JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على الارتفاع المغناطيسي يمكنها الكشف على وجه التحديد عن وجود المستضدات ، إما قابلة للذوبان أو مقيدة بالغشاء ، عن طريق تحديد التغيرات في ارتفاع ارتفاع حبات الالتقاط ذات الكثافات الثابتة.

Abstract

تم تطوير الطريقة الموصوفة على أساس مبادئ الارتفاع المغناطيسي ، الذي يفصل بين الخلايا والجسيمات على أساس كثافتها وخصائصها المغناطيسية. الكثافة هي نوع الخلية تحديد الممتلكات، ترتبط مباشرة إلى معدل الأيض، والتمايز، وحالة التنشيط. يسمح الارتفاع المغناطيسي بنهج خطوة واحدة لفصل خلايا الدم المتداولة بشكل ناجح، وصورها وتوصيفها، والكشف عن فقر الدم، وأمراض الخلايا المنجلية، وتعميم الخلايا السرطانية على أساس الكثافة والخصائص المغناطيسية. هذا النهج قابل أيضا للكشف عن المستضدات القابلة للذوبان الموجودة في محلول باستخدام مجموعات من الخرز منخفض الكثافة وعالي الكثافة المغلفة بالأجسام المضادة للالتقاط والكشف ، على التوالي. إذا كان المستضد موجودا في الحل ، فإنه سيتم جسر مجموعتين من الخرز ، وتوليد مجمع حبة حبة جديدة ، والتي سوف ترتفع بين صفوف الخرز المغلفة بالأجسام المضادة. زيادة تركيز المستضد المستهدف في المحلول سوف تولد عددا أكبر من مجمعات حبة الخرز بالمقارنة مع تركيزات أقل من المستضد، مما يسمح بإجراء قياسات كمية للمضاد المستهدف. الارتفاع المغناطيسي مفيد لطرق أخرى بسبب انخفاض وقت إعداد العينة وعدم الاعتماد على طرق القراءة الكلاسيكية. يتم التقاط الصورة التي تم إنشاؤها بسهولة وتحليلها باستخدام المجهر القياسي أو الجهاز المحمول، مثل الهاتف الذكي أو الكمبيوتر اللوحي.

Introduction

الارتفاع المغناطيسي هو تقنية تم تطويرها لفصل وتحليل وتحديد أنواع الخلايا1و2و3والبروتينات4و5 والمواد الأفيونية6 استنادا فقط إلى كثافتها المحددة وخصائصها المغناطيسية. كثافة الخلية هي فريدة من نوعها، خاصية جوهرية من كل نوع الخلية ذات الصلة مباشرة لمعدل الأيض والتمايز حالة7،8،9،10،11،12،13،14. إن تحديد التغيرات الدقيقة والعابرة في كثافة الخلايا خلال ظروف الحالة الثابتة، وخلال مجموعة متنوعة من عمليات الخلايا، يمكن أن يوفر للمرء نظرة ثاقبة لا مثيل لها في فسيولوجيا الخلايا والفيزيولوجيا المرضية. وترتبط التغيرات في كثافة الخلية مع تمايز الخلية15،16، تطور دورة الخلية9،17،18،19، موت الخلايا المبرمج20،21،22،23، والتحول الخبيث24،25،26 . لذلك ، يمكن استخدام القياس الكمي للتغيرات المحددة في كثافة الخلايا ، للتمييز بين الخلايا من أنواع مختلفة ، وكذلك التمييز بين نفس النوع من الخلايا التي تخضع لعمليات تنشيط مختلفة. وهذا يمكن التجارب التي تستهدف خلية معينة من السكان الفرعيين، حيث التغيرات الديناميكية في الكثافة بمثابة مؤشر على تغيير استقلاب الخلية27. كما ثبت أن الخلية قد تغير كثافتها استجابة لبيئة متغيرة7، فمن الضروري قياس حركية الخلية فيما يتعلق بكثافتها لفهمها بشكل كامل ، والتي قد لا توفرها الطرق الحالية12. الارتفاع المغناطيسي من ناحية أخرى، يسمح لتقييم ديناميكي للخلايا وخصائصها28.

