Quantificação de Densidades Celulares e Propriedades Antigênicas usando Levitação Magnética

Resumo

Este artigo descreve um método baseado em levitação magnética que pode detectar especificamente a presença de antígenos, solúveis ou ligados à membrana, quantificando mudanças na altura de levitação das contas de captura com densidades fixas.

Resumo

O método descrito foi desenvolvido com base nos princípios da levitação magnética, que separa células e partículas com base em sua densidade e propriedades magnéticas. Densidade é um tipo de célula que identifica propriedade, diretamente relacionada à sua taxa metabólica, diferenciação e status de ativação. A levitação magnética permite uma abordagem de um passo para separar, imagem e caracterizar com sucesso as células sanguíneas circulantes, e detectar anemia, doença falciforme e células tumorais circulantes com base na densidade e propriedades magnéticas. Esta abordagem também é favorável à detecção de antígenos solúveis presentes em uma solução usando conjuntos de contas de baixa e alta densidade revestidas com anticorpos de captura e detecção, respectivamente. Se o antígeno estiver presente na solução, ele fará a ponte entre os dois conjuntos de contas, gerando um novo complexo de contas de contas, que levitará entre as fileiras de contas revestidas de anticorpos. O aumento da concentração do antígeno alvo na solução gerará um número maior de complexos de contas de contas quando comparados com menores concentrações de antígeno, permitindo assim medições quantitativas do antígeno alvo. A levitação magnética é vantajosa para outros métodos devido ao seu tempo de preparação amostral reduzido e à falta de dependência dos métodos clássicos de leitura. A imagem gerada é facilmente capturada e analisada usando um microscópio padrão ou dispositivo móvel, como um smartphone ou um tablet.

Introdução

Levitação magnética é uma técnica desenvolvida para separar, analisar e identificar os tipos celulares^1,2,3, proteínas^4,5 e opioides 6 baseadas^apenas em sua densidade específica e propriedades paramagnéticas. A densidade celular é uma propriedade única e intrínseca de cada tipo celular diretamente relacionada à sua taxa metabólica e ao estado de diferenciação^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Quantificar mudanças sutis e transitórias na densidade celular durante condições de estado constante, e durante uma variedade de processos celulares, poderia permitir uma visão incomparável da fisiologia celular e da fisiopatologia. Alterações na densidade celular estão associadas à diferenciação celular^15,16, progressão do ciclo celular^9,17,18,19, apoptose^20,21,22,23, e transformação maligna^24,25,26 . Portanto, a quantificação de alterações específicas na densidade celular, pode ser usada para diferenciar entre células de diferentes tipos, bem como discriminar entre o mesmo tipo de células submetidas a vários processos de ativação. Isso permite experimentos que visam uma determinada subsumão celular, onde mudanças dinâmicas na densidade servem como um indicador do metabolismo celular alterado²⁷. Como foi estabelecido que uma célula pode alterar sua densidade em resposta a um ambiente em mudança^7,é imperativo medir a cinética da célula em relação à sua densidade para entendê-la plenamente, que os métodos atuais podem não fornecer¹². A levitação magnética, por outro lado, permite uma avaliação dinâmica das células e suas propriedades²⁸.

As células são diamagnéticas, o que significa que elas não têm um momento de dipolo magnético permanente. No entanto, quando exposto a um campo magnético externo, um momento fraco de dipolo magnético é gerado nas células, na direção oposta do campo aplicado. Assim, se as células forem suspensas em uma solução paramagnética e expostas a um forte campo magnético vertical, elas levitarão para longe da fonte magnética e pararão até uma altura, que depende principalmente de sua densidade individual. A levitação diamagnética de um objeto confinado ao mínimo de um campo magnético inhomogenous é possível quando os dois seguintes critérios são cumpridos: 1) a suscetibilidade magnética da partícula deve ser menor do que a do meio circundante, e 2) a força magnética deve ser forte o suficiente para contrabalançar a força de flutuação da partícula. Ambos os critérios podem ser preenchidos suspendendo os RBCs em um buffer magnético e criando fortes gradientes de campo magnético com ímãs permanentes pequenos, baratos e comercialmente disponíveis¹. A posição de equilíbrio de uma partícula presa magneticamente em um eixo ao longo da direção da gravidade é determinada por sua densidade (em relação à densidade do tampão), sua suscetibilidade magnética (em relação à suscetibilidade magnética do tampão) e a assinatura do campo magnético aplicado. Como a densidade e as propriedades magnéticas da solução são constantes em todo o sistema, as propriedades de densidade intrínseca das células serão o principal fator determinante da altura de levitação das células, com células mais densas levitando mais baixas em comparação com células menos densas. Esta abordagem utiliza um conjunto de duas contas de referência de densidade (1,05 e 1,2 g/mL) que nos permite usar análises precisas e racionmétricas para medições de densidade. Alterar a concentração da solução magnética permite isolar diferentes populações celulares, como RBCs de WBCs, já que a densidade das células circulantes é específica das células, removendo a necessidade de protocolos de isolamento ou outras manipulações celulares.

