細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

要約

ここでは、細菌におけるRIBO-seqのサンプル採取および調製の段階について説明する。これらのガイドラインに従って作成されたライブラリのシーケンシングは、包括的なバイオインフォマティクス分析のための十分なデータをもたらす。私たちが提示するプロトコルはシンプルで、標準的な実験装置を使用し、リシスから図書館の取得まで7日かかります。

要約

リボソームプロファイリング技術(RIBO-seq)は、現在 、生体内でのタンパク質合成のプロセスを研究するための最も効果的なツールです。この方法の利点は、他のアプローチと比較して、mRNA転写物上のリボソームの位置と数を正確にマッピングすることによって翻訳を監視する能力である。

本稿では、細菌におけるRIBO-seq法のサンプル採取と準備の連続した段階について述べ、実験の計画と実行に関連する詳細を強調する。

RIBO-seqは、インタクトリボソームおよび関連するmRNAに依存しているため、重要なステップは、翻訳の迅速な阻害および細胞の適切な崩壊である。したがって、クロラムフェニコールによる任意の前処理で細胞収穫のための液体窒素中のろ過とフラッシュ凍結を提案し、細菌の翻訳を停止する。崩壊のために、我々は、機械的に細胞壁を破壊する酸化アルミニウムの存在下でモルタルおよび害虫で凍結細胞を粉砕することを提案する。このプロトコルでは、単数精製のためのスクロースクッションまたはショ糖勾配超遠心分離は必要ない。代わりに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いたmRNA分離に続いてリボソームフットプリント切除(28-30ntバンド)が適用され、満足のいく結果を提供する。これにより、この方法が大幅に簡素化され、手順の時間と設備の要件が削減されます。ライブラリの準備のために、我々はある程度の最適化とメーカーのガイドラインに従って、ニューイングランドバイオラボからのイルミナシーケンシングのための市販の小さなRNAキットを使用することをお勧めします。

結果として得られる cDNA ライブラリは、次世代シーケンシング(NGS)に必要な適切な量と品質を示します。記載されたプロトコルに従って調製されたライブラリのシーケンス化は、サンプル当たり2〜10mlnの一意にマッピングされた読み取りで、包括的なバイオインフォマティクス分析に十分なデータを提供する。私たちが提示するプロトコルは、迅速かつ比較的簡単であり、標準的な実験装置で実行することができます。

概要

リボソームプロファイリング技術(RIBO-seq)は、カリフォルニア^{大学サンフランシスコ校}のジョナサン・ワイスマンの研究室で開発されました。RIBO-seqは、トランスレーショナルレベルで遺伝子発現を研究するために使用される他の方法と比較して、mRNAに結合する各リボソームに焦点を当て、その位置およびトランスクリプト上のリボソームの相対的な数に関する情報を提供します。それは、生体内でのタンパク質合成のプロセスを監視することを可能にし、細胞内の個々のmRNAおよび全転写体に沿って両方のリボソーム密度の測定を可能にする単一のコドンの分解能および正確さを提供することができる。RIBO-seq技術の基礎には、翻訳中にリボソームがmRNA分子に結合し、リボヌクレアーゼ消化から転写物の埋もれた断片を保護するという事実があります。リボヌクレアーゼを添加すると、保護されていないmRNAが消化され、リボソーム(通常〜28〜30 ntの長さ)で囲まれた断片はそのまま残ります。リボソームフットプリント(RF)と呼ばれるこれらの断片は、リボソームの正確な位置を検出することから生まれたトランスクリプトに分離、配列決定、マッピングすることができます。実際、mRNA断片を保護するリボソーム能力は、1960年代からリボソーム結合および翻訳開始部位(TIS)2、3、4を研究するために....

プロトコル

1. サンプルコレクション

1. 細菌培養を準備します。1サンプルあたり100mLの培養量をお勧めします。
2. サンプル採取用の装置および試薬を準備する:サンプルあたり2つのスコップラ、無菌0.45 μm混合セルロースエステル膜(MCE)フィルター、50 mL滅菌チューブ、液体窒素、50mg/mLクロラムフェニコール70%(vol/vol)エタノール(オプション)。液体窒素蒸発を可能にし、閉じた管の爆発を防ぐために50 mLの管のふたを穿刺する。実験室用洗剤と70%エタノールでスコップラを除染します。
3. 濾過装置とスコップラの1つを細菌培養の成長温度に予熱する。
   注:漏斗、フリットベース、グランドジョイントフラスコ、47 mm Øスプリングクランプを備えたオールガラス濾過装置をお勧めします。
4. サンプル収穫前に、菌培養物にクロラムフェニコールを加えて、最終濃度の100 μg/mLにし、1分間インキュベートします(オプション)。
5. 液体窒素を50 mLの無菌チューブに注ぎ、2番目のすくい管をチューブの中に入れて冷却します。
   注意！液体窒素は、蒸発時の圧力変化により、閉じた容器が爆発する可能性があります。これを防ぐためには、液体窒素の蒸発を可能にするために50 mLチューブの蓋にいくつかの穴を作成する必要があります。
6. ろ過によって細胞を集める。培地が膜を通過した場合はフィルタリングを停止しますが、フィルタを完全に乾燥させ....

結果

ここで提示された例示的な結果は、WT バチルス・サステイリス 細胞の翻訳調節を調べる研究で得られた。一晩培養物を、100mLの濃厚培地で0.1に等しいOD600に希釈し_、OD600 が0.5-0.6に達するまで激しく揺れで37°Cでインキュベートした。 次いで、培養を最小限の培地に置換して胞子化を誘導し、最大4時間培養を続けた。細胞は、T0で始まる1時間ごとに採取された - 胞子誘?.......

ディスカッション

リボソームプロファイリングの重要な技術的課題は、特定の生理学的状態でmRNA上のリボソームのスナップショットをキャプチャするために、翻訳を迅速に阻害する必要性である。これを達成するために、翻訳阻害剤、液体窒素中の急速な収穫およびフラッシュ凍結が一般的に使用されている。抗生物質の適用は、アーティファクトを引き起こす可能性があるため、オプションです。クロラム.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0