الخلايا هي ثنائية المغناطيسية بمعنى أنها لا تملك لحظة ثنائي القطب المغناطيسي الدائم. ومع ذلك ، عندما تتعرض لحقل مغناطيسي خارجي ، يتم إنشاء لحظة ثنائي القطب المغناطيسي ضعيفة في الخلايا ، في الاتجاه المعاكس للمجال التطبيقي. وهكذا، إذا تم تعليق الخلايا في محلول مغناطيسي وعرضها لحقل مغناطيسي عمودي قوي، فإنها سوف ترتفع بعيدا عن المصدر المغناطيسي وتتوقف إلى ارتفاع، والذي يعتمد في المقام الأول على كثافتها الفردية. الارتفاع ثنائي المغناطيسي للجسم المحصور في الحد الأدنى من المجال المغناطيسي غير المتجانس ممكن عندما يتم استيفاء المعيارين التاليين: 1) يجب أن تكون الحساسية المغناطيسية للجسيمات أصغر من المتوسط المحيط ، و 2) يجب أن تكون القوة المغناطيسية قوية بما يكفي لموازنة قوة الطفو للجسيمات. ويمكن الوفاء بكلا المعيارين عن طريق تعليق RBCs في العازلة المغناطيسية وخلق تدرجات المجال المغناطيسي قوية مع مغناطيس دائم صغيرة وغير مكلفة ومتاحة تجاريا1. يتم تحديد موضع توازن جسيم محصور مغناطيسيا على محور على طول اتجاه الجاذبية من خلال كثافته (بالنسبة لكثافة العازلة) ، وقابليته المغناطيسية (بالنسبة للحساسية المغناطيسية للحاجز) ، وتوقيع المجال المغناطيسي التطبيقي. وبما أن الكثافة والخصائص المغناطيسية للمحلول ثابتة في جميع أنحاء النظام ، فإن خصائص الكثافة الجوهرية للخلايا ستكون العامل الرئيسي الذي يحدد ارتفاع ارتفاع الخلايا ، مع خلايا أكثر كثافة ترتفع أقل مقارنة بالخلايا الأقل كثافة. يستخدم هذا النهج مجموعة من حبات مرجعية ذات كثافة (1.05 و 1.2 غرام/مل) تسمح لنا باستخدام تحليل دقيق وقياسي لقياس الكثافة. تغيير تركيز المحلول المغناطيسي يسمح لأحد لعزل مجموعات مختلفة من الخلايا، مثل RBCs من WBCs، وكثافة الخلايا المتداولة هي خلية محددة، وإزالة الحاجة إلى بروتوكولات العزل أو التلاعب الخلية الأخرى.

تعتمد غالبية طرق الكشف المستخدمة في أبحاث البيولوجيا على استقراء أحداث ملزمة محددة في سهولة تحديد الإشارات الخطية. وغالبا ما تكون أساليب القراءة هذه معقدة وتنطوي على معدات متخصصة وموظفين علميين متفرغين. وصف نهج يهدف إلى الكشف عن المستضدات الموجودة إما على غشاء البلازما للخلايا أو الحويصلات خارج الخلية أو القابلة للذوبان في البلازما ، باستخدام حبة واحدة أو اثنتين من الأجسام المضادة المغلفة . يجب أن تكون الخرز ذات كثافات مختلفة عن بعضها البعض ومن تلك الخاصة بالأهداف التي تم استجوابها. يتم ترجمة وجود مستضد الهدف في أي سائل حيوي معين إلى تغيير محدد وقابل للقياس في ارتفاع الارتفاع لخلية إيجابية مستضد مرتبطة بالخرزة الكشفية. في حالة المستضدات القابلة للذوبان أو الحويصلات خارج الخلية ، فهي ملزمة بالتقاط والخرز والكشف عنه ، مما يشكل مجمع حبة حبة بدلا من مجمع خلايا الخرز. يعتمد التغيير في ارتفاع الارتفاع على الكثافة الجديدة لمجمعات خلية الخرز أو حبة الخرز. بالإضافة إلى التغير في ارتفاع الارتفاع للمجمعات ، مما يشير إلى وجود مستضد في السائل الحيوي ، يعتمد عدد المجمعات أيضا على مقدار الهدف ، مما يجعل الارتفاع المغناطيسي أيضا نهجا كميا للكشف عن المستضد24.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي المستخدم في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمركز بيت إسرائيل الطبي (IRB).

1. إعداد الصك

ملاحظة: يتطلب التصوير رفع الخلايا اثنين من المغناطيس النيودميوم الأرض النادرة ممغنطة على المحور ض ليتم وضعها مع القطب نفسه التي تواجه بعضها البعض لتوليد حقل مغناطيسي. يمكن تخصيص المسافة بين المغناطيس اعتمادا على كثافة المجال المغناطيسي وكثافة الأهداف. في هذه الحالة يتم فصل المغناطيس بمساحة 1mm كافية لإدراج 50 ملم طويلة 1x1 مم مربع أنبوب زجاجي شعري. تم طباعة الجهاز ثلاثي الأبعاد باستخدام تصميم AutoCAD ، وهو متاح عند الطلب.

  1. وضع المجهر على جانبها، أفقي تماما.
    ملاحظة: المجهر الموضوع في وضع مستقيم قياسي غير مناسب مباشرة لتصوير الأجسام المرفوعة بسبب مواقع المغناطيس فيما يتعلق بالمكثف والهدف. يمكن تجاوز هذا القيد عن طريق وضع المجهر على جانبه ، أفقيا تماما مما يسمح للمكثف بتركيز الضوء في الشعرية ، والعدسة الموضوعية لتصوير الخلية التي ترتفع بين المغناطيس ، مع الحفاظ على متطلبات إضاءة Köhler.
  2. دعم ومستوى الموقف على طاولة الاتساع باستخدام 2 أو 3 مقابس المختبر.
  3. للحد من الاهتزازات، قم بدعم طاولة لوح الخبز بأقدام مطاطية مبللة.
  4. إزالة المرحلة واستبدالها بمقبس معمل مضغوط لضبط ارتفاع جهاز الرفع(المحور ص)،ومرحلتين تحويليتين أحاديتي المحور؛ واحد لضبط التركيز(ض المحور)، والثاني لمسح أنبوب الشعرية.
  5. قم بتوصيل جهاز الرفع المغناطيسي بمقبس المختبر باستخدام وظيفتين بصريتين صغيرتين.

2. ربط الأجسام المضادة لكاربوكوسي-Microparticles/الخرز (تعديل من بروتوكول من قبل PolyAn)

ملاحظة: تحتاج الخرز منخفض الكثافة فقط (1.05 جم/مل) إلى أن تكون مغلفة للكشف عن Rh(+)، ولكن يتم تغطية كل من الخرز عالي الكثافة ومنخفض الكثافة للكشف عن الحويصلات خارج الخلية.