A maioria dos métodos de detecção usados em pesquisas de biologia dependem da extrapolação de eventos de ligação específicos em sinais lineares fáceis de quantificar. Esses métodos de leitura são muitas vezes complexos e envolvem equipamentos especializados e pessoal científico dedicado. Uma abordagem destinada à detecção de antígenos encontrados na membrana plasmática das células ou vesículas extracelulares ou que são solúveis no plasma, usando uma ou duas contas revestidas de anticorpos, está aqui descrita. As contas devem ser de densidades diferentes umas das outras e das dos alvos interrogados. A presença do antígeno alvo em qualquer biofluido é traduzida em uma mudança específica e mensurável na altura de levitação de uma célula antígeno positivo que está ligada a uma conta de detecção. No caso de antígenos solúveis ou vesículas extracelulares, eles são obrigados tanto à captura quanto à detecção de contas, formando um complexo de contas de contas em vez de complexo de células de contas. A mudança na altura da levitação depende da nova densidade dos complexos de células de contas ou contas de contas. Além da mudança na altura de levitação dos complexos, o que indica a presença de antígeno no biofluido, o número de complexos também depende da quantidade de destino, tornando a levitação magnética também uma abordagem quantitativa para detecção de antígenos²⁴.

Protocolo

O protocolo experimental utilizado neste estudo foi aprovado pelo Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configuração do instrumento

NOTA: As células levitando de imagem requer dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z para serem colocados com o mesmo polo voltados um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético e da densidade dos alvos. Neste caso, os ímãs são separados por um espaço de 1mm suficiente para a inserção de um tubo capilar de vidro quadrado de 1x1 mm de comprimento de 1x1 mm de comprimento. O dispositivo foi impresso em 3D usando um design AutoCAD, que está disponível mediante solicitação.

1. Coloque microscópio de lado, perfeitamente horizontal.
   NOTA: Um microscópio colocado em uma posição vertical padrão não é diretamente adequado para imagens levitando objetos devido às posições dos ímãs em relação ao condensador e objetivo. Essa limitação pode ser contornada colocando o microscópio de lado, perfeitamente horizontal permitindo que o condensador concentre a luz no capilar, e a lente objetiva para a imagem da célula levitando entre os ímãs, mantendo os requisitos de iluminação de Köhler.
2. Apoie e nivele o suporte em uma mesa de pão usando 2 ou 3 tomadas de laboratório.
3. Para limitar as vibrações, apoie a mesa de breadboard com pés umedecidos de borracha.
4. Remova o estágio e substitua-o por uma tomada de laboratório compacta para ajustar a altura do dispositivo de levitação(eixo y) e dois estágios translacionais de um eixo único; um para ajustar o foco(eixo z), e o segundo para a varredura do tubo capilar.
5. Conecte o dispositivo de levitação magnética à tomada de laboratório usando dois posts ópticos de mini-série.

2. Vinculação de anticorpos a micropartículas/contas carboxy (Modificadas a partir de um protocolo pela PolyAn)

NOTA: Apenas contas de baixa densidade (1,05 g/mL) precisam ser revestidas para detecção de Rh(+), mas tanto as contas de alta e baixa densidade são revestidas para a detecção de vesículas extracelulares.

1. Tire 1 mg equivalente à suspensão de contas e adicione em 0,5 mL de Buffer de Ativação (50 mM MES (MW195.2, 9,72 mgs em 1 mL)) pH 5.0 e 0,001% Polisorbate-20).
2. Adicione 12 μL de EDC recém-fabricado de 1,5 M (MW 191,7, 0,28755 g em 1 mL) e 12 μL de 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g em 1 mL) em água gelada.
3. Coloque tubos em um agitador orbital e agite vigorosamente por 1h à temperatura ambiente para ativar os grupos carboxílicos em contas.
4. Pare a ativação após 1h adicionando 0,5 mL de Tampão de Acoplamento (10x PBS, ou 0,1 M pH 7-9).
5. Pelota as contas por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos, ou, se as contas não puderem ser pelotas, use um filtro de tubo de centrífugas de 0,45 μm. Aspire o supernatante ou o fluxo.
6. Lave as contas com 1 mL de 10x PBS 3 vezes mais que na etapa 2.5.
7. Calcule 25 μg de anticorpos por mg de contas e misture o anticorpo desejado com contas ativadas a uma concentração final de anticorpos de 0,7-1,0 mg/mL em PBS 10X.
8. Coloque tubos em um roqueiro de tubo situado em baixa velocidade. Enrole os tubos suavemente à temperatura ambiente durante a noite para o acoplamento.
9. Repita o passo 2.5 e lave as contas duas vezes com 1 mL de PBS de 10x.
10. Lave com 0,5 mL de 1 M de etanolamina (98% de estoque = 16,2 M) no pH tampão 8,0 com 0,02% Polisorbate-20 para 1h à temperatura ambiente enquanto treme suavemente.
11. Repita o passo 2.5 e lave as contas uma vez em 1 mL de DPBS. As contas podem ser armazenadas em 200 μL de DPBS a 4 °C até que seja necessário.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Coleta e Preparação de Sangue para Detecção de Rh(+)

1. Usando um dispositivo de lancing de um clique, pique o dedo de um doador Rh(+) e colete 10 μL de sangue em 1 mL de DPBS.
2. Manche as células Rh+ com uma mancha de membrana de plasma fluorescente. Opcionalmente, adicione 1 μL de corante fluorescente à suspensão de 1 mL de células Rh+ (diluição de 1:1000).
3. Incubar as células com o corante fluorescente a 37 °C por 15 min.
4. Pelota as células girando a 5.600 x g para 15 s e lave 3 vezes usando 1 mL de DPBS. Resuspend em 1 mL de HBSS com cálcio e magnésio (HBSS++).
5. Usando o dispositivo de lancing de um clique, pique o dedo de um doador rh(-) e colete 2 μL de sangue.
   NOTA: Se preparar mais de 2 condições, colete sangue suficiente para adicionar 1 μL de sangue rh(-) a cada tubo.
6. Prepare os tubos experimentais necessários: Contas sozinhas, controle IgG, amostra.
   1. Contas sozinhas: adicionar 174 μL de HBSS+++, 1 μL de contas de controle IgG, 1 μL de contas de alta densidade (1,2 g/mL) e 24 μL de 500 mM Gd³⁺ (60 mM).
   2. Controle de IgG: adicionar 172 μL de HBSS+++, 1 μL de contas de controle IgG, 1 μL de contas de alta densidade, 1 μL de sangue Rh, 1 μL de suspensão sanguínea Rh+ manchada e 24 μL de 500 mM Gd³⁺.
   3. O tubo de amostra adiciona 172 μL de HBSS+++, 1 μL de contas revestidas anti-RhD, 1 μL de contas de alta densidade, 1 μL de sangue rh, 1 μL de suspensão sanguínea rh(+) manchada e 24 μL de 500 mM Gd³⁺.
      NOTA: Contas de alta densidade são adicionadas às amostras de Rh para referência.

4. Isolamento de PMNs para Demonstração de Separação celular

1. Isolamento de Neutrófilos
   1. Desenhe 40 mL de sangue venoso em uma seringa de 60 mL contendo 6 mL de citrato/ácido cítrico de sódio (0,15 M, pH 5,5) e 14 mL de 6% Dextran-70.
   2. Espere 50 min para sangue sedimentar.
   3. Coloque lentamente as células do casaco buffy em cima de 20 mL de Ficoll-Paque empurrando os 18 mL superiores através da tubulação de coleta de sangue em um tubo de 50 mL, evitando contaminação com RBCs sedimentados. Recomenda-se o uso de um conjunto de coleta de sangue fresco, para minimizar a contaminação com RBCs residuais que sobraram no tubo de coleta de sangue original.
   4. Pelota as células de casaco buffy por centrifugação por 20 min a 3.000 x g. Neutrófilos e RBCs contaminantes vão pelotar na parte inferior do tubo. O PBMC formará uma camada branca em cima do Ficoll-Paque.
   5. Transfira os neutrófilos para um novo tubo de 50 mL.
   6. Lyse quaisquer RBCs residuais incubando os neutrófilos com 20 mL de solução NaCl fria de 0,2% por 25 segundos, seguido por um adicional de 20 mL de 1,6% naCl. A concertação final de NaCl deve ser de 0,9% (isotônico).
   7. Centrifugar a suspensão por 10 min a 3.000 x g.
   8. Remova o supernatante e resuspenda os neutrófilos para a concentração desejada.
2. Isolamento de Linfócitos
   1. Emplaque os PBMCs em RPMI com 5% de soro inativado de calor em placas de cultura de 6 poços.
   2. Incubar as placas por 1h a 37 °C. Os monócitos aderirão à placa, os linfócitos estarão livremente flutuando.
   3. Remova o tampão contendo os linfócitos e lave-o duas vezes com RPMI.
   4. Resuspend os linfócitos na concentração desejada.
3. Rotular RBCs, PMN e Linfócitos.
   1. Rotule cada tipo de célula com um corante fluorescente diferente. Certifique-se de que cada corante fluoresce em um canal diferente. Siga as instruções do fabricante para cada um dos corantes escolhidos.

5. Geração de Vesículos Extracelular RBC através da Ativação Complementar

1. Obtenha sangue inteiro através da venipuntura usando tubos EDTA.
2. Passe sangue através de um filtro de glóbulos brancos, e depois centrífugas 3 vezes a 500 x g por 10 minutos cada para isolar os glóbulos vermelhos. Use o HBSS++ como tampão de lavagem.
3. Faça alíquotas de 100 RBCs embalados em 1,5 mL e compor o volume até 1 mL adicionando HBSS++.
4. Adicione C5b,6 a uma concentração final de 0,18 μg/mL no HBSS++, e depois vórtice.
5. Coloque um agitador lento à temperatura ambiente por 15 minutos.
6. Adicione proteína C7 a uma concentração final de 0,2 μg/mL. Misture invertendo o tubo suavemente algumas vezes. Não vórtice deste ponto em diante.
7. Coloque o tubo em um agitador de tubo situado em baixa velocidade por 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Adicione proteína C8 a uma concentração final de 0,2 μg/mL, e proteína C9 a 0,45 μg/mL. Misture invertendo os tubos suavemente algumas vezes.
9. Incubar a 37 °C por 30 min.
10. Centrifugar o tubo a 10.000 x g por 10 min.
11. Colete o supernante contendo EV em um novo tubo(s). Não trema muito perto da pelota celular.

6. Analisando células no dispositivo de levitação magnética

1. Execute a inicialização do instrumento de acordo com as instruções do fabricante.
2. Carregue 50 μL de amostra em um tubo capilar até que o tubo esteja cheio. Sele as extremidades do tubo capilar com selante capilar certificando-se de que não há bolhas de ar presentes.
3. Coloque o tubo capilar no suporte entre os ímãs superior e inferior. Ajuste o estágio e o foco para uma visualização ideal.
   NOTA: As células/contas podem levar de 5 a 20 minutos para alcançar sua posição de equilíbrio magnético com base em sua densidade e na concentração de Gd³⁺. Quanto maior a concentração de Gd^3+,menor o tempo.

Resultados

A levitação magnética concentra objetos de diferentes densidades em diferentes alturas de levitação, dependendo da densidade do objeto, sua assinatura magnética, a concentração de solução paramagnética e a força do campo magnético criado por dois ímãs fortes e de terras raras. À medida que os dois ímãs são colocados em cima um do outro, as amostras levitando só podem ser vistas, mantendo a iluminação de Köhler, usando um microscópio virado de lado(Figura 1). A altura ...

Discussão

Centrifugação gradiente é atualmente a técnica padrão para isolar componentes subcelulares com base em suas densidades únicas. Essa abordagem, no entanto, requer o uso de meios de gradientes especializados, bem como equipamentos de centrífuga. A abordagem de levitação magnética aqui apresentada permite uma investigação detalhada das propriedades morfológicas e funcionais das células circulantes, com mínimo, se alguma manipulação das células, proporcionando um acesso quase in vivo às células c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube