脚印），并添加 1 μL 的 3' SR 适配器。根据制造商的协议孵化。
  2. 添加 10 μL 的 3' 液化反应缓冲器 （2X） 和 3 μL 的 3' 脂酶混合，在 37 °C 下孵育 2.5 小时，而不是制造商协议规定在 25 °C 处 1 小时。
  3. 根据制造商的协议，使用修改后的程序混合反向转录引言:75 °C 5 分钟，30 分钟 37 °C，4 °C 保持。
  4. 利盖特5'SR适配器。按照制造商的协议进行一个更改:在 37 °C 下进行 2.5 小时的孵化，而不是在 25 °C 时执行 1 小时。
  5. 根据制造商的协议执行反向转录。
  6. 可能的停止点:在 70 °C 下孵育含有合成 cDNAs 的样品 15 分钟，以激活反向转录酶并将其存储在 -80 °C。 但是，我们建议直接进入后续步骤，以避免不必要的样品冻结和解冻。
  7. 将每个 cDNA 库的一半存储在 -80 °C 作为备份。
  8. 根据制造商的协议执行 PCR 放大。使用一半的反应组合。将已获得的库存储在-80°C停止点。

9. 使用 PAGE 对 cDNA 库进行大小选择

  1. 准备 6% 多丙烯酰胺-TBE 凝胶，并将其放置在带 TBE 缓冲器的罐中。在200 V的恒定电压下预运行至少10分钟。
  2. 将样品与凝胶加载染料（蓝色 （6X） 混合，并将它们加载到凝胶上。使用快速加载 pBR322 DNA-MspI 文摘作为梯子。在开始时，以120 V的恒定电压运行电泳，使DNA进入凝胶，然后将电压更改为180 V。
  3. 电泳完成后，将凝胶在 SYBR 金浴中染色约 2-3 分钟，用无核糖水冲洗凝胶。
  4. 含有库的凝胶片段。对于RNA-seq样本，在135-180 nt之间消费税，在135-170 nt之间为RIBO-seq。使用无菌针头或剃须刀刀片，将切除的凝胶碎片放在单独的 1.5 mL 反应管中。请记住在样品之间更换针头或剃须刀刀片。
    注:来自NEBNext多路复用小RNA库准备集的适配器和条形码总共有119 nt，这决定了较低的切除截止。
  5. 在每个切除的凝胶碎片中加入 100 μL 的无核糖水。
  6. 在 10 °C、450 RPM 的热混合器中隔夜孵化凝胶碎片。
  7. 根据制造商的协议，用商业DNA清理套件清洁和浓缩 cDNA 库。
    注:我们建议使用 Zymo DNA 清洁和浓缩 -5 套件（参见材料表）。
  8. 将纯化的 cDNA 库存储在 -80 °C 停止点。

结果

这里提出的示范性结果是在一项研究WT 杆菌亚蒂利细胞 的孢子细胞的翻译规则的研究中取得的。隔夜培养物被稀释到600 OD 600 等于 0.1 在 100 mL 的丰富中等和孵育在 37 °C 与剧烈摇晃，直到 OD600 达到 0.5-0.6。然后，丰富的介质被最少的介质取代，以诱导孢子过程，潜伏持续了长达四个小时。从 T0 开始每小时采集一次细胞 - 旋转感应 - 导致五个时间点。收获前一分钟，按照上?...

讨论

核糖体分析的关键技术挑战是需要快速抑制翻译，以便在特定的生理兴趣状态下捕获 mRNA 上的核糖体快照。为此，通常使用液氮中的转化抑制剂、快速收获和闪光冷冻。使用抗生素是可选的，因为它们会导致人工制品。氯霉素是一种常用的药物，用于抑制细菌RIBO-seq中拉长的核糖体。然而，它并不阻止启动，导致核糖体的积累约6个科顿下游的翻译启动网站14。此外，其抑制肽转?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

ALS 感谢 EMBO 安装赠款 IG 3914 和 POIR 的财政支持。04.04.00-00-3E9C/17-00 在欧洲联盟根据欧洲区域发展基金共同资助的波兰科学基金会第一小组方案内进行。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (powder)InvitrogenAM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pureAcros Organics125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)New England BiolabsP0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.Chempur114560600
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3881-500G
ChloramphenicolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnase I recombinant, Rnase-freeRoche4716728001
EDTA disodium saltFisher ScientificE/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.ABA6480111
Filtration apparatusVWR Collection511-0265all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrateSigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA&A Biotechnology040-500
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661-250G
MCE membrane fiterAlfatec TechnologyM47MCE45GWSpore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA PurificationInvitrogenAM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for IlluminaNew England BiolabsE7300S
Nuclease-Free WaterAmbionAM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Concentrator -25Zymo ResearchR1018
Sodium acetateSigma-AldrichS2889-250G
Sodium carbonateSigma-Aldrich223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stainLife TechnologiesS11494
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction BufferNew England BiolabsB0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Urea G.R.lach:ner40096-AP0

参考文献

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. . . Babraham Bioinformatics. Fast QC. , (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, 678 (2019).
  49. Choi, J. . RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021)
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021)

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。