  1. إخراج 1 ملغ ما يعادل تعليق حبة وإضافة إلى 0.5 مل من تنشيط العازلة (50 mM MES (MW195.2, 9.72 ملغ في 1 مل)) الرقم الحموضة 5.0 و 0.001٪ بوليسوربات-20).
  2. إضافة 12 ميكرولتر من EDC 1.5 M الطازجة (MW 191.7، 0.28755 غرام في 1 مل) و 12 ميكرولتر من 0.3 M Sulfo-NHS (MW 217.14، 0.0651 غرام في 1 مل) في الماء البارد الجليد.
  3. وضع أنابيب على شاكر المداري ويهز بقوة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتنشيط مجموعات الكربوسيل على الخرز.
  4. إيقاف التنشيط بعد 1 ساعة بإضافة 0.5 مل من اقتران المخزن المؤقت (10x PBS، أو 0.1 M فوسفات pH 7-9).
  5. بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة، أو، إذا كان لا يمكن بيليه الخرز، واستخدام 0.45 ميكرومتر فلتر أنبوب الطرد المركزي. يستنشق الفائقة أو التدفق من خلال.
  6. غسل الخرز مع 1 مل من 10x برنامج تلفزيوني 3 مرات كما هو الحال في الخطوة 2.5.
  7. حساب 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل حبات ملغ ومزيج الأجسام المضادة المطلوبة مع الخرز المنشط إلى تركيز الأجسام المضادة النهائي 0.7-1.0 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 10X.
  8. وضع أنابيب على أنبوب الروك تعيين على سرعة منخفضة. لفة أنابيب بلطف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لاقتران.
  9. كرر الخطوة 2.5 وغسل الخرز مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 10x.
  10. اغسله مع 0.5 مل من 1 M الإيثانولامين (98٪ مخزون = 16.2 M) في درجة الحموضة العازلة 8.0 مع 0.02٪ Polysorbate-20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء اهتزاز بلطف.
  11. كرر الخطوة 2.5 واغسل الخرز مرة واحدة في 1 مل من DPBS. يمكن تخزين الخرز في 200 ميكرولتر من DPBS عند 4 درجة مئوية حتى الحاجة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. جمع وإعداد الدم للكشف Rh(+)

  1. باستخدام جهاز lancing بنقرة واحدة، وخز إصبع المتبرع Rh(+) وجمع 10 ميكرولتر من الدم إلى 1 مل من DPBS.
  2. وصمة عار في الخلايا Rh + مع بقعة غشاء البلازما الفلورسنت. اختياريا، إضافة 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت إلى تعليق 1 مل من الخلايا Rh+ (1:1000 التخفيف).
  3. احتضان الخلايا مع صبغة الفلورسنت في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. بيليه الخلايا عن طريق الغزل في 5600 × غرام لمدة 15 ق وغسل 3 مرات باستخدام 1 مل من DPBS. ريسوسبند في 1 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS ++).
  5. باستخدام جهاز lancing بنقرة واحدة ، وخز إصبع متبرع Rh(-) وجمع 2 ميكرولتر من الدم.
    ملاحظة: إذا كان إعداد أكثر من 2 الشروط، وجمع ما يكفي من الدم لإضافة 1 ميكرولتر من Rh(-) الدم إلى كل أنبوب.
  6. إعداد الأنابيب التجريبية اللازمة: الخرز وحدها، التحكم IgG، عينة.
    1. الخرز وحده: إضافة 174 ميكرولتر من HBSS ++، 1 ميكرولتر من الخرز التحكم IgG، 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة (1.2 غرام / مل)، و 24 ميكروغرام من 500 MM GD3+ (60 mM).
    2. التحكم IgG: إضافة 172 ميكرولتر من HBSS ++, 1 ميكرولتر من الخرز التحكم IgG, 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة, 1 ميكرولتر من Rh- الدم, 1 ميكرولتر من ملطخة Rh + تعليق الدم, و 24 ميكرولتر من 500 mM GD3+.
    3. أنبوب عينة إضافة 172 ميكرولتر من HBSS ++، 1 ميكرولتر من الخرز المغلفة المضادة لل RhD، 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة، 1 ميكرولتر من Rh-الدم، 1 ميكرولتر من تعليق الدم الملون Rh(+)، و 24 ميكروغرام من 500 مليون غرام من GD3 +.
      ملاحظة: تضاف الخرز عالية الكثافة إلى عينات Rh للرجوع إليها.

4. عزل PMNs للتظاهر فصل الخلية

  1. عزل العدلات
    1. ارسم 40 مل من الدم الوريدي في حقنة سعة 60 مل تحتوي على 6 مل من حمض سيترات الصوديوم /الستريك (0.15 م، درجة الحموضة 5.5) و14 مل من 6٪ Dextran-70.
    2. انتظر لمدة 50 دقيقة للدم إلى الرواسب.
    3. طبقة ببطء خلايا معطف برتقالي على رأس 20 مل من Ficoll-Paque عن طريق دفع أعلى 18 مل من خلال أنابيب جمع الدم في أنبوب 50 مل، وتجنب التلوث مع RBCs المترسبة. فمن المستحسن استخدام مجموعة جديدة لجمع الدم، لتقليل التلوث مع RBCs المتبقية المتبقية في أنبوب جمع الدم الأصلي.
    4. بيليه الخلايا معطف بافي عن طريق الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3000 × ز. العدلات وتلوث RBCs سوف بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. سوف PBMC تشكيل طبقة بيضاء على رأس Ficoll-باك.
    5. نقل العدلات إلى أنبوب جديد 50 مل.
    6. Lyse أي RBCs المتبقية عن طريق احتضان العدلات مع 20 مل من 0.2٪ محلول NaCl الباردة لمدة 25 ثانية، تليها إضافية 20 مل من 1.6٪ NaCl. يجب أن يكون الحفل النهائي ل NaCl 0.9٪ (متساوي التوتر).
    7. الطرد المركزي تعليق لمدة 10 دقيقة في 3000 x ز.
    8. إزالة supernatant وإعادة إنفاق العدلات إلى التركيز المطلوب.
  2. عزل الخلايا الليمفاوية
    1. لوحة PBMCs في RPMI مع 5٪ الحرارة المعطل المصل في لوحات الثقافة 6-جيدا.
    2. احتضان لوحات لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. سوف Monocytes تلتزم لوحة، وسوف تكون الخلايا الليمفاوية العائمة بحرية.
    3. إزالة العازلة التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية وغسله مرتين مع RPMI.
    4. إعادة تمركز الخلايا اللمفاوية في التركيز المطلوب.
  3. تسمية RBCs، PMN، والخلايا الليمفاوية.
    1. تسمية كل نوع الخلية مع صبغة الفلورسنت مختلفة. تأكد من كل فلوريس صبغة في قناة مختلفة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لكل من الأصباغ المختارة.

5. جيل من Vesicles خارج الخلية RBC عن طريق تفعيل تكملة

  1. الحصول على الدم الكامل من خلال venipuncture باستخدام أنابيب EDTA.
  2. تمرير الدم من خلال مرشح خلايا الدم البيضاء، ومن ثم الطرد المركزي 3 مرات في 500 × ز لمدة 10 دقيقة لكل لعزل خلايا الدم الحمراء. استخدم HBSS++ كحاجز غسيل.
  3. جعل aliquots من 100 ميكرولتر RBCs معبأة في أنابيب 1.5 مل، وجعل حجم إلى 1 مل عن طريق إضافة HBSS ++.
  4. إضافة C5b,6 إلى تركيز نهائي 0.18 ميكروغرام/مل في HBSS++, ثم دوامة.
  5. وضع على شاكر بطيء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. أضف بروتين C7 إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام/مل. مزيج عن طريق عكس الأنبوب بلطف عدة مرات. لا دوامة من هذه النقطة إلى الأمام.
  7. ضع الأنبوب على أنبوب شاكر تعيين بسرعة منخفضة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. أضف بروتين C8 إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام/مل، وبروتين C9 إلى 0.45 ميكروغرام/مل. مزيج عن طريق عكس الأنابيب بلطف عدة مرات.
  9. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. الطرد المركزي الأنبوب في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
  11. جمع النافورة التي تحتوي على EV في أنبوب جديد (ق). لا تترى نقل الناطقة قريبة جدا من بيليه الخلية.

6. تحليل الخلايا على جهاز الارتفاع المغناطيسي

  1. تنفيذ بدء تشغيل الأداة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحميل 50 ميكرولتر من العينة في أنبوب الشعرية حتى يتم تعبئة الأنبوب. ختم نهايات الأنبوب الشعري مع تسرب الشعرية التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء الحالية.
  3. تحميل أنبوب الشعرية في حامل بين المغناطيس العلوي والسفلي. ضبط المرحلة والتركيز على عرض الأمثل.
    ملاحظة: يمكن أن تأخذ الخلايا / الخرز في أي مكان من 5-20 دقيقة للوصول إلى وضع التوازن المغناطيسي على أساس كثافتها وتركيز GD3 +. كلما زاد تركيز GD3 +، كلما كان الوقت أقصر.

النتائج

يركز الارتفاع المغناطيسي الأجسام ذات الكثافات المختلفة على ارتفاعات مختلفة للارتفاع اعتمادا على كثافة الجسم ، وتوقيعه المغناطيسي ، وتركيز المحلول المغناطيسي ، وقوة المجال المغناطيسي الذي أنشأه مغناطيسان قويان نادران. كما يتم وضع المغناطيس اثنين فوق بعضها البعض، يمكن فقط أن ينظر إلى عي?...

Discussion

الطارد المركزي المتدرجة حاليا تقنية قياسية لعزل المكونات دون الخلوية على أساس كثافات فريدة من نوعها. غير أن هذا النهج يتطلب استخدام وسائط متخصصة متدرجة ومعدات للطرد المركزي. يسمح نهج الارتفاع المغناطيسي المعروض هنا بإجراء تحقيق مفصل في الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا المتداولة ?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جيلوليو بيريرا على مساعدته في العمل خارج الخلية.

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة التالية إلى ICG: RO1CA218500 وUG3HL147353 وUG3TR002881.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrateSigma AldrichM-2933(MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thicknessK&J MagneticsCustomMagnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)Leica Microsystems267620Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)Sigma AldrichCLS8163Used to wash beads
Compact Lab JackThorlabsLJ750Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-144Solution for bead suspensions
EthanolamineSigma AldrichE9508-100MLUsed during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)InvitrogenC37608Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol InjectionProHanceNDC 0270-1111-03Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++Gibco14025-092Solution for sample preparation
Human C5b,6 complexComplement Technology, IncA122Used to generate RBC Evs
Human C7 proteinComplement Technology, IncA124Used to generate RBC Evs
Human C8 proteinComplement Technology, IncA125Used to generate RBC Evs
Human C9 proteinComplement Technology, IncA126Used to generate RBC Evs
Mini Series Post CollarThorlabsMSR2Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE1769-10G(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG ControlR&D SystemsAB-105-CUsed to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)Boston BioproductsBM-220Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)Sigma AldrichP7949-500MLComponent of activation buffer
Polystyrene Carboxyl PolymerBangs LaboratoriesPC06004Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal AntibodyInvitrogenPA5-112694Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade MicroscopeOlympusProvis AX-70Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening FeetThorlabsRDF1Used to support the breadboard table
Square Boro TubingVitroTubes8100-050Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHSThermoscientific24510Used in antibody coupling reaction
Translational StageThorlabsPT1Used for focusing and for scanning capillary tube

References

  1. Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
  2. Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
  3. Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
  4. Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
  5. Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
  6. Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
  7. Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
  8. Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
  9. Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
  10. Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
  11. Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
  12. Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
  13. Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
  14. Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
  15. Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
  16. Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
  17. Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
  18. Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
  19. Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
  20. Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
  21. Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
  22. Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
  23. Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).
  24. Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
  25. Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
  26. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  27. Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
  28. Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
  29. Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved